Medições de lipossoma único para o estudo das enzimas de membrana de bombeamento de prótons usando microscopia fluorescente e eletroquímica

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para estudar o mecanismo molecular de translocação de prótons através das membranas lipídicas de lipossomas único, usando citocromo bo₃ como exemplo. Combinando a eletroquímica e microscopia de fluorescência, mudanças de pH no lúmen do única vesículas, contendo uma única ou várias enzimas, podem ser detectados e analisados individualmente.

Abstract

Bombeamento de prótons enzimas de elétron transferir reações de redox de duas cadeias de translocação de prótons através da membrana, criando uma força motriz protónica usada para a produção de ATP. A natureza anfifílica das proteínas de membrana requer especial atenção ao seu manuseamento e reconstituição no ambiente natural de lipídios é indispensável ao estudar os processos de transporte da membrana como translocação de prótons. Aqui, detalhamos um método que foi usado para a investigação do mecanismo de bombeamento de prótons de enzimas redox de membrana, tomando citocromo bo₃ de Escherichia coli , por exemplo. Uma combinação de eletroquímica, microscopia de fluorescência é usada para controlar o estado de redox das quinona monitor e piscina pH mudanças no lúmen. Devido a resolução espacial de microscopia fluorescente, centenas de lipossomas podem ser medidas simultaneamente enquanto o conteúdo de enzima pode ser escalado para baixo para uma única enzima ou transportador por lipossomas. A análise dos respectivos única enzima pode revelar padrões na dinâmica funcional da enzima que pode ser oculto pelo comportamento de toda a população. Nós incluímos uma descrição de um script para análise automatizada de imagem.

Introduction

Informação sobre a cinética e mecanismos de enzima é normalmente obtida a nível ensemble ou macroescala com população de enzima em milhares de milhões de moléculas, onde as medições representam uma média estatística. Sabe-se, entretanto, que macromoléculas complexas tais como enzimas podem demonstrar a heterogeneidade em seu comportamento e mecanismos moleculares observados no nível de conjunto não são necessariamente válidos para cada molécula. Tais desvios na escala de molécula individual foram extensivamente confirmados por estudos de enzimas único com uma variedade de métodos emergentes durante as últimas duas décadas¹. Notavelmente, deteçã....

Protocol

1. preparação de uma mistura de lipídeos/UQ-10/FDLL

Nota: E. coli lipídios usados para a preparação dos lipossomas devem ser aliquotadas e cuidadosamente misturada com ubiquinona-10 (substrato) e long-comprimento de onda fluorescentes tingir-etiquetados lipídios (para determinação de tamanho de lipossomas) antes do reconstituição.

1. Utilizando uma seringa de vidro, 200 µ l de transferência de estoque de clorofórmio de lipídios polares extrair de Escherichia coli (25 mg/mL) em frascos de vidro tornar-se alíquotas de 5 mg.
2. Adicionar 50 µ l de 1 mg/mL ubiquinona-10 (UQ-10; em clorofórmio) para os li....

Results

A qualidade do ouro-modificado lamínula (eletrodo) com uma SAM de 6MH é verificada antes de cada experimento com espectroscopia de impedância eletroquímica. Figura 2A mostra representativas parcelas de Cole-Cole medidas usando espectroscopia de impedância eletroquímica, antes e depois de lipossomas são adsorvidos. Se a qualidade do SAM é suficiente, espectroscopia de impedância deve demonstrar um comportamento capacitivo quase puro, resultando em uma trama do.......

Discussion

O método descrito é adequado para estudar o próton bombeamento por proteínas de membrana respiratória que podem ser reconstituídas em lipossomas e são capaz de trocar elétrons com o pool de quinona. Atividade de bombeamento de prótons podem ser monitorado no nível do single-enzima usando corantes sensíveis ao pH (ratiometric) encapsulados no lúmen do lipossoma (figura 1A).

O método baseia-se na capacidade de ubiquinona (ou outras quinonas), incorporada a bicamada .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-Mercapto-1-hexanol (6MH)	Sigma	451088	97%
Ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trissulfónico (HPTS)	BioChemika	56360
Suporte de alumínio (célula eletroquímica)	Feito à		30x30x7 mm; diâmetro interno: 26 mm; diâmetro do furo: 15 mm
Eléctrodo			fio de platina
Clorofórmio	VWR Produtos químicos	83627
E.coli lipídios polares	Avanti	100600C	25 mg/mL em clorofórmio
Epóxi	EPO-TEK	301-2FL	epóxi de baixa fluorescência
Fiji (ImageJ 1.52d)			Plugins necessários: StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Cubo de filtro ("ATTO633")	Chroma Technology Corporation		Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Cubo de filtro ("HPTS1")	Chroma Technology Corporation		Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Cubo de filtro ("HPTS2")	Chroma Technology Corporation		Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Cubo de filtro ("Texas Red")	Chroma Technology Corporation		Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Lipídios marcados com corante fluorescente (FDLL)	ThermoFisher Scientific	T1395MP	TexasRed-DHPC foi usado neste trabalho (λ exc 595 nm; λ em 615 nm)
Lipídios marcados com corante fluorescente (FDLL) (alternativa)	ATTO-TEC	AD 633-161	ATTO633-DOPE pode ser usado como alternativa (λ exc 630 nm; λ em 651 nm)
Coluna de filtração de gel	GE Healthcare	28-9893-33	HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, para purificação adicional de proteínas
Lamínulas de vidro	VWR International	631-0172	No 1.5
Seringa de vidro	Hamilton	1725 RNR	250 µ L
Frascos de vidro	Scientific Glass Laboratories Ltd	T101 / V1	1,75 mL de capacidade
Gold	GoodFellow		99,99%
Gramacidin	Sigma	G5002
Eletrodo de referência de sulfato de mercúrio	Radiômetro (Hash)	E21M012
Microcentrífuga	Eppendorf	Minispin NL040
Microscópio	Nikon	Eclipse Ti
Microscópio Câmera	Andor	Zyla 5.5 sCMOS
Microscópio Lâmpada	Nikon	Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2	Nikon		Microscópio software de aquisição
n-Octil β-D-glucopyranoside	Melford Laboratories	B2007
Nova 1.10	Metrohm		Software de controle de potenciostato
Objetivo	Nikon	Plan Apo λ óleo
OriginPro 2017	OriginLab		Software de plotagem
O-ring (célula eletroquímica)	Orinoko		Diâmetro interno: 16 mm; seção transversal: 1,5 mm
Tubos de plástico	Eppendorf	3810X	1,5 mL
Microesferas de poliestireno	Bio-RAD	152-3920	Biobeads, malha 20-50
Potenciostato	Metrohm Autolab	PGSTAT 128N
Potenciostato	CH Instrumentos	CHI604C
Software de script	Matlab	R2017a	Caixas de ferramentas necessárias: 'Caixa de ferramentas de processamento de imagem', 'Caixa de ferramentas de computação paralela', 'Caixa de ferramentas de ajuste de curva', 'Caixa de ferramentas de identificação do sistema', 'Caixa de ferramentas de otimização'Bolachas
de silício	IDB Technologies LTD	Si-C2 (N< 100>P)	Ø 25 mm, 525 um de espessura
Célula de Teflon (Célula eletroquímica)	Feito sob medida		Diâmetro externo: 26 mm; diâmetro interno: 13,5 mm
Superfícies de ouro ultra-planas despojadas de hastes	Platypus Technologies	AU.1000.SWTSG	Superfícies alternativas de ouro ultra-planas prontas para uso (Espessura abaixo de 100 nm sob demanda)
Pontas finas de micropipeta	Sarstedt	70.1190.100	ou pontas de gelloader semelhantes 200 µ L
Ubiquinona-10	Sigma	C-9538
Ultracentrífuga	Beckman-Coulter	L-80XP	com rotor Ti 45
Banho ultrassônico	Fisher Scientific	FB15063