Nós apresentamos um ensaio da fluorescência para demonstrar que o amarelo de Lucifer (ly) é um marcador robusto para determinar a permeabilidade transcelulares paracelulares aparente de monolayers da pilha de hcmec/D3, um in vitro modelo da barreira Human do sangue-cérebro. Utilizou-se este ensaio para determinar a cinética de formação de monocamada confluente em células hCMEC/D3 cultivadas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Amarelo de Lucifer-um marcador Paracellular robusto da permeabilidade em um modelo da pilha do sangue humano-barreira do cérebro
Neste artigo
Resumo
Resumo
A barreira sangue-cérebro BBB consiste em células endoteliais que formam uma barreira entre a circulação sistêmica e o cérebro para evitar a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas. Junções apertadas (TJ) efetivamente selar o espaço paracelular nas monocamadas resultando em uma barreira intacta. Este estudo descreve um ensaio de fluorescência com base em ly que pode ser usado para determinar o seu coeficiente de permeabilidade aparente (Papp) e, por sua vez, pode ser usado para determinar a cinética da formação de monocamadas confluentes e a junção apertada resultante integridade de barreira em monocamada de hCMEC/D3. Nós demonstramos mais uma utilidade adicional deste ensaio para determinar a integridade funcional de TJ em pilhas transfected. Nossos dados do ensaio doaplicativo ly P mostram que as células hCMEC/D3 semeadas em uma configuração de transpoços efetivamente limitam o transporte de ly paracelular 7 dias-pós cultura. Como uma utilidade adicional do ensaio apresentado, nós igualmente demonstramos que o transfection da nanopartícula do ADN não altera o transporte de ly transcelulares paracelulares em monolayers de hcmec/D3.
Introdução
A barreira hematoencefálica (BBB) é a barreira protetora que limita o afluxo de componentes plasmáticos no tecido cerebral e consiste em células endoteliais cerebrais, juntamente com células de apoio, como pericytes. O papel principal do BBB é servir como uma barreira que sela o espaço entre o sangue periférico e o sistema nervoso central (CNS) para manter a hemostasia do microambiente neural1,2. As pilhas endothelial capilares do cérebro selam eficazmente a via transcelulares paracelulares através da formação de junções apertadas intercelular (TJs)1. Esta barreira protetora permite gli....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
cultura da pilha de 1. General hCMEC/D3
- Ressuscitação de células congeladas
Nota: todos os experimentos e manutenção da cultura celular foram realizados dentro de uma capa de biossegurança estéril. Meios de cultura, suplementos e reagentes foram comprados como produtos estéreis ou esterilizados através de filtração usando um filtro de membrana de 0,22 μm para evitar a contaminação microbiana.- Adicionar 8,5 mL de solução de colágeno (0,15 mg/mL) em um balão de cultura tecidual (75 cm2 área de crescimento; referida doravante como T75) e colocá-lo em uma incubadora (37 ° c, 5% co2) para 1 h.
- Retire a ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Primeiramente, determinamos o efeito do tempo de cultivo na permeabilidade da LY para determinar a cinética aparente da formação de TJ. Os valores médios doaplicativo ly P do dia 1 a 10-post de semeadura são mostrados na Figura 2a. No dia 1, a média de Papp foi 4,25 x 10-4 cm/min e ligeiramente caiu para 3,32 x 10-4 cm/min no dia 2. O valor médio de Papp aumentou ligeiramente para 3,93 x 10-4 c.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Um papel fundamental do BBB é impedir a troca de íons não essenciais e substâncias tóxicas entre a circulação sistêmica e o cérebro para manter a hemostasia do microambiente neural. Uma das características do BBB é a capacidade das células endoteliais capilares para formar junções apertadas (TJs) que efetivamente selar a rota paracelular de transporte. Nós demonstramos um teste de LY Papp como um método quantitativo para determinar a cinética aparente da formação da barreira de TJ em monolayers cultivados de h.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores são gratos pelo apoio financeiro do 2017 New Investigator Award da associação americana de farmácia, um Hunkele temido Award doença da Universidade de Duquesne e da escola de farmácia start-up fundos para o laboratório Manickam. Gostaríamos de agradecer ao laboratório de vazamento (Duquesne University) para western blotting assistência e permitindo o uso de sua Odyssey 16-bit Imager. Nós igualmente gostaríamos de incluir uma nota especial da apreciação para kandarp Dave (laboratório de Manickam) para a ajuda com blotting ocidental.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Linha celular hCMEC/D3 | Cedarlane Laboratories | 102114.3C-P25 | linha celular endotelial microvascular cerebral humana |
| gWizLuc | Aldevron | 5000-5001 | DNA plasmídico que codifica o gene luciferase |
| lucifer amarelo CH sal de dilítio | Invitrogen | 155267 | |
| Transwell inserções com membranas de tereftalato de polietileno (PET) gravadas em trilha Falcon | 353095 | ||
| Frasco de cultura de tecidos | Olympus Plastics | 25-207 | |
| Fundo Plano de 24 poços | Olympus Plastics | 25-107 | |
| Pretas de 96 Poços | Thermo Scientific | 437111 | |
| S-MEM 1X | Gibco | 1951695 | Spinner-mínimo essencial médio (S-MEM) |
| EBM-2 | Clonetics | CC-3156 | Endothelial cell basal medium-2(EBM-2) |
| salina tamponada com fosfato 1X | HyClone | SH3025601 | |
| Colágeno Tipo I | Descoberta Labware, Inc. | ||
| 354236 Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce | Thermo Scientific | 23227 | |
| Reagente de Lise de Cultura de Células 5X | Promega | E1531 | |
| Beetle Luciferina, Sal de Potássio | Promega | E1601 | |
| SpectraMax i3 | Leitor de Placa de Fluorescência | Molecular Devices | |
| Solução Azul de Tripano, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Anticorpo Policlonal ZO-1 | ThermoFisher | 61-7300 | |
| anticorpo anti-GAPDH | abcam | ab8245 | |
| Alexa Fluor680-conjugado AffiniPure Donkey Anti-Mouse LgG(H+L) | Jackson ImmunoResearch Inc | 128817 | |
| 12 poços, fundo plano | Olympus Plastics | 25-106 | |
| tampão RIPA (5X) | Alfa Aesar | J62524 | |
| Aprotinin | Fisher BioReagents | BP2503-10 | |
| Odyssey CLx imager | LI-COR Biosciences | para escaneamento de membranas de western blot |
Referências
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology Of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platfo....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
