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Artigo de método

Ensaio de efluxo de colesterol Nitrobenzoxadiazole-etiquetadas do elevado-throughput

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DOI:

10.3791/58891

⸱

7 de janeiro de 2019

 ,  , 
1Group of Genomics and Pharmacogenomics in HIV, Laboratory of Retrovirology and Viral Immunopathogenesis, IDIBAPS, Hospital Clínic de Barcelona

Neste artigo

Resumo

Medição da capacidade de efluxo de colesterol in vitro de soro ou plasma em modelos de celular de macrófagos é uma ferramenta promissora como um biomarcador para a aterosclerose. No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de efluxo de colesterol NBD fluorescente e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.

Resumo

Aterosclerose leva a doenças cardiovasculares (DCV). Ainda não está claro se a concentração de colesterol-HDL (cHDL) desempenha um papel causal no desenvolvimento de aterosclerose. No entanto, um fator importante nas fases iniciais da formação da placa de ateroma é a capacidade de efluxo de colesterol HDL (a capacidade de partículas de HDL de colesterol de macrófagos de aceitar) para evitar a formação de células de espuma. Este é um passo chave para evitar o acúmulo de colesterol no endotélio e uma parte do transporte reverso de colesterol (RCT) para eliminar o colesterol através do fígado. Capacidade de efluxo de colesterol de soro ou plasma em modelos de celular macrófago é uma ferramenta promissora que pode ser usada como um biomarcador para a aterosclerose. Tradicionalmente, [3H]-colesterol tem sido usado em ensaios de efluxo de colesterol. Neste estudo, pretendemos desenvolver uma estratégia mais segura e mais rápida usando fluorescente rotulados-colesterol (colesterol-NBD) em um ensaio de celular para rastrear o processo de absorção e efluxo de colesterol em macrófagos THP-1-derivado. Finalmente, podemos otimizar e padronizar o método de efluxo de colesterol NBD e desenvolver uma análise do elevado-throughput usando placas de 96 poços.

Introdução

De acordo com a Organização Mundial de saúde, principais causas de morte no mundo atuais são doenças isquêmicas do coração e acidente vascular cerebral (contabilizando um total de 15,2 milhões de mortes)1. Ambas são doenças cardiovasculares (DCV) que podem ser precedidas por aterosclerose e a ruptura de placas de ateroma nos vasos sanguíneos2,3.

A aterosclerose é uma doença inflamatória vaso parede em que as células T, macrófagos, mastócitos e células dendríticas infiltrar o endotélio em acumulam de sangue, eventualmente formando placas ateroscleróticas. Ateroma apresenta um lipido cristais de colesterol e núcleo, evidenciados por medições de ultra-sonografia de alta resolução B-modo da carótida íntima mídia espessura4,5. Em macrófagos, efluxo de colesterol para partículas de lipídios aceitador é realizado por meio de receptores ATP-binding cassette (ABC) ABCA1, membro do ATP subfamília G 1 (ABCG1) e o receptor ao tesouro SR-BI. O desequilíbrio do colesterol influxo e efluxo em macrófagos é considerado um processo chave na aterosclerose iniciação6. Efluxo de colesterol é considerado um passo fundamental na eliminação de colesterol dos tecidos periféricos para o plasma e fígado em um processo chamado transporte reverso de colesterol (RCT). Colesterol é transferida de macrófagos principalmente para Apolipoproteína A1 (ApoA1) encontrados na superfície das partículas de lipoproteína de alta densidade (HDL). HDLs então transportam de colesterol para o fígado para excreção e reutilização de8,7,9.

Tradicionalmente, o colesterol de rádio-rotulados de trítio (3H) tem sido usado no efluxo de colesterol10. O sinal de emissão de radioisótopos é altamente sensível,10; no entanto, colesterol marcado apresenta limitações óbvias, tais como protocolos longos, risco de exposição a radiações ionizantes e a necessidade especial de radioactividade instalações e equipamentos garantir a manipulação segura de emissão radioactiva. Pelo contrário, fluorescência tenha sido incorporada com sucesso em técnicas de diagnóstico, devido à sua simplicidade na detecção do sinal fluorescente, a grande variedade de fluorophores disponível e sua segurança11. Vários esteróis com rótulo fluorescentes têm sido usados para estudar o metabolismo do colesterol incluindo dehydroergosterol (com fluorescência intrínseca), dansyl colesterol, 4,4-diflúor-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - colesterol e 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-YL)amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-ol (NBD-colesterol). Particularmente, NBD-colesterol apresenta uma absorção eficiente em células humanas12. Dois diferentes NBD rotulados-colesterol estão atualmente disponíveis: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) e 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; A Figura 1). Colesterol rotulado com moiety 22-NBD pode melhor se adequar estudos de efluxo de colesterol, enquanto 25-NBD-colesterol é usado principalmente na membrana celular dinâmica pesquisa13,14.

Linhas de células normalmente utilizadas em ensaios de efluxo de colesterol in vitro são monócitos células como as células THP-1 derivado de leucemia humanas, murino Raw 264.7 células15ou J774.1. Todas essas células podem ser diferenciadas em macrófagos em vitro usando phorbol myristate 12 13-acetato (PMA), mas THP 1-derivado de macrófagos (dmTHP-1) melhores refletem e imitam os macrófagos humanos16.

No presente estudo, podemos otimizar e padronizar um método de alta produtividade fluorescente para determinar a capacidade de efluxo do colesterol das amostras de soro na dmTHP-1, usando 22-NBD-colesterol como uma alternativa para [3H]-colesterol. Além disso, comparamos a técnica fluorescente otimizada com o padrão analógico radioativo.

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Protocolo

Para este estudo, obtiveram aprovação do Comité de ética (Comitè Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcelona; número de aprovação HCB/2014/0756) e o consentimento informado por escrito, de todas as disciplinas.

1. preparação NBD-colesterol

  1. Dissolva o NBD-colesterol (494.63 MW; ver Tabela de materiais) em etanol puro para obter o estoque (2 mM). Para um frasco de 10 mg, dissolva o conteúdo do frasco inteiro em um volume de 10,1 mL de etanol para obter um estoque de 2 mM.
  2. Diluir o NBD-colesterol do estoque em RPMI 1640 suplementado com 10% fetal bovino soro e 5% penicilina/estreptomicina (R10 médio) para atingir uma concentração final de 5 μM (por exemplo,, obter 10 mL de NBD-colesterol na concentração final de 5 μM) por diluir 25 μL de estoque NBD-colesterol (2 mM) no meio de R10. Este volume é suficiente para uma placa de 96 poços.

2. celular cultura e semeadura (dia-2)

  1. Células de cultura THP-1 no meio de R10 a 37 ° C, 5% de CO2. Ajuste a 0.3 x 106 células/mL em 3 dias.
  2. Sementes das células em uma placa de 96 poços branca com um fundo liso, claro a 0,2 x 106 células/bem no meio de R10 (100 μL por poço).
  3. Tratar as células com 100 nM phorbol myristate 12 13-acetato (PMA; de um estoque de 10 μM) para 48-72 h, incubar a 37 ° C, 5% de CO2 para diferenciar THP-1 pilhas para dmTHP-1.
    Nota: Recomenda-se usar 5 μL de estoque PMA (10 μM) em 500 µ l de meio de R10. Antes disso, preparar um 10 μM estoque PMA dissolvendo-se um frasco de liofilizado 1G em 10 mL de Dimetilsulfóxido (DMSO), alíquota e estoque a-20 ° C.
  4. Como alternativa (sugestão) combinar etapas 2.2 e 2.3 para melhor homogeneização. Prepare-se 10 mL de células THP-1 em um tubo de 15 mL, adicionar 200 μL de estoque PMA (10 μM), misture delicadamente e imediatamente semente 100 μL por poço na chapa. Incube as células conforme descrito na etapa 2.3.

3. Apolipoprotein B empobrecido preparação de soro (sorte) (dia 2 ou 3)

  1. Para preparar uma solução de polietilenoglicol (PEG), diluir glicina em PBS 10% (com estéril H2O) a uma concentração de 200 mM em pH 7,4. Adicionar 40 mL de glicina de 200 mM a 10 g de 8000 PEG PEG de obter 20% (p/v). Misture a solução vigorosamente para homogeneizar.
  2. Aplicar 4 peças de 20% PEG por 10 partes de cada amostra de soro/plasma em um tubo de 1,5 mL de soro/plasma e deixe a mistura no gelo para 25 min17 (por exemplo, para 100 μL de plasma ou soro, adicionar 40 μL de 20% PEG solução).
  3. Centrifugar o precipitado de PEG-apolipoproteína B a 13.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
  4. Descarte o precipitado. Transferi o sobrenadante para um tubo novo.
    Nota: Sugerimos preparar a sorte no dia 3 (fresco). Se não for possível, preparar a sorte no dia 2 e mantê-lo em 4 ° C durante a noite.

4. NBD-colesterol celular carregamento (dia 2)

  1. Descartar o meio de cultura da dmTHP-1 e lavar as células duas vezes com 1x tampão fosfato salino (PBS).
  2. Carregar as pilhas com 5 μM NBD-colesterol (100 μL por poço) no meio de R10 e incubar durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.

5. incubação com colesterol aceitadores (dia 3)

  1. Descartar o meio e lavar as células duas vezes com PBS.
  2. Incube as celulas com sorte de 2 – 5% ou a concentração desejada de aceitador de lipídios purificado (HDL ApoA, ApoE, etc.) diluído em incolor meio RPMI 1640 (100 μL por poço) para 4-6 h a 37 ° C.
    Nota: Inclua um controle negativo (C-) consistindo de incolor meio RPMI 1640 sem aceitadores e um controlo positivo (C +) (por exemplo, a sorte de um pool de doadores saudáveis) ou HDLs purificadas. Nota que o controlo positivo aplica-se especialmente quando as amostras dos pacientes (condições de doença) são analisados (complementar a Figura 1).
  3. Prepare um estoque de 200 mL da solução de lise de célula 1 (tampão de Tris 50 mM, 150 mM de NaCl, H2O). Misture a proporção de 1 uma solução a 1:1 (v: v) lise celular com etanol puro para obter a solução de Lise 2.

6. captura de sinal fluorescente (dia 3)

  1. Deteção de mídia NBD-colesterol
    1. Retire o meio celular as chapas e recolhê-la em uma nova placa de 96 poços branca com um fundo plano opaco.
    2. Para uma detecção do sinal de fluorescência ideal nas amostras de mídia, adicione 100 μL de etanol puro a 100 μL de cada amostra média para obter uma proporção de 1:1 em placa de 96 poços branca.
    3. Manter a placa com os meios de comunicação tratados à medida adicional a intensidade de fluorescência (FI) em um comprimento de onda de 463⁄536 nm (excitação/emissão) no luminómetro.
  2. Deteção de NBD-colesterol intracelular
    1. Lave as células duas vezes com PBS.
    2. Para obter o colesterol intracelular, lisar as células incubando-os com 100 μL de solução de Lise 2 por bem e agitar a placa na temperatura de quarto (RT) para 25 min.
    3. Para uma detecção do sinal de fluorescência ideal nas amostras lisado celular, capturar a intensidade de fluorescência dos lisados celulares na mesma branco placa de 96 poços, com clara plana inferior (o mesmo prato em que as células foram semeadas no passo 2.2).
  3. 6.3 medir a intensidade de fluorescência (FI) no luminómetro enquanto ajusta o parâmetro de sensibilidade para 50 no software (consulte a Tabela de materiais).

7. resultados análise

  1. Expressa a taxa de efluxo de colesterol de uma amostra em percentagem calculada pela fórmula:
    figure-protocol-1
  2. Obter a medida final do efluxo de colesterol (CE) subtraindo o CE do controlo negativo (amostra NBD-colesterol mas incubadas com incolor meio RPMI 1640, sem aceitadores de colesterol) do CE de um dado amostras:
    figure-protocol-2

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Resultados

O objectivo do ensaio de efluxo do colesterol é determinar em vitro, a capacidade de efluxo de colesterol de um determinado soro, plasma ou sobrenadante contendo partículas de HDL. O método consiste em carregar rotulados de colesterol em uma cultura de uma linhagem de células de macrófagos padrão e induzindo o contato com a amostra de ensaio diluída em media FBS-free com as células. Finalmente, os níveis fluorescentes do NBD são medidos na mídia e lisado celular. Para otimizar as medições, o effluxed de colesterol das cé...

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Discussão

Colesterol com rótulo fluorescente é uma estratégia promissora para analisar e investigar as propriedades e o metabolismo do colesterol natural in vitro. Suas principais vantagens são que ele pode ser absorvido por células, permite para intracelular e estudos de distribuição de membrana e pode ser aplicado a ensaios de efluxo colesterol como no presente protocolo (Figura 7). Alguns esteróis fluorescente-rotulados permitam colesterol rastreamento in-vitro incluindo BODIPY-colesterol, colester...

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Divulgações

Os autores desejam declarar que eles são os inventores do pedido de patente (EPO; 18382337.6-1118; 17 de maio de 2018) intitulado "Método para a determinação de efluxo de colesterol" baseia-se este método.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pela pesquisa concede FIS (PS12/00866) do Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Espanha; Fondo Europeo el de pará Desarrollo Regional (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-relíquia (RD16/0025/0002) e programa de CERCA / Generalitat de Catalunya. Os autores graças a Retrovirology e o laboratório de Imunopatologia Viral do d'Investigacions Institut Biomèdiques agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Agradecemos T. Escribà, c. Rovira e Hurtado C. por sua assistência e S. Cufí do escritório de transferência de tecnologia e conhecimento para sua orientação em proteger a invenção.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa coletora de 96 poçosCorning IncCostar 3912placa branca de 96 poços com fundo opaco transparente
Placa de cultura de 96 poçosCorning IncCostar 3610placa branca de 96 poços com fundo plano transparente
Kit de ensaio de efluxo de colesterol (baseado em células)Abcamab196985kit de ensaio baseado em células comercial de alto rendimento com o objetivo de determinar o efluxo de colesterol
incolor RPMI 1640Sigma-AldrichR7509RPMI 1640 sem software de análise de dados Gen5 pehnol-red
BioTekVersão 2.0
GlicinaSigma-AldrichG8790-100GGlicina, uso não animal
LuminômetroBiotekSYNERGY HTMulti-Detection Microplate Reader
Lysis Solution 1tampão Tris internode 50 mM, NaCl 150 mM e solução de lise de H2O
2solução internaetanol puro e lise celular 1:1 (v:v)
NBD-colesterolThermo-FisherN114822-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3β-ol
PBSSigma-AldrichP3813tamponado com fosfato  solução salina
PEG 8000Sigma-Aldrich202452-250Gpolietilenoglicol
PMASigma-Aldrich79346Phorbol 12-merystate B-acetato.
R10RPMI1640 interno suplementado com 10% de soro fetal bovino e 5% de penicilina/estreptomicina.
RPMI 1640Sigma-AldrichR8758RPMI 1640 com 2 mM L-glutamina contendo 1,5 g/L de bicarbonato de sódio e 4,5 g/L de glicose
THP-1 célulasSigma-AldrichATCC, linha semelhante a monócitos #TIB-202derivada de leucemia de um bebê de um ano de idade
Tween 80Sigma-AldrichP1754
de

Referências

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