Transplante de ilhotas intra-Omental usando h-Omental enchimento Matrix ilhéu (hOMING)

Terapia celular é um tema quente, como pretende curar doenças baseadas na medicina regenerativa. Terapias celulares assistida por material biológico têm sido cada vez mais estudadas nos últimos anos, especialmente porque a implantação de célula muitas vezes requer um portador para a transferência de células do prato de cultura para o destinatário. Biomaterial andaimes são portadores de célula potencialmente valiosa que cumprir várias funções¹. Uma transportadora competente deve proteger células de tensões mecânicas e proporcionar condições de crescimento favoráveis, tais como fatores de crescimento essenciais, excreção de resíduos metabólica, troca de substâncias nutrientes e oxigênio².

Entre os diferentes tipos de biomateriais utilizados em terapia celular, hidrogel tem muitas vantagens. Eles são biocompatíveis, biodegradável, fáceis de manusear e facilitar a difusão de oxigênio³. Além disso, a tecnologia atual permite o uso de hidrogel para ajudar a sobreviver e engraft com, por exemplo, a suplementação com fatores de crescimento ou de proteínas de matriz extracelular⁴células.

Transportadoras de hidrogel contendo células-tronco podem ser injetadas como tratamentos, , por exemplo, osso regeneração⁵ e sistema nervoso doença⁶. É necessária a implantação de células metabolicamente ativas. Enquanto in vitro validação da abordagem é possível, ferramentas e técnicas para validação em vivo permanecem para ser refinado.

Transplante de célula e hidrogel pode facilmente ser realizado por via subcutânea quando são realizados testes de biocompatibilidade. No entanto, quando transplantadas células estão destinadas a regular a fatores sistêmicos por sua ação metabólica, esta localização subcutânea não é ideal, essencialmente em termos de drenagem venosa⁷. Portanto, não há nenhuma ferramenta atual com segurança, rapidez e eficiência, avaliar os efeitos benéficos de um hidrogel. Com base no exemplo do transplante de ilhotas, que exige que os hormônios ser liberado na corrente sanguínea do enxerto em resposta aos níveis de glicose no sangue, nós desenvolvemos um novo método para implantação de célula/hidrogel in vivo.

O primeiro passo foi identificar um site de transplante de aceitador, que pode aceitar um hidrogel com células. O omento oferece um grande espaço para implantação, é altamente plástico e sua densa vascularização combinada com a configuração intraperitoneal é interessante para o estudo de células com alta atividade metabólica⁸. Em seguida precisamos estabelecer uma técnica cirúrgica que permite a transferência de células e o hidrogel para o omento. Inspirado pelo lipofilling usado em cirurgia plástica⁹, desenvolvemos o ilhéu de matriz h-Omental (localizador) abordagem de enchimento. Incorporado em hidrogel de ilhotas são injetadas dentro do tecido omental. A técnica também objetivou fornecer máxima enxertia, utilizando vários depoimentos da mistura celular e hidrogel no tecido omental, onde o grande número de vasos sanguíneos também melhora a oxigenação do enxerto.

No presente estudo, descrevemos uma técnica simples e inovadora para implantação da ilhota entre folhas omental, dentro do tecido adiposo mais próximo para os vasos sanguíneos. Constituído por microinvasiva, que poderia ser cumprido ao abrigo de laparoscopia, com a injeção de ilhotas contidas em um hidrogel no tecido gordo. Esta técnica é facilmente aplicável a todas as combinações de hidrogel e células que precisam ser testados em um em um ambiente funcional metabolicamente.

Todas as experiências em animais foram realizadas de acordo com as diretrizes do National Institutes of Health, com o número de autorização: AL/60/67/02/13.

1. preparação destinatário

1. Quimicamente, induzi diabetes em ratos do destinatários.
   1. Injete 75 mg/kg de estreptozotocina (STZ, em tampão de citrato estéril 0,1 M, pH 4) intraperitonealmente para ratos¹⁰.
      Nota: Para os estudos de transplante, foram utilizados 6 semanas Lewis estirpe ratos, pesando 150-190 g.
   2. Verificar o status de diabetes por medições diárias de glicose de sangue durante os primeiros quatro dias. Injetar insulina de ação prolongada 6 U/dia por via subcutânea, quando ratos apresentam glicemia ao longo de 2 g/L, para prevenir complicações do diabetes e perda de peso, até a implantação da pelota de insulina.
   3. Incluem ratos na coorte, quando são duas medidas de glicose no sangue veia cauda > 4-5 g/L por 2 dias consecutivos e o nível de peptídeo-C é < 200 pM. Medir a glicemia usando um glicosímetro e C-peptidemia por um ensaio imunoenzimático (ELISA).
   4. Implante de pelotas de insulina sob a pele (ver 1.2).
      Nota: Terapia de insulina crônica permite melhor regulação da glicemia e evita complicações do diabético (que exacerbam o stress oxidativo no local do transplante)¹¹. Além disso, a terapia conserva o estado diabético juntamente com uma curva de crescimento normal (sem perda de peso habitual, observada em um animal diabético). Isso pode resultar em uma almofada de gordura omental maior, que é ideal para a realização de transplante.
2. Implantação de insulina pelotas
   1. Anestesiar o rato usando anestesia de gás (3% de isoflurano em 500 mL/min O₂) e coloque o rato em posição de bruços.
   2. Verificar o status de anestesia, verificando a ausência de reflexo (pata beliscar). Limpe o pescoço usando iodopovidona e raspar a região usando uma lâmina de barbear. Aplicar iodopovidona novamente e deixe por 3 min.
   3. Pelotas de insulina lugar 1.5 (3 unidades (U) / rato 200g) em uma solução de iodo povidona diluído 1:5 para esterilizar as pelotas. Perfurar a pele do pescoço usando um trocarte de 16 G e inserir a pelota usando o guia de decoração e estilete. Recuperar o guia e o estilete e costurar um único ponto. Use iodopovidona para limpar o ponto.
      Nota: Nenhuma dor pós-cirúrgica foi necessário à medida que a intervenção era comparável a uma única subcutânea (SC).
   4. Deixe o rato recuperar da anestesia e certifique-se de que ratos têm acesso aos alimentos para evitar a hipoglicemia.
   5. Medir a eficiência da pelota medindo-se diminuição da glicémia após a implantação.
   6. Verificar a eficiência da pelota, monitorando o nível de glicemia toda semana por 1 mês.
   7. Incluem ratos na coorte, quando uma medida de cauda veia C peptídeo no sangue é mantida abaixo dos 200 pM 1 mês após a implantação da pelota de insulina.
      Nota: Verificar os níveis de peptídeo-C é obrigatório para avaliar os animais na linha de base antes do transplante e confirmar seu estado diabético. Regeneração de peptídeo-C baixa sempre ocorre durante o seguimento. O C-peptidemia mais baixo é indicativo da regeneração mais baixa.

2. orientação: Matrix Intra-omental ilhéu de enchimento

1. Preparação de mistura do Ilhéu-matriz.
   1. Prepare a transportadora ilhéu viscoso numa vizinhança de fluxo laminar. Dissolva o pó de alginato em PBS estéril na concentração de 1,5%. Esterilize a preparação por passagem através de um filtro de 0,22 µm. Prepare 400 µ l por beneficiário.
      Nota: Pode ser usado qualquer tipo de hidrogel com uma viscosidade adequada para a injeção com uma agulha 21G.
   2. Isole o ilhéu de saudáveis ratos Lewis (200-250 g) como descrito anteriormente,¹².
   3. Contar número de Ilhéu em equivalentes de ilhéu (IEQ) (uma IEQ é considerado equivalente a uma ilhota pancreática com um diâmetro de 150 µm)¹³.
   4. Em uma capa de fluxo laminar, prepare alíquotas de 7660-ilhéu equivalente (IEQ) em um tubo de 1,5 mL.
   5. Lave alíquotas de ilhotas com 500 µ l de meio CMRL (Connaught Medical Research Laboratories) livre de soro fetal bovino.
   6. Ilhotas de pelotas por centrifugação (min 2 500 x g e 4 ° C). Desprezar o sobrenadante.
   7. Adicionar 150 µ l de transportadora de hidrogel de alginato sobre os ilhéus, misturar cuidadosamente pipetando para cima e para baixo e coloque a mistura sobre o gelo.
   8. Prepare uma agulha 21G de atraumática e uma seringa de 1 mL sem volume morto carregando 150 µ l de alginato vazio para a seringa.
   9. Encha a seringa com a mistura de Ilhéus e alginato (150 µ l, o volume total 300 µ l). Manter a seringa no gelo.
2. Procedimento cirúrgico
   1. Esterilizar instrumentos cirúrgicos usando esterilização a frio (2% Steranios por 20 min).
   2. Anestesiar o rato usando anestesia isoflurano e coloque o rato em posição de bruços.
   3. Raspar a região do pescoço usando uma lâmina de barbear e esterilizar a área com iodopovidona. Deixe o iodo descansar por 3 min.
   4. Fazer uma incisão com um bisturi e remover as pelotas de 1,5 insulina usando fórceps. Feche a pele usando um ou dois pontos de ponto único. Não remova o rato da anestesia.
      Nota: Depois de 1 mês, o sedimento pode ser friável como algum tecido fibrótico pode embrulhar como pelotas; Use uma tesoura para dissecá-lo corretamente.
   5. Coloque o rato em posição supina. Fazer a barba e esterilizar (com iodopovidona) área peritoneal. Deixe o iodo descansar por 3 min.
   6. Crie uma laparotomia de 1,5 cm logo abaixo do esterno, usando um bisturi. Coloque gaze estéril molhado ao redor da área de incisão.
   7. Identifica o omento é a almofada de gordura localizada ao lado do estômago. Use pinças para pegar o omento com cuidado, retire-a delicadamente a cavidade peritoneal e espalhá-lo sobre a gaze.
      Nota: O tecido omental estende-se do baço duodeno e anexa no seu ponto médio para o estômago. O omento normal de ratos diabéticos recebendo terapia de insulina é de aproximadamente 2 cm ² quando se espalharam sobre a gaze.
   8. Hidrate o tecido omental bem usando 2 mL de solução salina estéril previamente aquecido a 37 ° C. Use pequenas pinças curvas para manipular o tecido e penetrar a borda omental com a agulha entre as camadas omental. Insira a agulha inteiramente.
   9. Iniciar a injeção da preparação Ilhéu lentamente e com cuidado de mover a agulha para trás para injetar as ilhotas em vários lugares (como linhas). Antes de retirar a agulha, certifique-se de que o hidrogel parou de sair com a agulha para evitar a perda de ilhotas dispersas.
   10. Repita esta manipulação, conforme necessário para injetar todo o conteúdo da seringa usando pontos de entrada diferentes para distribuir as ilhotas em todo o tecido omental.
       Nota: Em ratos, quatro ou cinco injeções são geralmente necessários.
   11. Verifique ilhotas não estão em cluster na seringa na extremidade das injeções.
       Nota: Se algumas ilhotas são ainda visíveis, é possível retirar a agulha da seringa, encha a seringa diretamente com 100 µ l de hidrogel vazio e reconectar a agulha. Uma segunda rodada de injeção pode ser feita para expulsar os ilhéus restantes.
   12. Use soro fisiológico esterilizado novamente para hidratar o tecido omental e a parede da laparotomia. Use fórceps para substituir cuidadosamente omento na cavidade abdominal.
   13. Injete 2 mL de solução salina estéril pré-aquecido na cavidade abdominal para Re-hidratar o rato.
   14. Feche a parede muscular usando uma sutura contínua do segmento. Em seguida, costure a camada cutânea com ponto único ponto (ponto-a-ponto).
   15. Injete meloxicam (1,5 mg/kg) por via subcutânea como um analgésico por 5 dias uma vez por dia.
   16. Coloque o rato em uma gaiola em uma almofada de aquecimento até à recuperação da anestesia. Repita o procedimento para todos os ratos do destinatários.
   17. Medir a glicose no sangue após transplante todos os dias. Se glicemia for > 2 g/L, injetar 6 U de insulina de ação prolongada por via subcutânea uma vez ao dia.
   18. Avalie a função do enxerto por glicemia e c-peptidemia de monitoramento mais 1 ou 2 meses.
       Nota: Em casos de transplante bem sucedido, glicemia deve estabilizar dentro de 2-5 dias após o transplante, e ratos podem ser retirados de insulina.

3. omental enxerto explantação

Nota: Este procedimento permitirá a confirmação da função do enxerto boa. Após a recuperação de um enxerto funcional, ratos devem retornar a um estado diabético. Esta etapa é executada após 1 ou 2 meses de follow-up metabólica.

1. Anestesiar o rato com anestesia de gás e colocá-lo na posição supina.
2. Raspar a região peritoneal e esterilizar com iodopovidona por 3 min.
3. Crie uma laparotomia de 1,5 cm logo abaixo do esterno, usando um bisturi. Coloque gaze estéril molhado ao redor da área de incisão.
4. Identifica o omento, que fica ao lado do estômago. Use fórceps para espalhá-lo cuidadosamente sobre a gaze.
5. Use uma tesoura para excisar o omento. Começar a partir da parte que adere sobre a cauda do pâncreas (ao lado do baço). Se o sangramento ocorre, use gaze estéril seca para detê-lo.
6. Continuar a excisão ao longo da parte anexada ao estômago e recuperar o omento.
   Nota: Neste local, artérias gastroepiploica (Figura 1) podem causar uma grande quantidade de sangramento se acidentalmente são cortadas. Artéria incisões são inevitáveis para recuperar o enxerto, mas o sangramento pode ser gerenciado usando a pinça e gaze. Se acontecer um corte acidental, comprimir firmemente com uma gaze seca e manter a compressão pelo menos 1 min. O sangramento deve parar. Se não, use grampos ou usar um bisturi elétrico para cauterizar os vasos.

Figura 1: distribuição da artéria Omental. Para explantação de enxerto do omento, a área crítica, composta por artérias gastroepiploica é representada em azul. Durante a ressecção desta parte do tecido omental, atenção deve estar a ser pago para a seção de artéria gastroepiploica direita. Compressão, ligadura ou cauterização pode ser usada para limitar a sangrar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

7. Verifica se algum sangramento persiste. Se não, Injete 2 mL de soro pré-aquecido, fechar o rato e processar como descrito anteriormente.
    Animais explantados retornam a um estado diabético. Injeção de insulina (6 U/SC/dia) Então é obrigatória para garantir o bem-estar dos animais.
8. Eutanásia o rato em 10 a 12 dias após explantação usando uma overdose de pentobarbital (182,2 mg/kg).

4. histológica análise: Hematoxilina e eosina coloração

1. Corrigir o omenta obtida usando paraformaldeído 4% (PFA) e incorporar em parafina.
2. Cortar seções 4 µm de espessura e aplique a mancha de hematoxilina e eosina para avaliação morfológica do transplante.

5. análise estatística

1. Determine a significância estatística usando software de análise estatística e análise de medidas repetidas de variância (ANOVA) com teste de diferença de Tukey significado honesto como um teste post hoc. Representam valores de p como: *p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001.

O método de localização permite evitar a implantação intravascular e o confinamento de ilhotas em um órgão. Um tempo máximo de 8-10 min é necessário para o procedimento de implantação de toda ilha, incluindo anestesia, que uma linha do tempo comparável ao clássico transplante hepático.

Para estudar a maneira de Ilhéus são distribuídos dentro do tecido omental, grânulos de dextrano foram transplantados usando o método de sinalização (Figura 2). Um dia após o implante, ratos foram sacrificados e omental tecidos foram recuperados para análise histológica. Hematoxilina e eosina coloração revelaram uma distribuição uniforme dos grânulos em todo o tecido (Figura 2o canto inferior direito). Muito frequentemente, grânulos aproximaram-se os vasos sanguíneos e foram bem implantados no tecido gordo. Imediatamente após o implante, reação inflamatória ocorre ao redor os grânulos, resultando no rearranjo de tecido para aninhar os ilhéus no tecido.

Figura 2: Descrição de orientação técnica e o grânulo distribuição através do tecido omental um dia após o implante. (A) ilustração da orientação técnica. Após a exposição do órgão (, à esquerda), o mix de ilhéu-hidrogel (substituído aqui por grânulos de cor azul dextran para melhor visualização) foi cuidadosamente injetado no tecido usando uma agulha atraumática (um, médio). Grânulos implantados no tecido são visível (A direita). (B) hematoxilina e eosina coloração do omento explantados 1 dia após a injeção do grânulo. Grânulos são encontrados no tecido com uma distribuição uniforme. Barra de escala = 100 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para validar esta técnica, realizamos estudos isogénicas usando ratos Lewis (n = 8). Ratos diabéticos recebendo transplante de ilhotas (equivalente 7660 ilhéu, IEQ) por kg de peso corporal rato usando hOMING foram monitorados para glicemia e C-peptidemia por dois meses. Glicemia era controlada pela implantação da pelota de insulina (como comprovação para a primeira queda na glicemia observada na Figura 3A). Função do enxerto foi reflectida por glicemia de cerca de 2 g/L e C-peptidemia > 500 pM. Antes do transplante, os ratos eram diabéticos (glicemia > 5 g/L e C-peptidemia < 200 pM). Após o transplante e recuperação de pelota de insulina, a normalização e manutenção da glicemia observou-se apenas 3 dias de pós-orientação transplante e foi mantida até a recuperação do enxerto (p < 0,05 em relação ao pré-transplante níveis). Depois explantação omental, glicemia levantou-se novamente para o nível pré-transplante, atestando a funcionalidade de ilhotas que foram transplantados por orientação (Figura 3A). O padrão C-peptidemia era o oposto, com baixa para níveis indetectáveis antes do enxerto, seguido por um aumento e manutenção a este nível de aumento no decorrer do estudo (p < 0.05) e, depois da explantação omental, um diminua para pré-transplante níveis (Figura 3B). Análise do omento explantado pela histologia revelou altamente re-vascularizadas ilhotas, provavelmente como resultado de sua proximidade aos vasos sanguíneos (Figura 3).

Figura 3: dois meses de seguimento metabólicos de ratos recebendo avaliação hOMING e enxerto. (A) glicemia medição e avaliação de peptídeo-C (B) após orientação usando alginato como um portador de ilhéu (Tx: transplante e recuperação de pelota de insulina; Explante: Explantação do omento). Enxertos são funcionais, como é demonstrado pela manutenção de normoglycemia após a recuperação da pelota de insulina e aumentam em C-peptidemia após a implantação do Ilhéu. Cinza áreas sombreadas representam os valores registados mínimos e máximas em cada ponto de tempo. (C) hematoxilina e eosina, coloração de uma seção omental após transplante de ilhotas usando o método caseiro. Dois meses após o implante sem qualquer tecido fibrótico, ilhotas são bem integradas no tecido. Navios têm crescido ao redor e dentro de Ilhéus, como indicado pelas setas e assim restaurar completamente a função de ilhéu. Morfologia dos ilhéus também parece bem preservada. Barras de escala = 50 µm. (n = 8) (*p < 0,05; * * p < 0,01; * * * determinado usando medidas repetidas de análise de variância (ANOVA) com teste de diferença de Tukey significado honesto como um teste post hoc p < 0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.