Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Comunicação entre os neurônios acontece em sites especializados de contato chamados sinapses. Sinapses contêm uma miríade de diferentes proteínas que orquestrar a transmissão sináptica. Algumas dessas proteínas mostram uma distribuição heterogênea em todo o sistema nervoso e não estão presentes em cada sinapse¹. Um exemplo de tal uma proteína é Munc13, que está envolvida no processo de preparação das vesículas sinápticas. Existem diferentes isoformas de Munc13, que são distribuídas de forma heterogénea ao longo do cérebro², e a presença ou ausência de isoformas específicas pode influenciar a curto prazo plasticidade sináptica e vesícula sináptica dinâmica^{3, 4 , 5}. portanto, é de vital importância para ser capaz de identificar a presença de diferentes proteínas sinápticas em todas as áreas do cérebro.

Os métodos de escolha para quantificação de proteínas sinápticas - até agora - são espectrometria de massa e mancha ocidental, ao invés de immunohistochemistry^6,7,8,9. Em alguns casos, vários métodos são usados para se complementam para avaliar tanto a quantidade e a localização de proteínas específicas (ou seja, Wilhelm et al . ¹⁰). o método descrevemos aqui permite a localização e quantificação de proteínas de interesse sem a necessidade de usar qualquer método bioquímico, simplesmente empregando colorações de imunofluorescência. Outra vantagem aqui é que a quantificação pode ser feita sobre áreas muito menores e, portanto, mais específicos, do que aqueles obtidos por outros métodos. No entanto, é preciso levar em consideração que uma proteína de referência confiável é necessária para avaliar a distribuição da proteína de interesse.

Coloração fluorescente por imuno-histoquímica permite identificar rotineiramente a localização de proteínas em todas as áreas do cérebro, bem como no âmbito de diferentes compartimentos neuronais. Para identificar os diferentes compartimentos, marcadores específicos são utilizados. Normalmente, os anticorpos contra synapsin e Sinaptofisina¹¹ podem ser usados para rotular vesículas sinápticas, enquanto anticorpos contra Fagote rotular a zona ativa de um terminal pré-sináptica¹². Os transportadores vesiculares, tais como os transportadores de glutamato vesicular (vGluT) ou transportador vesicular de GABA (vGAT), são usados para rotular excitatórios¹³ e inibitórios¹⁴ terminais pré-sináptica, respectivamente. No lado pós-sináptica, anticorpos contra a proteína de Homer podem ser empregados para marcar terminais pós-sinápticos e anticorpos contra a densidade pós-sináptica proteína 95 (PSD95)^15,16,17 ou gephyrin^{18 , 19 , 20} pode rotular terminais pós-sinápticos excitatórios ou inibitórios, respectivamente. Usando anticorpos contra uma proteína de interesse e marcadores tais como as descritas acima, pode-se determinar a localização de tais proteínas. Muitos estudos até à data este feito em uma maneira qualitativa²¹. No entanto, para determinar a distribuição diferencial de uma proteína sináptica específica de forma fiável, um deve não somente determinar sua presença ou ausência, mas também sua concentração relativa. A heterogeneidade de tamanhos e densidade de sinapses tornam importante estabelecer uma relação entre o marcador sináptico e a proteína de interesse. Caso contrário, regiões de sinapse-ricos tais como as camadas não-piramidais do hipocampo e a camada molecular do cerebelo mostrará uma alta densidade de proteínas sinápticas, apenas devido à maior densidade de sinapses, mas não devido a uma forte presença de proteínas na cada sinapse (por exemplo, Wallrafen e Dresbach¹). Por outro lado, as proteínas no soma neuronal (por exemplo, TGN38²²) mostrará geralmente forte presença na célula piramidal hippocampal camada ou camada de célula grânulo hippocampal ou cerebelar devido a alta concentração de corpos de células nessas áreas. Portanto, esta distribuição não homogênea de estruturas, neste caso as sinapses, pode levar a uma falsa estimativa da distribuição da proteína de interesse em si. Além disso, há uma variabilidade intrínseca as intensidades de coloração através de amostras em colorações imuno-histoquímica. O protocolo descrito aqui leva isso em consideração e evita tais preconceitos, bem como outras limitações que surgem a partir de métodos de imuno-histoquímica.

Em nosso recente estudo, nós usamos este método para descrever a expressão diferencial de motor (também chamado de TPRGL²³ ou SVAP30²⁴) através de de áreas cerebrais diferentes 16¹. Motor é uma proteína sináptica vertebrado-específicos que pode ser encontrada em associação com vesículas sinápticas e influencia a liberação de neurotransmissor^25,26,27. Podemos ter relacionado a expressão de Mover para a abundância das vesículas sinápticas, manchando para Sinaptofisina como um marcador de referência de vesícula sináptica. Encontramos altos níveis de motor particularmente em núcleos septais, o pallidum ventral e a amígdala. Dentro do hipocampo, encontramos uma distribuição heterogênea de motor, com altos níveis nas camadas associadas a computação intra-hipocampo e níveis baixos em camadas de entrada e saída.

Este protocolo não envolve experimentos em animais vivos. Experimentos envolvendo a eutanásia de animais para obter amostras de cérebro foram aprovados pelas autoridades locais de proteção animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sob o número de aprovação T 10/30.

Nota: Para este protocolo, foram utilizados 3 camundongos C57BL/6 adultos do sexo masculino.

1. preparação da amostra

1. Prepare o fixador e tampão de fosfato 0,1 M (PB; ver tabela 1).
2. Corrigir o animal por perfusão transcardial, conforme descrito em Gage et al ²⁸. primeiro lavar o sangue com 0,9% NaCl-solução, então perfundir com 30 mL de paraformaldeído 4% (PFA).
3. Abrir o crânio com uma tesoura e isolar com cuidado usando uma colher com bordas sem corte, para não danificar o tecido do cérebro.
4. Encher um tubo de reação de 50 mL com fixador e o cérebro em 4% o postfix PFA a 4 ° C durante a noite.
5. Retire o fixador e lavar o cérebro em 50 mL de 0.1 M PB num agitador por 30 min.
6. Após a lavagem, incube o cérebro em um tubo de reação de 50 mL em 30% de sacarose em PB de 0,1 M por 48 h ou até afunda no tubo a 4 ° C para cryoprotection.
7. Apare o cérebro cryoprotected com uma lâmina afiada, colocá-lo em um cryomold e incorporá-lo com temperatura de corte ideal (OCT) composta. Evite bolhas. Orientar o cérebro e congelar o cryomold no freezer-80 ° C.
8. Monte o tecido congelado para corte. Equilibrar o tecido para a temperatura de cryomicrotome durante pelo menos 15 minutos antes de cortar.
9. Seção do cérebro em 25 µm coronal de espessura. Toque a OCT cuidadosamente com um gancho de vidro sem tocar no tecido cerebral. Coletar 3 fatias adjacentes por bem em um prato bem 24 e armazená-los em PB de 0,1 M a 4 ° C até a coloração.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui por até duas semanas. Tempos de armazenamento mais podem interferir na qualidade do tecido e assim influenciar o resultado do experimento.

2. imunofluorescência

1. Prepare soluções, incluindo o tampão de bloqueio, amortecedor de anticorpo, lavagem buffer 1 e o tampão de lavagem 2 (ver tabela 1).
2. Lave as fatias uma vez com PB para remover o excesso OCT.
   1. Remova a solução com uma pipeta plástica sem chupar em fatias do cérebro. Adicione 250 µ l de PB fresco com pipeta 1000 µ l.
      Atenção: As fatias não devem secar, então remova e adicione fluidos bem pelo bem.
3. Remover o PB com uma pipeta plástica e adicionar 250 µ l de tampão de bloqueio por alvéolo com uma pipeta de 1000 µ l. Incube durante 3 h à temperatura ambiente (RT) no agitador.
4. Durante o tempo de incubação, dilua os anticorpos primários em buffer de anticorpo em um tubo de reação. Usar o buffer de anticorpo 250 µ l por bem e adicionar a quantidade apropriada de anticorpo (ver quadro 2) pipetando-lo diretamente para a solução com uma pipeta 2 µ l. Misture a solução suavemente pipetando subindo e descendo várias vezes. Vórtice logo depois para garantir a mistura adequada.
   Nota: Para determinar a fluorescência de fundo, colorações também devem ser realizadas sem adicionar o anticorpo primário. Por isso, incube a fatia na solução de anticorpo sem anticorpos primários de acordo com o protocolo.
5. Após o tempo de incubação, remova o tampão de bloqueio com uma pipeta plástica e adicionar 250 µ l de solução de anticorpos contendo anticorpos primários por bem. Incube as fatias com anticorpo primário durante a noite a 4 ° C, um agitador.
6. No dia seguinte, lave as fatias com lavagem tampão 1 3 x por 10 min a RT em uma coqueteleira.
   1. Remover o meio de uma pipeta de plástico e adicione 300 µ l de tampão 1 de lavagem por bem. Incube a RT por 10 min. repetir 3 vezes.
7. Durante as etapas de lavagem, dilua os anticorpos secundários fluoróforo acoplados em buffer de anticorpo em um tubo de reação. Usar o buffer de anticorpo 250 µ l por bem e adicionar a quantidade apropriada de anticorpo (ver quadro 2) pipetando-lo diretamente para a solução com uma pipeta 2 µ l. Misture a solução suavemente pipetando subindo e descendo várias vezes. Vórtice logo depois para garantir a mistura adequada.
   Cuidado: Porque os anticorpos são sensíveis à luz, todos os passos a partir de agora precisam ser executada no escuro.
8. Após as etapas de lavagem, remover a lavagem com uma pipeta plástica de buffer e adicionar 250 µ l de solução de anticorpos contendo anticorpos secundários por bem. Incube as fatias com anticorpo secundário para 90 min no RT no escuro.
9. Lave as fatias com lavagem tampão 2 3 x por 10 min a RT
10. Durante as etapas de lavagem, dilua ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) em 0,1 M PB em uma concentração de 1: 2000.
11. Retire o tampão de lavagem 2 com uma pipeta plástica e adicionar 250 µ l da solução DAPI por bem. Incube durante 5 min à RT no agitador.
12. Remover a solução DAPI com uma pipeta plástica e adicione 500 µ l de PB de 0,1 M por poço com uma pipeta de 1000 µ l.
13. Monte as fatias em corrediças do microscópio.
    1. Coloque uma lâmina de microscópio sob o estereoscópio. Com um pincel fino, adicione três gotas separadas de 0,1 M PB para o slide. Coloque uma fatia por cair sobre a lâmina de microscópio.
    2. Use o pincel fino para achatar e orientar as fatias do slide de microscópio.
    3. Quando todas as fatias são posicionadas corretamente, remova PB em excesso com um lenço de papel e seque cuidadosamente o slide.
       Atenção: Evite secar as fatias de cérebro completamente.
    4. Adicione 80 µ l de incorporação médio para o slide. Desça cuidadosamente a lamela para o slide, assim, incorporando as fatias do cérebro.
    5. Deixe os slides para secar a coifa para 1-2 h (cobri-los para evitar a exposição à luz) e armazená-los em uma caixa de slide de microscópio a 4 ° C.
       Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

3. imagem latente

1. Depois que o meio de encastre é completamente endurecido, coloque a lâmina de microscópio sob o microscópio confocal.
   Nota: A microscopia de epifluorescência, combinada com o software de deconvolução deve produzir qualidade de imagem similar.
2. Ajuste os parâmetros do laser aumentando ou diminuindo a intensidade do laser para cada canal, para que alguns pixels são superexpostas para garantir o máximo da distribuição dos valores de cinza.
3. Adquira tecidos virtuais da fatia inteira do cérebro para os diferentes canais.
   1. No software da imagem latente (ver Tabela de materiais), selecione a opção de telhas e manualmente delinear a fatia do cérebro com a Configuração de região da telha.
   2. Distribuir pontos de apoio em toda a região de telha e ajustar o foco para os pontos de apoio diferentes pressionando Verificar telha regiões/posições...
   3. Ajustar as configurações no Modo de aquisição de acordo com o tamanho desejado do arquivo e resolução da imagem resultante e iniciar a varredura.
4. Quando a digitalização estiver concluída, use a função de costura para processar o tecido virtual. Exporte o arquivo como um. tif, com a função de Exportação de imagem.

4. baseada em computador

1. Carregar todos os canais único para uma imagem em FIJI²⁹ clicando arquivo | Aberto.
2. Com a ferramenta de seleção à mão livre , delinear um hemisfério no DAPI-canal. Crie uma máscara da seleção clicando Editar | Seleção | Criar máscara de.
3. Determinar a intensidade de fluorescência média para os canais único (Mover e Sinaptofisina) clicando Analyze | Medida.
   Nota: Certifique-se de selecionar os canais diferentes para determinar os valores de intensidade de fluorescência média para cada canal.
4. Copie a intensidade média de fluorescência para os canais único em uma planilha.
5. Determine a intensidade de fluorescência média para os canais única em uma área de interesse, delineando a área também com a ferramenta de seleção à mão livre . Use um atlas de cérebro de rato como referência.
6. Repita as etapas 4.1-4.5 para todos os hemisférios e todas as áreas de interesse.
   Nota: Determinar os valores para cada hemisfério, separadamente, para depois comparar os valores em uma área de interesse para que no hemisfério (ver passo 5.2).

5. manipulação de dados

1. No caso da fluorescência de fundo é elevada (ver discussão), pode ser necessária uma subtração de fundo. Por isso, determinar a intensidade média de fluorescência para a fatia processada sem anticorpo primário contra a proteína de referência (aqui: Sinaptofisina) e subtraia o valor de todos os valores obtidos para as regiões cerebrais e hemisférios.
2. Quando as intensidades de fluorescência média para os canais único para cada hemisfério e todas as áreas de interesse foram determinadas (ver quadro 3), calcular a relação de motor para Sinaptofisina, dividindo o valor para Mover pelo valor para Sinaptofisina ( amarelo na tabela 3). Execute esta ação para cada área de interesse e cada hemisfério separadamente.
3. Divida a relação obtida para uma área de interesse, pelo quociente obtido para o hemisfério correspondente (laranja na tabela 3) para determinar a relação entre a área de interesse para o hemisfério.
4. Para determinar a abundância relativa de Mover, traduza o rácio Obtido em 5.2, em percentagem, determinando seu desvio de 1 (vermelho na tabela 3). Uma relação de 1,25, portanto, daria uma abundância relativa de Mover de 25% acima da média, e uma proporção de 0,75 renderia uma abundância relativa de Mover de 25% abaixo da média.

Representante, manchando os padrões dos diferentes marcadores pode ser visto na Figura 1. O padrão varia de acordo com a distribuição da proteína. Exemplos de cinco níveis de rostro-caudal são mostrados nas colunas (A)-(E). Uma coloração de DAPI representativa é mostrada na primeira linha: DAPI adere ao DNA de uma célula e, portanto, os núcleos estão manchados. Isso resulta em um padrão punctate. Regiões com uma densidade de pilha alta são mais brilhantes do que regiões com uma densidade celular baixa. Um exemplo para uma proteína de forma heterogénea distribuída pode ser visto na segunda fila. O deslocador de coloração revela uma distribuição diferencial em todo o cérebro, com áreas de hotspot brilhante e redutor. Na terceira linha, é mostrado um exemplo para a referência mais homogeneamente distribuída marcador Sinaptofisina. Uma sobreposição das duas proteínas (quarta linha) mostra a distribuição diferencial de motor (vermelho) em comparação com a marcador proteína Sinaptofisina (verde).

A Figura 2 mostra a quantificação descrita na etapa 4 do protocolo. São mostrados os valores de intensidade de fluorescência média para os diferentes canais entre os hemisférios (Mover, Figura 2A; Sinaptofisina, Figura 2B) e entre as áreas de interesse (Mover, Figura 2C; Sinaptofisina, Figura 2D). Para determinar a abundância de Mover em relação ao número de vesículas sinápticas, uma relação é tomada dos valores de fluorescência de Mover a Sinaptofisina valores de fluorescência. Estas relações para as áreas de interesse são mostradas na Figura 2E, já fornecem uma indicação da distribuição heterogênea de motor, com áreas com alto e baixo Mover os níveis em relação a vesículas sinápticas. Para além disso compensar a variabilidade inerente do técnica, a relação em uma área de interesse(Figura 2)é comparada com a do outro lado do hemisfério (não mostrado) e traduzida em uma porcentagem. Esta relativa dá de abundância (Figura 2-F) Mover uma medida de quanto motor está presente em uma área de interesse em relação à média.

Como mencionado acima, uma das principais vantagens desta técnica é a capacidade de determinar a abundância da proteína de interesse em áreas muito pequenas, mesmo sub-regiões e camadas de áreas de interesse. Um exemplo desta aplicação é mostrado na Figura 3, onde a abundância relativa do motor foi determinada para as diferentes camadas nos subcampos do hipocampo. A quantificação das diferentes camadas mostrado na Figura 3D, Figura 3Fe Figura 3H corresponde as camadas mostradas na Figura 3C, Figura 3Ee Figura 3G, com as cores correspondentes. Dentro do hipocampo, Mover é heterogénea, com altos níveis de Mover em relação a vesículas sinápticas em camadas associadas com computação intra-hippocampal (ou seja, a camada de polimorfo de giro dentate [DG], stratum radiatum, lucidum oriens de Cornu Ammonis 3 [CA3] e estrato radiatum e oriens de Cornu Ammonis 1 [CA1]) e níveis baixos em camadas de entrada e de saída (a camada interna e exterior molecular da DG, as camadas de célula piramidal do CA3 e CA1 e o estrato lacunosum-moleculare de CA1).

Figura 1 : Imagens de imunofluorescência representativa de DAPI (primeira linha), Mover (segunda linha), Sinaptofisina (terceira fila) e sua sobreposição (quarta linha, motor em vermelho, Sinaptofisina em verde) nos 5 níveis rostro-caudal (A-E). Áreas de interesse são sombreadas em cinza na linha superior dos painéis. M1, o córtex motor primário; COI, Ilhas de Calleja; ACC, córtex cingulado anterior; SNu, núcleos septais; VPa, pallidum ventral; NuA, núcleo accumbens; CP, putâmen caudado; S1, córtex somatossensorial primário; HC, hipocampo; Estou, amígdala; MHa, habenula medial; PAG, cinzenta periaquedutal; SN, substantia nigra; VTA, área tegmental ventral; MLC, camada molecular do cerebelo; GLC, camada granulosa do cerebelo. Barra de escala = 500 µm. Esta figura foi modificada de Wallrafen e Dresbach1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Quantificação da distribuição do motor através de 5 níveis de rostro-caudal. Quer dizer a intensidade da fluorescência do sinal motor (A) e o sinal de Sinaptofisina (B) nos diferentes níveis. Quer dizer a intensidade da fluorescência do sinal do motor (C) e o sinal de Sinaptofisina (D) nas 16 regiões do cérebro manualmente delineados. (E) rácios de Mover e Sinaptofisina nas áreas 16 cerebrais de interesse. (F) quantificação da abundância relativa do motor, comparando a relação motor/Sinaptofisina na respectiva região à relação entre o hemisfério correspondente. M1, o córtex motor primário; COI, Ilhas de Calleja; ACC, córtex cingulado anterior; SNu, núcleos septais; VPa, pallidum ventral; NuA, núcleo accumbens; CP, putâmen caudado; S1, córtex somatossensorial primário; HC, hipocampo; Estou, amígdala; MHa, habenula medial; PAG, cinzenta periaquedutal; SN, substantia nigra; VTA, área tegmental ventral; MLC, camada molecular do cerebelo. Pontos pretos representam os pontos de dados único. As barras mostram média ± erro padrão da média (SEM). Esta figura foi modificada de Wallrafen e Dresbach1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Distribuição de mover o hipocampo de rato. Imunofluorescência citológicas de fatias coronais do hipocampo do mouse. Visão geral do hipocampo mostrando o padrão de expressão heterogêneo do motor (A) e a correspondente Sinaptofisina (B) a coloração. As três regiões de interesse (DG, Figura 3C; CA3, Figura 3,E; CA1, Figura 3G) são delineadas com linhas brancas pontilhadas. (D,F,H) Quantificação, comparando a relação nas respectivas camadas à relação entre o hemisfério correspondente. As cores na barra de gráficos correspondem o respectivo sombreamento em painéis, C, Ee G. Expressão de mover é alta em níveis associados a computação intra-hippocampal (ou seja, a camada de polimorfismo da DG, stratum radiatum, lucidum e oriens de CA3 e estrato radiatum e oriens de CA1) e baixa na entrada principal - e camadas de saída (o camada molecular interna e externa da DG, as camadas de célula piramidal do CA3 e CA1 e o estrato lacunosum-moleculare de CA1). OML, camada molecular externa; IML, camada molecular interna; GrL, camada granulosa; PmL, polimorfo camada/Hilo; Então, oriens estrato; Espião, estrato pyramidale; SLu, estrato lucidum; SR, stratum radiatum; SLM, estrato lacunosum-moleculare. Barra de escala = 500 µm. pontos pretos representam dados únicos pontos. As barras mostram a média ± SEM. Esta figura foi modificada de Wallrafen e Dresbach1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Soluções usadas no presente protocolo.

Tabela 2: Anticorpos utilizados no presente protocolo.

Tabela 3: Exemplo de manipulação de dados.

Os autores não têm nada para divulgar.