Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Resumo

Movimento de célula é uma propriedade crítica de trophoblasts durante o desenvolvimento da placenta e gravidez precoce. O significado do trofoblasto adequada migração e invasão é demonstrado por distúrbios da gravidez, tais como restrição de crescimento intra-uterino e de pré-eclâmpsia, que são associados com a invasão do trofoblasto inadequada da vasculatura materna. Infelizmente, nossa compreensão dos mecanismos por que a placenta se desenvolve a partir de migração de trophoblasts é limitado. Análise in vitro da migração celular através de ensaio de risco é uma ferramenta útil na identificação de fatores que regulam a capacidade migratória trofoblasto. No entanto, este ensaio sozinho não define as alterações celulares que podem resultar em migração de célula alterada. Este protocolo descreve três diferentes ensaios in vitro são usados coletivamente para avaliar o movimento de células do trofoblasto: o risco do ensaio, o ensaio de invasão e o ensaio de proliferação. Os protocolos descritos aqui também podem ser modificados para uso em outras linhas de célula para quantificar o movimento de célula em resposta a estímulos. Estes métodos permitem que os investigadores identificar fatores individuais que contribuem para o movimento da célula e fornecem uma análise exaustiva dos potenciais mecanismos subjacentes alterações aparentes na migração celular.

Introdução

Desenvolvimento da placenta é um passo crucial no estabelecimento da gravidez, impactando a saúde materna e fetal. No entanto, a base mecanicista, pelo qual este processo ocorre não é totalmente compreendida. Migração celular é um importante processo biológico que contribui para a criação e funções da placenta durante a gravidez. Após a implantação do blastocisto, a trofectoderma diferencia em trophoblasts das vilosidades, que cobrem a superfície das vilosidades coriônica e estão envolvidos em gás e troca de nutrientes, e extravillous trophoblasts (eventos), que migram para fora das vilosidades e invadem a decídua e a vasculatura materna¹. Migr....

Protocolo

1. preparação da pilha

1. Manter as células em frascos de T-75 em meios de crescimento padrão em 37 ° C, 5% de CO₂e 95% de umidade.
   Nota: As células utilizadas nesses experimentos foram o imortalizado linhas de células do trofoblasto primeiro trimestre Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo^9,10. As células de Sw.71 foram mantidas em DMEM/F-12, suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), piruvato de sódio 1,0 mM, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM não aminoácidos essenciais, 100 unidades/mL penicilina e 100 estreptomicina µ g/mL. As HTR-8/SVneo células foram mantid....

Resultados

As linhas de célula humana imortalizado primeiro trimestre trofoblasto Sw.71 e HTR-8/SVneo foram utilizadas nesses experimentos para determinar o papel de glicocorticoides no trofoblasto celular migração¹². Os glicocorticoides foram utilizados nesses experimentos como eles recentemente foram mostrados para alterar funções de trofoblasto, embora tratamentos alternativos podem ser usados¹². Ambas as linhas de célula foram tratadas com veículo .......

Discussão

Este procedimento baseia-se na utilização de migração e invasão ensaios para incluir a taxa de proliferação celular, como um contribuinte potencial medidos diferenças no movimento de células do trofoblasto. Usados em conjunto, estes ensaios in vitro são métodos simples e eficazes que podem ser usados para identificar os caminhos celulares que regulam a migração do trofoblasto. Conforme descrito acima, as células do trofoblasto podem ser tratadas com hormonas, citocinas, fatores de crescimento ou outras moléculas para det.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,4% de mancha azul de tripano	Thermo Fisher Scientific	15250-061
0,5% de tripsina-EDTA	Life Technologies	15400-054
1,0 M HEPES	AmericanBio	AB06021-00100
10 mM Aminoácidos não essenciais MEM	Life Technologies	11140-050
100 mM piruvato de sódio	Life Technologies	11360-070
Inserções de transwell de placa de 24 poços	Corning	3422	Contêm filtros de policarbonato com um 8 μ m tamanho dos poros
Carvão dextrano FBS	Gemini Bio-Products	100-119
Contador de Células Automatizado Countess II	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
Cristal Violeta	Sigma Aldrich	C0775
Cytoseal 60	Thermo Fisher Scientific	8310-4
Dexametasona (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-metil-11β, 17, 21-triol-3, 20-diona; ≥ 98% TLC)	Esteralóides	P0500-000
DMEM / Presunto ' s F12	Life Technologies	11330-032
Soro Fetal Bovino	Sigma Aldrich	F2442
IncuCyte Placas ImageLock de 24 poços	Essen BioScience	4365	Se estiver usando o sistema de imagem IncuCyte Zoom, semeie as células nas placas IncuCyte ImageLock. Essas placas têm marcadores fiduciais na parte inferior da placa que são usados como referência para imagens repetidas em um campo de visão constante.
Software IncuCyte	Essen BioScience	2010A Rev2
Sistema IncuCyte ZOOM Essen	BioScience	N/A	As imagens do ensaio Scratch foram capturadas e analisadas usando a predefinição " Ferida de arranhão" parâmetros no sistema IncuCyte ZOOM. Outros microscópios de lapso de tempo também podem ser usados.
Matriz de Membrana Matrigel	Becton Dickinson	356231	Fator de crescimento reduzido, livre de vermelho de fenol
Micro Slides	VWR International, LLC	48311-7003
Vidro de cobertura do microscópio	Fisher Scientific	12-545-E
Microscópio invertido Olympus IX71	Olympus	IX71
Penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 µ g / mL)	Life Technologies	151-40-122
Sem fenol vermelho DMEM / Ham's F12	Life Technologies	11039-021
Ferramenta semiautomática para fabricação de feridas	Essen BioScience	N / A