Transplante de ilhotas intra-Omental usando h-Omental enchimento Matrix ilhéu (hOMING)

Aqui, apresentamos um protocolo de validação em vivo de terapia celular baseada em hidrogel, ilustrada pelo exemplo de transplante de ilhotas. h-Omental ilhéu de Matrix (localizador) implantação de enchimento permite a implantação de uma célula-hidrogel mistura entre as camadas omental, perto dos vasos sanguíneos, para maximizar a enxertia em um ambiente apropriado e metabólica.

Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da terapia celular, como, o transplante de ilhotas pode ser otimizado pela técnica cirúrgica hOMING? As principais vantagens dessa técnica são que ela é simples, rápida e incapaz, e a validação do bioma material também é muito rápida. A demonstração visual da colocação da agulha é fundamental para garantir uma injeção adequada de enxerto dentro do omento, pois uma agulha mal colocada pode resultar em vazamento de ilhotas.

Para induzir diabetes, injete 75 miligramas por quilograma de estreptozotocina intraperitonealmente em cada seis semanas de idade, 150 a 190 gramas de rato receptor de Lewis, e verifique o estado de diabetes por medição diária de glicose no sangue nos primeiros quatro dias após a injeção. Quando os ratos apresentam uma glicemia acima de dois gramas por litro, injetam subcutânea seis unidades de insulina de longa duração por dia para evitar complicações de diabetes e perda de peso. Inclua ratos na coorte experimental quando duas medidas do nível de glicose no sangue da veia da cauda forem maiores que quatro a cinco gramas por litro por dois dias consecutivos, com um nível de C-peptídeo abaixo de 200 picomolar.

Para implantação de pelotas, confirme a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé no animal receptor diabético anestesiado e limpe o pescoço com iodo povidone. Raspe a área de implantação e limpe a pele exposta com iodo povidone adicional. Após três minutos, esterilize uma bala de insulina de 1/2 em uma solução de iodo de um a cinco povidone e use um trocarte de calibre 16 para perfurar a pele exposta do pescoço.

Em seguida, use o guia e a estilizar para inserir as pelotas e suturar a abertura com um único ponto. Limpe o ponto com mais iodo povidone e deixe o rato se recuperar em uma gaiola com monitoramento e alimentos para evitar hipoglicemia. Para medir a eficiência das pelotas, meça a diminuição da glicemia a cada mês durante um mês após a implantação, incluindo ratos na coorte experimental quando uma medida do nível de sangue C-peptídeo da veia da cauda é mantida abaixo de 200 picomolar em um mês após a implantação da insulina pellet.

Para o preenchimento de ilhotas de matriz intra-omental, conte o número de ilhotas isoladas de ratos doadores saudáveis em equivalentes de ilhotas, e prepare uma ilhota equivalente a 7.660 ilhotas por quilograma de receptor em tubos individuais de 1,5 mililitro. Lave cada alíquota com 500 microliters de meio CMRL sem soro bovino fetal e resuspenda as pelotas de ilhotas em 150 microliters de carregador de hidrogel alginato recém-preparado por tubo com mistura cuidadosa antes de colocar os tubos no gelo. Em seguida, carregue seringas de um mililitro equipadas com uma agulha atraumática de calibre 21 com 150 microliters de alginato vazio sem volume morto, seguidas por 150 microliters de alginato mais ilhotas.

Coloque as seringas no gelo e prepare o pescoço do primeiro animal receptor como apenas demonstrado. Use um bisturi para fazer uma incisão sobre a ferida antiga e use fórceps para remover as pelotas. Feche o ponto com um ou dois pontos de ponto único e coloque o rato na posição supina.

Esterilize a área peritoneal e faça a barba. Use um bisturi para criar uma laparotomia de 1/2 centímetros logo abaixo do esterno. Coloque gaze esterilizada molhada ao redor da incisão e identifique a almofada de gordura omental localizada ao lado do estômago.

Use fórceps para retirar suavemente a almofada de gordura da cavidade peritoneal, espalhando-a sobre a gaze. Hidrate bem o tecido omental com dois mililitros de soro fisiológico estéril pré-aquecido, de 37 graus Celsius, e, segurando o tecido com pequenas fórceps curvas em uma mão, penetre a borda omental entre as camadas omentais com a agulha de uma seringa carregada de ilhotas com a outra. Ao inserir a agulha, certifique-se de que ela está cercada por uma fina camada de tecido omental antes de iniciar a injeção.

Insira a agulha inteiramente e lentamente comece a injetar a preparação da ilhota enquanto retraia a agulha para permitir que as ilhotas injetadas se espalhem por todo o tecido. Durante a injeção, retraia a agulha até a borda dos tecidos, parando a injeção quando a agulha está quase fora. Em seguida, espere cinco segundos antes de iniciar uma nova injeção no próximo local.

E injetar mais três a quatro alíquotas como demonstrado. Quando todo o hidrogel tiver sido dispensado, retire a agulha cuidadosamente para evitar a perda das ilhotas injetadas, verificando se as ilhotas não estão agrupadas na seringa no final da injeção. Quando todas as ilhotas tiverem sido entregues, hidrate o omento e a parede da laparotomia antes de devolver cuidadosamente o tecido omental à cavidade abdominal.

Injete dois mililitros de soro fisiológico pré-aquecido na cavidade abdominal para reidratar o rato. Em seguida, feche a parede muscular com uma sutura contínua de rosca e costure a camada cutânea com ponto único. Após um a dois meses de acompanhamento metabólico, abra a incisão cirúrgica de cada receptor como demonstrado, e use fórceps para espalhar cuidadosamente a omenta em pedaços de gaze salino dispostos ao lado das incisões.

A partir da região aderente à cauda pancreática, use uma tesoura para extirpara o tecido omental e injete dois mililitros de soro fisiológico pré-aquecido antes de fechar cada animal como demonstrado. Fixar a omenta recuperada em 4% de paraformaldeído antes de incorporar em parafina. Em seguida, adquira seções de quatro micrômetros de espessura dos tecidos em um microtome e aplique hematoxilina e mancha de eosina para avaliação morfológica dos transplantes.

As contas do Dextran transplantadas utilizando o método hOMING, como demonstrado, foram frequentemente observadas perto dos vasos sanguíneos e foram bem implantadas dentro do tecido adiposo. Neste estudo isogênico representativo, a glicemia foi primeiro controlada pela implantação de uma cápsula de insulina de 1/2, como demonstrado e depois por ilhotas implantadas, como demonstrado por uma glicemia de aproximadamente dois gramas por litro e um C-peptidemia superior a 500 picomolar nos animais receptores. Além disso, a análise histológica da omenta explantada revelou ilhotas altamente revascularizadas, provavelmente como resultado de sua proximidade com vasos sanguíneos.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores em campos de terapia celular explorarem microambiente de células bioengenharia em modelos pré-clínicos.