Artigo de método

Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

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DOI:

10.3791/58896

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21 de fevereiro de 2019

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences & the Astbury Centre for Structural Molecular Biology, University of Leeds, 2Department of Chemistry and Nano-Science Center, University of Copenhagen

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo3 como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.

Resumo

Bombeamento de prótons enzimas de elétron transferir reações de redox de duas cadeias de translocação de prótons através da membrana, criando uma força motriz protónica usada para a produção de ATP. A natureza anfifílica das proteínas de membrana requer especial atenção ao seu manuseamento e reconstituição no ambiente natural de lipídios é indispensável ao estudar os processos de transporte da membrana como translocação de prótons. Aqui, detalhamos um método que foi usado para a investigação do mecanismo de bombeamento de prótons de enzimas redox de membrana, tomando citocromo bo3 de Escherichia coli , por exemplo. Uma combinação de eletroquímica, microscopia de fluorescência é usada para controlar o estado de redox das quinona monitor e piscina pH mudanças no lúmen. Devido a resolução espacial de microscopia fluorescente, centenas de lipossomas podem ser medidas simultaneamente enquanto o conteúdo de enzima pode ser escalado para baixo para uma única enzima ou transportador por lipossomas. A análise dos respectivos única enzima pode revelar padrões na dinâmica funcional da enzima que pode ser oculto pelo comportamento de toda a população. Nós incluímos uma descrição de um script para análise automatizada de imagem.

Introdução

Informação sobre a cinética e mecanismos de enzima é normalmente obtida a nível ensemble ou macroescala com população de enzima em milhares de milhões de moléculas, onde as medições representam uma média estatística. Sabe-se, entretanto, que macromoléculas complexas tais como enzimas podem demonstrar a heterogeneidade em seu comportamento e mecanismos moleculares observados no nível de conjunto não são necessariamente válidos para cada molécula. Tais desvios na escala de molécula individual foram extensivamente confirmados por estudos de enzimas único com uma variedade de métodos emergentes durante as últimas duas décadas1. Notavelmente, deteção de fluorescência da atividade de cada enzima tem sido usada para investigar a heterogeneidade das enzimas atividade2,3 ou descobrir o efeito de memória so-called (períodos de atividade de enzimas alta sucedido por períodos de baixa atividade e vice-versa)4,5.

Muitos estudos única enzima exigem que as enzimas são imobilizadas na superfície ou espacialmente fixo em outra maneira de manter-se suficientemente longo no campo de visão para observação contínua. Encapsulamento de enzima em lipossomas foi mostrado para habilitar a imobilização da enzima, evitando qualquer impacto negativo devido a superfície-enzima ou proteína-proteína interações6,7. Além disso, os lipossomas oferecem uma possibilidade única de estudar proteínas de membrana única em sua natural lipídios BICAMADA ambiente8,9,10.

Uma classe de proteínas de membrana, transportadores, exerce uma translocação direcional de substâncias através da membrana celular, um comportamento que pode ser estudado somente quando as proteínas são reconstituídas para o lipid bilayers (por exemplo, os lipossomas)11, 12,13. Por exemplo, translocação de protões, exibida por várias enzimas das cadeias de transporte electrónico de procariontes e eucariontes, desempenha um papel importante na respiração celular através da criação de uma força motriz protónica usada para a síntese de ATP. Neste caso, o próton atividade de bombeamento é acoplado à transferência de elétrons, embora o mecanismo detalhado deste processo muitas vezes continua elusivo.

Recentemente, temos demonstrado a possibilidade de detecção fluorescente de casal com eletroquímica para estudar próton bombeamento a atividade das enzimas única da terminal ubiquinol oxidase de Escherichia coli (citocromo bo3) reconstituído em lipossomas14. Isto foi conseguido através do encapsulamento de um corante fluorescente-membrana impermeável de sensíveis ao pH no lúmen de lipossomas preparados a partir de E. coli lipídios polares (figura 1A). A quantidade de proteína foi otimizada, assim que a maioria dos lipossomas também continham nenhuma ou apenas uma molécula de enzima reconstituído (de acordo com a distribuição de Poisson). Os dois substratos do citocromo bo3 foram fornecidos pela adição de ubiquinona à mistura lipídica que formou os lipossomas e oxigênio (ambiente) em solução. Os lipossomas são, então, escassamente adsorvidos em um eletrodo de ouro ultra-suave semi transparente, coberto com uma monocamada auto montada de 6-mercaptohexanol. Finalmente, o eletrodo é montado na parte inferior de uma célula de spectroelectrochemical simples (figura 1B). Controle eletroquímica do estado redox quinona piscina permite flexìvel acionar ou parar a reação enzimática, a qualquer momento, enquanto a tintura sensíveis ao pH é usada para monitorar as alterações de pH dentro do lúmen dos lipossomas como resultado da translocação de protões pelo enzimas. Usando que a intensidade de fluorescência de uma segunda, lipid-limite tintura fluorescente, o tamanho e volume de lipossomas individuais pode ser determinada e, portanto, a quantificação do próton enzima atividade de bombeamento. Usando esta técnica, nomeadamente encontramos que moléculas de citocromo bo3 são capazes de entrar em um estado de fuga espontânea que dissipa-se rapidamente a força motriz protónica. O objetivo deste artigo é apresentar a técnica de medições em lipossomas único em detalhe.

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Protocolo

1. preparação de uma mistura de lipídeos/UQ-10/FDLL

Nota: E. coli lipídios usados para a preparação dos lipossomas devem ser aliquotadas e cuidadosamente misturada com ubiquinona-10 (substrato) e long-comprimento de onda fluorescentes tingir-etiquetados lipídios (para determinação de tamanho de lipossomas) antes do reconstituição.

  1. Utilizando uma seringa de vidro, 200 µ l de transferência de estoque de clorofórmio de lipídios polares extrair de Escherichia coli (25 mg/mL) em frascos de vidro tornar-se alíquotas de 5 mg.
  2. Adicionar 50 µ l de 1 mg/mL ubiquinona-10 (UQ-10; em clorofórmio) para os lipídios tornar a relação final de UQ-10: 1: 100 de lipídios (1% w/w).
  3. Adicione 20 µ l de 1 mg/mL (0,4% w/w) de um comprimento de onda longo fluorescente tingir-etiquetados lipídico (FDLL) para a mistura de lipídeos/UQ-10.
  4. Homogeneizar a solução de clorofórmio por curto num Vortex e evaporar a maioria de clorofórmio sob um fluxo suave de nitrogênio ou argônio. Remova os traços de clorofórmio inteiramente por mais evaporação sob vácuo durante pelo menos 1 h.
    Nota: Alíquotas de lipídios podem ser armazenadas sob atmosfera inerte a-20 ° C, durante vários meses.

2. reconstituição de citocromo bo3

Nota: Para a purificação do citocromo bo3 de e. coli, segui o protocolo de Rumbley et al. 15 para assegurar o elevado grau de pureza das amostras de enzima nativamente-dobrado, adicionar cromatografia de exclusão-tamanho após a etapa de purificação de afinidade descrita por Rumbley et al . 15

  1. Adicione 312,5 µ l de 40mm MOPS-KOH/60 mM K24, pH 7,4, a uma alíquota de lipídios/UQ-10/FDLL seco misture (5 mg, passo 1.4) e misturar com vortex até o filme lipídico é totalmente resuspended, seguido por 2 min de tratamento em um banho ultra-sônico.
  2. Adicione 125 µ l de ácido de 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic de 25 mM (HPTS), uma tintura fluorescente sensíveis ao pH que precisa ser encapsulado dentro de lipossomas.
  3. Adicione 137.5 µ l de surfactante de (OGP) 250 mM n-octil-β-D-glucopiranósido, misturar usando o vórtice e proceda à sonicação em um banho ultra-sônico para 10 min garantir que todos os lipídios são solubilizados em micelas de surfactante. Transferi a dispersão em um tubo de plástico de 1,5 mL.
    Nota: Suspensão turva de lipídeos deve tornar-se transparente após a solubilização com surfactante.
  4. Adicione a quantidade necessária de citocromo bo3 (veja a nota abaixo) e adicionar água ultrapura para fazer um volume total de 50 µ l (solução de bo3 citocromo mais água). Incube a 4 ° C por 10 min em um misturador de rolos.
    Nota: Valor típico para condições única enzima é 0,1 – 0,2% (w/w de proteína-para-lipídico, i. e. 5 a 10 µ g de proteína), embora isso pode ser aumentado até 1-2% (50 a 100 µ g de proteína), se o objetivo é observar somente a atividade eletroquímica (veja abaixo). Como um controle negativo, podem ser preparados lipossomas sem citocromo bo3 .
  5. Pesar 2 x 50 mg e 2 x 100 mg de poliestireno microbeads tampas quatro 1.5 mL-tubo e feche com a película de parafina para impedir a secagem.
    Nota: Antes de utilizar, poliestireno microbeads devem ser lavados com água, metanol e armazenado em água de acordo com o manual do fabricante.
    Nota: Se for usada uma mistura de água/Microconta, poliestireno microbeads pode convenientemente ser transferido para a tampa com uma micropipeta com uma ponta larga. Água pode então ser retirada o microbeads utilizando uma micropipeta com uma ponta fina.
  6. Adicione o 1st50 mg de poliestireno microbeads a mistura de reconstituição (passo 2.4), colocando a tampa com poliestireno microbeads sobre o tubo de 1,5 mL-plástico com dispersão e realizando uma rotação curta para um par de segundos. Incube a 4 ° C, em um misturador de rolos para poliestireno microbeads adsorver o surfactante por 30 min.
    1. Repita as adições de poliestireno microbeads e incubação do como segue: Adicionar 50 mg de microbeads para 60 minutos de incubação; Adicione 100 mg de microbeads para 60 minutos de incubação; e adicione 100 mg de microbeads para 120 min de incubação.
      Nota: A solução acima o assentamento microbeads girará translúcida durante a etapa de 2.6 como proteoliposomes são formados.
  7. Separe a solução de proteoliposome o poliestireno microbeads utilizando uma micropipeta com uma ponta fina. Diluir a dispersão em 90 mL de 20mm MOPS-KOH/30 mM K2então4, pH 7,4 (tampão MOPS) e transferência em um tubo de se Ti45.
  8. Se a dispersão usando tipo 45 Ti rotor a 125.000 x g (em rmáx) por 1h para o proteoliposomes de Pelotas.
    Nota: Tubos de centrífuga de menor podem ser usados, embora a diluição em volume de buffer grande ajuda a reduzir a concentração da HPTS não-encapsulado na suspensão de final.
  9. Desprezar o sobrenadante, enxágue as pelotas com 20mm MOPS-KOH/30 mM K2para4, pH 7,4 tampão (sem resuspending a pelota). Após descartar o buffer de enxaguamento, re-suspenda o proteoliposomes em 500 µ l de tampão MOPS pipetando-lo e para trás com micropipeta de ponta fina. Em seguida, transfira para um tubo de plástico de 1,5 mL.
  10. Centrifugar a suspensão por 5 min a 12.000 x g para remover os detritos. Transferi o sobrenadante (reconstituído proteoliposomes) para um tubo novo.
  11. Armazenar a dispersão proteoliposomes reconstituído a 4 ° C durante a noite e usar dentro de 2 dias.

3. fabricação de eletrodos de ouro semitransparentes

Nota: A superfície lisa do ouro é obtida por um método de descascamento de modelo de 30 nm de espessura camada de ouro de 99,99% de uma bolacha de silicone suave atomicamente. A pequena espessura da camada de ouro é importante, uma vez que deve ser semi transparente para permitir a observação da fluorescência. Detalhes de ouro da evaporação (deposição de vapor físico, PVD) pode ser encontrar em outro lugar16 e modelo único-descascamento é coberto aqui. Alternativamente, ultra-suave fichas de ouro podem ser compradas em outro lugar (ver a Tabela de materiais).

  1. Cola até 9 vidro lamínulas (0,17 mm de espessura) sobre a superfície de ouro evaporada usando bi-componente epóxi de baixa-fluorescência. Cure a cola a 80 ° C, durante 4 h.
  2. Antes de modificação com um monolayer Self montado (etapa 4), retire as lamínulas de vidro partir os wafers de silício com uma lâmina. Devido a magreza das lamínulas, tome cuidado ao retirar as lamínulas para não rachar ou quebrar as lâminas de vidro.

4. modificação da superfície de ouro com self-Assembled Monolayer (SAM)

  1. Prepare-se 5 mL da solução de água de 1 mM 6-mercaptohexanol (6MH).
  2. Mergulhe 6MH solução recentemente desanexadas revestido de ouro lamínulas (passo 3.1) e deixar a 20-25 ° C durante a noite (> 16 h) para formar o SAM.
    Nota: Soluções de tiol tem um cheiro desagradável, então de um recipiente fechado deve ser usado quando a incubar a lamela revestido de ouro.
  3. No dia seguinte, retirar a lamínula revestido de ouro da solução 6MH, lavar rapidamente com água ou metanol e, em seguida, com isopropanol. Seco, sob um fluxo de gás suave.

5. eletroquímica testes de atividade Proteoliposomes

Nota: A atividade eletroquímica da enzima é verificada primeiro em uma camada de lipossomas estreitamente agrupadas (passo 5) e coberturas de vesículas menores são usadas em vesículas único experimento para medir as mudanças de pH no lúmen dos lipossomas (etapa 6).

  1. Montar a lamínula revestido de ouro em uma célula eletroquímica-spectro (ver Figura 1). Fazer contato com o ouro com um fio liso fora de uma área definida por uma-Ring de borracha.
  2. Adicionar 2 mL de solução-tampão de eletrólito e colocar a referência e eletrodos auxiliares na célula.
    Nota: Como discutido na seção de discussão, eletrodos de referências sem cloreto de são preferidos para evitar a formação de Au (I) Cl durante eletroquímica. Aqui, um Hg/Hg2SO4 (sáb. K2SO4) eletrodo de referência é usado e potenciais são dadas contra eletrodo padrão de hidrogênio (que) com 0,658 V vs para o de Hg/Hg2SO4 (sáb. K2então4).
  3. Execute a espectroscopia de impedância eletroquímica (0,1 Hz-100 kHz) em potencial de (OCP) potencial de célula aberta para avaliar a qualidade do SAM. Converter valores de impedância de entrada e dividir por 2πω para traçar um plano Cole-Cole, onde ω é a frequência (consulte as seguintes referências16,17,18 para obter detalhes sobre conversão e interpretação de impedância espectros).
    Nota: SAMs compactos e densos de 6MH devem dar um fim a trama de Cole-Cole semicírculo e dar valores de capacitância na faixa de 2.5-3.0 µF/cm2 (Figura 2A). Se o desvio significativo da forma de semi círculo ou valores fora do intervalo de capacitância é obtido, mude o eletrodo.
  4. Correr em branco voltammograms cíclica (CVs) com varredura taxas 100 e 10 mV/s na região potencial-0.3 – 0,8 V. Um CV típico é mostrado na (Figura 2B, linha tracejada).
    Nota: Isto deve demonstrar comportamento capacitivo quase puro e uma ausência de corrente faradaic significativa, mesmo sob condições de oxigênio ambiente como usado aqui.
  5. Adicionar proteoliposomes (concentração de lipídios final de 0,5 mg/mL, 1-2% (w/w) relação do citocromo bo3 lipídios) para a célula eletroquímica e misture levemente com uma pipeta. Espere até que a adsorção de proteoliposomes na superfície do eletrodo é terminado (30-60 min à temperatura ambiente).
    Nota: Voltammograms cíclica (CVs) a 10 mV/s pode ser executado durante a adsorção de proteoliposomes para acompanhar o processo. A adsorção é concluída quando o CVs consecutivos para de mudar. Informações sobre técnicas de CV podem ser encontradas nos seguintes livros. 19 , 20
  6. Lavar a célula alterando a solução-tampão de pelo menos 10 vezes, mas Evite deixar a superfície do eletrodo completamente seco.
  7. Executar a espectroscopia de impedância eletroquímica da OCP (Figura 2A, linha azul) para confirmar que o SAM sobre o eletrodo de ouro permanece inalterado e CVs com varredura taxas 10 e 100 mV/s para observar a oxidação catalítica ubiquinol (e redução do oxigênio) pelo citocromo Bo 3 em potenciais de início de redução eletroquímica quinona sobre 0 V vs) (Figura 2B).

6. detecção de próton enzimática de bombeamento por microscopia de fluorescência

  1. Modifica o eletrodo de ouro como no passo 5, mas usando 100 x menos proteoliposomes em relação ao passo 5.5 (ou seja, 5 µ g/mL). Para estudos de enzima única, reduzir o citocromo bo3 a proporção de lipídios para 0,1-0,2% (w/w).
    Nota: Lipossomas escassamente irão adsorver na superfície do eletrodo permitindo única vesícula monitoramento por microscopia de fluorescência. Sob essas condições de single-enzima, a quantidade de enzima imobilizada na superfície do eletrodo é insuficiente para a observação de uma corrente catalítica.
  2. Coloque a célula eletroquímica sobre o objetivo do óleo (60 X) de um microscópio de fluorescência invertido com uma gota de óleo de imersão. Usando filtros adequados para fluorescência FDLL, concentre-se na superfície do eletrodo. Os lipossomas único devem aparecer como pontos brilhantes no limite de difração do microscópio/objectivo. Criar a imagem de fluorescência FDLL.
  3. Alternar para um dos conjuntos de filtros de fluorescência HPTS no microscópio para verificar se a fluorescência HPTS é claramente visível e distinguível do fundo (na época de exposição escolhido, consulte a etapa 6.4). Se não for o caso, aumente a intensidade da luz.
  4. Programar o software microscópio para realizar uma aquisição de imagem cronometrado pela alternância de dois conjuntos de filtros HPTS (menu de aplicações | Define/Run ND aquisição). Defina o atraso entre aquisições de imagem no mínimo. Neste experimento, use uma 1 exposição s e atraso de s 0.3 (devido ao movimento de torre).
    Nota: A relação entre as intensidades de fluorescência nestes dois canais será convertida mais tarde ao pH dentro os lipossomas em cada ponto de tempo. A duração da aquisição pode variar de acordo com a taxa de mudança de pH esperado; 5 min é usado neste artigo.
  5. Ajuste as configurações do potentiostat para alterar o potencial durante a aquisição de imagem. Por exemplo, neste experimento, use a seguinte sequência: 0 – 60 s: sem potencial aplicado (ou seja, OCP); 60-s: 180-0.2 V (vs); 180-300 s: 0.4 V (vs). Neste caso, apenas o potencial aplicado na segunda fase (-0.2 V vs) é suficiente para eficientemente reduzir o pool de quinona.
  6. Execute simultaneamente a aquisição de imagens temporizada (microscópio) e a sequência de potencial (potentiostat) iniciando manualmente as duas medições ao mesmo tempo.
    Nota: O experimento pode ser repetido no mesmo eletrodo vários tempo movendo-se a fase de microscópio para uma área diferente na superfície. O atraso entre as aquisições deve ser pelo menos 5-10 min para garantir o equilíbrio de pH completa de lipossomas na superfície. Diferentes durações e potenciais padrões podem ser aplicados dependendo da necessidade, embora o tempo de imagem é limitada devido à fotobranqueamento de HPTS durante a aquisição.

7. análise de imagens de fluorescência

Nota: Um experimento típico produz um conjunto de imagens com um passo de tempo (por exemplo, 2.6 s) para cada um dos dois canais, ou seja, (duração * 2 / 2.6) imagens. Um exemplo de tal imagem definida gravado durante uma experiência única enzima pode ser acessado através do repositório de pesquisa dados Leeds21. Um tratamento de imagem consiste em vários passos usando Fiji (ImageJ) e análise matemática de alto nível, programação de software de linguagem (doravante referido como o software de criação de scripts, consulte Tabela de materiais para obter detalhes).

  1. Use Fiji para separar arquivo de lapso de tempo, alinhar imagens e salve como canais separados e prazos.
    1. Arquivo de lapso de tempo aberto usando o importador Bioformats fornecido dentro Fiji (comando macro: executar ("Bio-formatos importador")).
    2. Usar o plugin StackReg para alinhar cada quadro ao primeiro para contabilizar os movimentos possíveis do palco ou deriva térmica ocorreu durante a aquisição (comando macro: executar ("StackReg", "transformação = tradução")).
    3. Salve arquivos de imagem descompactada separados para cada canal e cada passo de tempo no formato TIFF em uma única pasta.
    4. Extrair os carimbos de hora exata para cada quadro dos metadados de arquivos de lapso de tempo e salvá-los como um arquivo CSV na mesma pasta das imagens. Alternativamente, usando o software de aquisição de carimbos de hora de extrair e salvar manualmente para um arquivo CSV usando um software de planilha.
      Nota: A pasta com imagens e carimbos de hora agora está pronta para ser analisados pelo software do script. 7.1.1 de passos. -7.1.4. podem ser automatizados usando um script de Fiji (um script escrito em Python para processamento em lote de arquivos de lapso de tempo é fornecido, usar "Ctrl-Shift-N" (no Windows) e, em seguida, arquivo | Abrir para carregar o script).
  2. Use script software para processamento automatizado das imagens. Carregar o código fornecido para o software e clique em Executar para final. Quando solicitado, selecione a pasta que contém as imagens do passo 7.1.
    Nota: Um script para análise é fornecido como script de mlx-formato ao vivo, com comentários extensos, identificar único lipossomas, encaixá-los para função 2D-Gaussian, filtrá-los e quantificar os valores de pH em cada ponto do tempo. As seguintes subetapas são executadas automaticamente pelo script.
    1. Carrega todas as imagens de prazos para uma única experiência na memória.
    2. Média de todas as imagens para um único canal (selecione o canal com a mais alta intensidade de fluorescência) e usar a imagem em média para identificar todos os máximos que podem corresponder do único lipossomas.
    3. Ajuste os máximos identificados na imagem em média para o 2D-Gaussian funcionam e salvar o resultado ajustar parâmetros para cada lipossoma (ver Figura 4A por exemplo lipossoma equipada).
    4. Filtre os máximos segundo os critérios de lipossomas único esperados, como tamanho, circularidade e intensidade. Rejeitar os lipossomas que estão mal equipados devido ao baixo sinal-ruído, estreitamente vizinhas em lipossomas ou ser demasiado perto da borda da imagem.
    5. Carregar carimbos de hora de arquivo externo e encaixar cada lipossoma filtrada à função em cada imagem de tempo de 2D-gaussian separadamente.
      Nota: O uso de programação paralela e com vários núcleos da CPU pode aumentar consideravelmente a velocidade de cálculo nesta fase.
    6. Filtre os lipossomas novamente de acordo com os critérios semelhantes como na etapa 7.2.4 mas aplicada a cada período de tempo.
    7. Em cada passo de tempo, defina a relação de intensidade de fluorescência de um lipossoma como a razão de volumes delimitada pela função de 2D-Gaussian cabida em dois canais. Calcule os valores de pH a partir da razão de intensidades, determinado a partir dos dois canais HPTS e usando uma curva de calibração (passo 8). Traçar curvas de pH-tempo resultantes para os lipossomas e observar o seu pH mudar quando o potencial é aplicado.

8. realização de uma curva de calibração da fluorescência HPTS

Nota: Para converter a proporção de fluorescência HPTS para um pH intravesicular, uma curva de calibração deve primeiro estabelecer que levaria em conta condições particulares de experiências como transmitância ouro, filtros de qualidade, etc. Esta etapa tem que ser executado apenas uma vez ou duas vezes e os dados de calibração podem ser usados, desde as instalação e medição de parâmetros permanecem os mesmos na etapa 6.

  1. Prepare um eletrodo com lipossomas escassamente adsorvidos (sem citocromo bo3 conforme descrito nas etapas 5 e 6.1).
  2. Adicione 2 µ l da solução de gramicidin de 0,1 mg/mL em etanol a 2 mL de tampão para criar a concentração de 100 ng/mL.
  3. Capture duas imagens de fluorescência para os dois canais HPTS.
  4. Alterar o pH da célula pela adição de pequenas alíquotas de 1m HCl ou 1 M H2então4. Medir o pH do buffer com um medidor de pH padrão e capturar duas imagens de fluorescência para os dois canais HPTS.
  5. Repita as etapas de 8.4 para a faixa de pH 6-9.
  6. Usando o algoritmo de 7.2, caber, filtrar e calcular a taxa média de fluorescência HPTS de lipossomas individuais em cada pH. Assuma a relação HPTS média todos os lipossomas.
  7. Ajuste da dependência do pH-relação resultante para a seguinte equação:
    figure-protocol-1, onde pKum, Ra e Rbestão cabendo parâmetros.
  8. Use pKum, Ra e Rbpara converter a proporção HPTS de lipossomas individuais na etapa 7.2.7. para valores de pH.

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Resultados

A qualidade do ouro-modificado lamínula (eletrodo) com uma SAM de 6MH é verificada antes de cada experimento com espectroscopia de impedância eletroquímica. Figura 2A mostra representativas parcelas de Cole-Cole medidas usando espectroscopia de impedância eletroquímica, antes e depois de lipossomas são adsorvidos. Se a qualidade do SAM é suficiente, espectroscopia de impedância deve demonstrar um comportamento capacitivo quase puro, resultando em uma trama do...

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Discussão

O método descrito é adequado para estudar o próton bombeamento por proteínas de membrana respiratória que podem ser reconstituídas em lipossomas e são capaz de trocar elétrons com o pool de quinona. Atividade de bombeamento de prótons podem ser monitorado no nível do single-enzima usando corantes sensíveis ao pH (ratiometric) encapsulados no lúmen do lipossoma (figura 1A).

O método baseia-se na capacidade de ubiquinona (ou outras quinonas), incorporada a bicamada ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores reconhecem o BBSRC (BB/P005454/1), apoio financeiro. NH foi financiado pelo programa VILLUM Foundation Young Investigator.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
6-Mercapto-1-hexanol (6MH)Sigma45108897%
Ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfónico (HPTS)BioChemika56360
Suporte de alumínio (célula eletroquímica)Feito à30x30x7 mm; diâmetro interno: 26 mm; diâmetro do furo: 15 mm
Eléctrodofio de platina
ClorofórmioVWR Produtos químicos83627
E.coli lipídios polaresAvanti100600C25 mg/mL em clorofórmio
EpóxiEPO-TEK301-2FLepóxi de baixa fluorescência
Fiji (ImageJ 1.52d)Plugins necessários: StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Cubo de filtro ("ATTO633")Chroma Technology CorporationEx: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Cubo de filtro ("HPTS1")Chroma Technology CorporationEx: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Cubo de filtro ("HPTS2")Chroma Technology CorporationEx: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Cubo de filtro ("Texas Red")Chroma Technology CorporationEx: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Lipídios marcados com corante fluorescente (FDLL)ThermoFisher ScientificT1395MPTexasRed-DHPC foi usado neste trabalho (λ exc 595 nm; λ em 615 nm)
Lipídios marcados com corante fluorescente (FDLL) (alternativa)ATTO-TECAD 633-161ATTO633-DOPE pode ser usado como alternativa (λ exc 630 nm; λ em 651 nm)
Coluna de filtração de gelGE Healthcare28-9893-33HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, para purificação adicional de proteínas
Lamínulas de vidroVWR International631-0172No 1.5
Seringa de vidroHamilton1725 RNR250 µ L
Frascos de vidroScientific Glass Laboratories LtdT101 / V11,75 mL de capacidade
GoldGoodFellow99,99%
GramacidinSigmaG5002
Eletrodo de referência de sulfato de mercúrioRadiômetro (Hash)E21M012
MicrocentrífugaEppendorfMinispin NL040
MicroscópioNikonEclipse Ti
Microscópio CâmeraAndorZyla 5.5 sCMOS
Microscópio LâmpadaNikonIntensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2NikonMicroscópio software de aquisição
n-Octil β-D-glucopyranosideMelford LaboratoriesB2007
Nova 1.10MetrohmSoftware de controle de potenciostato
ObjetivoNikonPlan Apo λ óleo
OriginPro 2017OriginLabSoftware de plotagem
O-ring (célula eletroquímica)OrinokoDiâmetro interno: 16 mm; seção transversal: 1,5 mm
Tubos de plásticoEppendorf3810X1,5 mL
Microesferas de poliestirenoBio-RAD152-3920Biobeads, malha 20-50
PotenciostatoMetrohm AutolabPGSTAT 128N
PotenciostatoCH InstrumentosCHI604C
Software de scriptMatlabR2017aCaixas de ferramentas necessárias: 'Caixa de ferramentas de processamento de imagem', 'Caixa de ferramentas de computação paralela', 'Caixa de ferramentas de ajuste de curva', 'Caixa de ferramentas de identificação do sistema', 'Caixa de ferramentas de otimização'Bolachas
de silícioIDB Technologies LTDSi-C2 (N< 100>P)Ø 25 mm, 525 um de espessura
Célula de Teflon (Célula eletroquímica)Feito sob medidaDiâmetro externo: 26 mm; diâmetro interno: 13,5 mm
Superfícies de ouro ultra-planas despojadas de hastesPlatypus TechnologiesAU.1000.SWTSGSuperfícies alternativas de ouro ultra-planas prontas para uso (Espessura abaixo de 100 nm sob demanda)
Pontas finas de micropipetaSarstedt70.1190.100ou pontas de gelloader semelhantes 200 µ L
Ubiquinona-10SigmaC-9538
UltracentrífugaBeckman-CoulterL-80XPcom rotor Ti 45
Banho ultrassônicoFisher ScientificFB15063
medida auxiliar 60x/1.4

Referências

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