Medição da capacidade de efluxo de colesterol in vitro de soro ou plasma em modelos de celular de macrófagos é uma ferramenta promissora como um biomarcador para a aterosclerose. No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de efluxo de colesterol NBD fluorescente e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.
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Artigo de método
Ensaio de efluxo de colesterol Nitrobenzoxadiazole-etiquetadas do elevado-throughput
Neste artigo
Resumo
Resumo
Aterosclerose leva a doenças cardiovasculares (DCV). Ainda não está claro se a concentração de colesterol-HDL (cHDL) desempenha um papel causal no desenvolvimento de aterosclerose. No entanto, um fator importante nas fases iniciais da formação da placa de ateroma é a capacidade de efluxo de colesterol HDL (a capacidade de partículas de HDL de colesterol de macrófagos de aceitar) para evitar a formação de células de espuma. Este é um passo chave para evitar o acúmulo de colesterol no endotélio e uma parte do transporte reverso de colesterol (RCT) para eliminar o colesterol através do fígado. Capacidade de efluxo de colesterol de soro ou plasma em modelos de celular macrófago é uma ferramenta promissora que pode ser usada como um biomarcador para a aterosclerose. Tradicionalmente, [3H]-colesterol tem sido usado em ensaios de efluxo de colesterol. Neste estudo, pretendemos desenvolver uma estratégia mais segura e mais rápida usando fluorescente rotulados-colesterol (colesterol-NBD) em um ensaio de celular para rastrear o processo de absorção e efluxo de colesterol em macrófagos THP-1-derivado. Finalmente, podemos otimizar e padronizar o método de efluxo de colesterol NBD e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.
Introdução
De acordo com a Organização Mundial de saúde, principais causas de morte no mundo atuais são doenças isquêmicas do coração e acidente vascular cerebral (contabilizando um total de 15,2 milhões de mortes)1. Ambas são doenças cardiovasculares (DCV) que podem ser precedidas por aterosclerose e a ruptura de placas de ateroma nos vasos sanguíneos2,3.
A aterosclerose é uma doença inflamatória vaso parede em que as células T, macrófagos, mastócitos e células dendríticas infiltrar o endotélio em acumulam de sangue, eventualmente formando placas ateroscleróticas. Ater....
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Protocolo
Para este estudo, obtiveram aprovação do Comité de ética (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona; número de aprovação HCB/2014/0756) e o consentimento informado por escrito, de todas as disciplinas.
1. preparação NBD-colesterol
- Dissolva o NBD-colesterol (494.63 MW; ver Tabela de materiais) em etanol puro para obter o estoque (2 mM). Para um frasco de 10 mg, dissolva o conteúdo do frasco inteiro em um volume de 10,1 mL de etanol para obter um estoque de 2 mM.
- Diluir o NBD-colesterol do estoque em RPMI 1640 suplementado com 10% fetal bovino soro e 5% penicilina/estreptomicina (R10 m....
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Resultados
O objectivo do ensaio de efluxo do colesterol é determinar em vitro, a capacidade de efluxo de colesterol de um determinado soro, plasma ou sobrenadante contendo partículas de HDL. O método consiste em carregar rotulados de colesterol em uma cultura de uma linhagem de células de macrófagos padrão e induzindo o contato com a amostra de ensaio diluída em media FBS-free com as células. Finalmente, os níveis fluorescentes do NBD são medidos na mídia e lisado celular. Para otimizar as medições, o effluxed de colesterol das cé.......
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Discussão
Colesterol com rótulo fluorescente é uma estratégia promissora para analisar e investigar as propriedades e o metabolismo do colesterol natural in vitro. Suas principais vantagens são que ele pode ser absorvido por células, permite para intracelular e estudos de distribuição de membrana e pode ser aplicado a ensaios de efluxo colesterol como no presente protocolo (Figura 7). Alguns esteróis fluorescente-rotulados permitam colesterol rastreamento in-vitro incluindo BODIPY-colesterol, colester.......
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Divulgações
Os autores desejam declarar que eles são os inventores do pedido de patente (EPO; 18382337.6-1118; 17 de maio de 2018) intitulado "Método para a determinação de efluxo de colesterol" baseia-se este método.
Agradecimentos
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela pesquisa concede FIS (PS12/00866) do Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espanha; Fondo Europeo el de pará Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-relíquia (RD16/0025/0002) e programa de CERCA / Generalitat de Catalunya. Os autores graças a Retrovirology e o laboratório de Imunopatologia Viral do d'Investigacions Institut Biomèdiques agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Agradecemos T. Escribà, c. Rovira e Hurtado C. por sua assistência e S. Cufí do escritório de transferência de tecnologia e conhecimento para sua orientação em proteger a invenção.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Placa coletora de 96 poços | Corning Inc | Costar 3912 | placa branca de 96 poços com fundo opaco transparente |
| Placa de cultura de 96 poços | Corning Inc | Costar 3610 | placa branca de 96 poços com fundo plano transparente |
| Kit de ensaio de efluxo de colesterol (baseado em células) | Abcam | ab196985 | kit de ensaio baseado em células comercial de alto rendimento com o objetivo de determinar o efluxo de colesterol |
| incolor RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R7509 | RPMI 1640 sem software de análise de dados Gen5 pehnol-red |
| BioTek | Versão 2.0 | ||
| Glicina | Sigma-Aldrich | G8790-100G | Glicina, uso não animal |
| Luminômetro | Biotek | SYNERGY HT | Multi-Detection Microplate Reader |
| Lysis Solution 1 | tampão Tris interno | de 50 mM, NaCl 150 mM e solução de lise de H2O | |
| 2 | solução interna | etanol puro e lise celular 1:1 (v:v) | |
| NBD-colesterol | Thermo-Fisher | N1148 | 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3β-ol |
| PBS | Sigma-Aldrich | P3813 | tamponado com fosfato solução salina |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 202452-250G | polietilenoglicol |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | Phorbol 12-merystate B-acetato. |
| R10 | RPMI | 1640 interno suplementado com 10% de soro fetal bovino e 5% de penicilina/estreptomicina. | |
| RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | RPMI 1640 com 2 mM L-glutamina contendo 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glicose |
| THP-1 células | Sigma-Aldrich | ATCC, linha semelhante a monócitos #TIB-202 | derivada de leucemia de um bebê de um ano de idade |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1754 |
Referências
- The top 10 causes of death. , Available from: http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2018).
- Hansson, G. K., Hermansson, A. The immune system in atherosclerosis. Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).
- Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K.
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Reimpressões e permissões
