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Artigo de método

Em Vitro ensaios para avaliar a migração, invasão e proliferação de linhas de células humanas imortalizado primeiro trimestre trofoblasto

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DOI:

10.3791/58942

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5 de março de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Sciences, Yale School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo altamente acessível para avaliar o movimento de célula em células do trofoblasto humana usando três ensaios in vitro: ensaio de zero, o ensaio de invasão transwell e o ensaio de proliferação celular.

Resumo

Movimento de célula é uma propriedade crítica de trophoblasts durante o desenvolvimento da placenta e gravidez precoce. O significado do trofoblasto adequada migração e invasão é demonstrado por distúrbios da gravidez, tais como restrição de crescimento intra-uterino e de pré-eclâmpsia, que são associados com a invasão do trofoblasto inadequada da vasculatura materna. Infelizmente, nossa compreensão dos mecanismos por que a placenta se desenvolve a partir de migração de trophoblasts é limitado. Análise in vitro da migração celular através de ensaio de risco é uma ferramenta útil na identificação de fatores que regulam a capacidade migratória trofoblasto. No entanto, este ensaio sozinho não define as alterações celulares que podem resultar em migração de célula alterada. Este protocolo descreve três diferentes ensaios in vitro são usados coletivamente para avaliar o movimento de células do trofoblasto: o risco do ensaio, o ensaio de invasão e o ensaio de proliferação. Os protocolos descritos aqui também podem ser modificados para uso em outras linhas de célula para quantificar o movimento de célula em resposta a estímulos. Estes métodos permitem que os investigadores identificar fatores individuais que contribuem para o movimento da célula e fornecem uma análise exaustiva dos potenciais mecanismos subjacentes alterações aparentes na migração celular.

Introdução

Desenvolvimento da placenta é um passo crucial no estabelecimento da gravidez, impactando a saúde materna e fetal. No entanto, a base mecanicista, pelo qual este processo ocorre não é totalmente compreendida. Migração celular é um importante processo biológico que contribui para a criação e funções da placenta durante a gravidez. Após a implantação do blastocisto, a trofectoderma diferencia em trophoblasts das vilosidades, que cobrem a superfície das vilosidades coriônica e estão envolvidos em gás e troca de nutrientes, e extravillous trophoblasts (eventos), que migram para fora das vilosidades e invadem a decídua e a vasculatura materna1. Migração dos eventos é essencial para a remodelação artérias espiral materna e o estabelecimento de circulação uteroplacentária para apoiar o crescimento fetal2. Invasão do trofoblasto inadequada durante a gravidez, resulta em um desenvolvimento anormal da placenta e pode contribuir para complicações da gravidez como pré-eclâmpsia, hipertensão gestacional, restrição de crescimento intra-uterino e parto prematuro3, 4. Portanto, compreender os fatores que afetam a motilidade do trofoblasto é essencial para determinar os caminhos necessários para placentação normal.

Migração do trofoblasto é controlada por uma complexa rede de sinalização moléculas, incluindo fatores de crescimento, citocinas, hormônios e fatores de angiogênico5. Devido às limitações do estudo in vivo da placenta, ensaios in vitro utilizando imortalizadas células do trofoblasto humano linhas foram cruciais para a identificação dos factores que contribuem para a mobilidade do trofoblasto. Zero e invasão de ensaios têm sido amplamente utilizados para avaliar quantitativamente o papel das moléculas individuais no trofoblasto celular migração6,7,8. No entanto, embora útil em tandem para investigar como mudanças na migração podem ser causadas por alterações na capacidade de invasão celular, estes dois ensaios não representam mecanismos adicionais que podem contribuir para as taxas alteradas de migração celular. Por exemplo, reduções para a taxa de proliferação celular podem resultar em menos células disponíveis para migrar.

Aqui, descrevemos quantitativos métodos in vitro para avaliar a migração do trofoblasto usando zero, proliferação celular e ensaios de invasão celular. No ensaio de zero, uma ferida uniforme é criada em uma monocamada de células, e a migração de células para preencher a lacuna é medida pela imagem automatizada, lapso de tempo do tamanho da ferida e densidade de células dentro da ferida. O ensaio de proliferação celular é baseado no cálculo do rácio de células em cada ponto de tempo em comparação com uma quantidade conhecida de partida de células. No ensaio de invasão celular, células são semeadas no topo de uma câmara de inserção de cultura celular revestido de matriz extracelular (por exemplo, Transwell), e o número de células que invadem através da matriz extracelular em resposta a quimioterapia-attractant é contado.

O risco é uma ferramenta simples e eficaz que pode ser usada para determinar como diferentes condições ambientais afetam a migração celular. Os ensaios de proliferação e invasão posteriormente podem ser usados para determinar a contribuição da proliferação celular e invasividade para mudanças globais na migração celular. Coletivamente, estes ensaios fornecem medidas robustas de processos biológicos que podem contribuir para a motilidade celular. Duas linhas de célula imortalizado primeiro trimestre trofoblasto foram utilizadas nos ensaios descritos, Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. No entanto, estes ensaios também podem ser otimizados para uso em outros tipos de células para identificar a chaves moduladores de migração celular e invasão.

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Protocolo

1. preparação da pilha

  1. Manter as células em frascos de T-75 em meios de crescimento padrão em 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade.
    Nota: As células utilizadas nesses experimentos foram o imortalizado linhas de células do trofoblasto primeiro trimestre Swan.71 (Sw.71) e HTR-8/SVneo9,10. As células de Sw.71 foram mantidas em DMEM/F-12, suplementado com 10% inactivadas pelo calor fetal de soro bovino (FBS), piruvato de sódio 1,0 mM, 10 mM HEPES, 0,10 mM MEM não aminoácidos essenciais, 100 unidades/mL penicilina e 100 estreptomicina µ g/mL. As HTR-8/SVneo células foram mantidas em RPMI-1640 suplementado com 5% inactivadas pelo calor FBS.
  2. Permitir que as células replicar até atingirem a confluência de 90-100%. Usando um capuz de fluxo de cultura de tecidos estéreis, Aspire os meios de comunicação de pilhas do balão e lavagem com 10 mL de estéril 1x tampão fosfato salino (PBS).
  3. Aspire a PBS e adicionar 5 mL de 1x (0.05%) tripsina-EDTA para o balão, certificando-se que as células estão cobertas por tripsina. Coloque o frasco na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2até que todas as células têm destacado do fundo do frasco (aproximadamente 5-10 min).
  4. Adicione 10 mL de mídia de crescimento previamente aquecido no balão para desativar o tripsina-EDTA.

2. Raspe ensaio

  1. A seguir passo 1.4, semente o número adequado de células em uma placa de 24 para alcançar a confluência de 100% em 48 h.
    Nota: É possível realizar o ensaio de risco com uma variedade de layouts de placa diferente. O número máximo de permitido pela ferramenta criador de ferida de poços é um formato de 96 poços.
  2. No dia seguinte (dia antes do ensaio zero), mudar de mídia para mídia livre-vermelho de fenol complementada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão FBS dextran-despojado.
    Nota: Outros estudos têm recomendado o uso de mídia com baixa concentração FBS (por exemplo, 1%) para minimizar a proliferação celular, que pode ser usada como uma alternativa no presente protocolo11.
  3. No dia do ensaio do zero, pré-tratamento células por 30 min, adicionando o tratamento desejado para a mídia em cada poço. As experiências descritas utilizaram veículo (1X PBS) e 100 nM dexametasona, que diluído em 1X PBS.
  4. Para criar feridas uniformes, coloque estéril 10 pontas de pipetas µ l nos pinos da ferramenta do fabricante a ferida. Abaixar as dicas para a primeira linha de poços e mova a placa ao longo da trilha do maker ferida até que as pontas de pipeta chegar ao outro lado do poço.
    1. Mova a placa de volta para a posição inicial, permitindo que as pontas de pipeta continuamente tocar o fundo do prato para garantir uma constante ferida através do diâmetro do poço. Remover e substituir as pontas de pipeta estéril 10 µ l e abaixar as pontas para a próxima linha de poços.
  5. Repita a etapa 2.4 até que todos os poços estão arranhados.
    Nota: Se não houver uma ferramenta de fabricante de ferida, feridas podem ser criadas manualmente raspando o centro dos poços com uma ponta de pipeta de 10 µ l.
  6. Aspire cuidadosamente com mídia e lave suavemente células duas vezes com 1X PBS. Após uma lavagem final, adicione complementado-vermelho de fenol livre, despojado ou baixa-FBS mídia com tratamento desejado ou veículo (conforme indicado no passo 2.3).
    Nota: HTR-8/SVneo células devem ser lavadas com mídia de vermelho de fenol completadas, como lavar com 1X PBS fará com que as células desanexar.
  7. Coloque a placa de 24 poços riscados contendo no tonalizador automatizado, lapso de tempo (veja a Tabela de materiais) alojados numa incubadora laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade. Poços de imagem a intervalos regulares, conforme necessário para permitir que as células completar a cicatrização de feridas (por exemplo, cada 2h para 72 h).
  8. Calcular a densidade de ferida e largura pelo software associado com o tonalizador automatizado, lapso de tempo (veja a Tabela de materiais). Para calcular o tamanho da ferida em relação ao tamanho do ferimento inicial de variação percentual, defina a largura de ferida ao tempo 0 igual a 100%. Divida o tamanho da ferida em cada commit subsequente pelo tamanho do ferimento no tempo 0 e multiplicar por 100 para obter o percentual (Figura 1).

3. invasão ensaio

  1. Etapa seguinte 1.4, semente o número adequado de células em placas de 6 boas para permitir que as células alcançar a confluência de 90% em 48 h. manter as células em uma incubadora de laboratório conjunto para 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2.
  2. No dia seguinte, mude de mídia para mídia livre-vermelho de fenol complementada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão FBS dextran-despojado.
    Nota: As células podem ser pré-tratados neste momento dependendo do delineamento experimental.
  3. Neste momento, coloque o frasco da matriz extracelular de 10 mg/mL (ver Tabela de materiais) em gelo e deixe-a descongelar no frigorífico durante a noite.
  4. No dia seguinte, ensaio pre-cool invasão fontes colocando placas de 24 poços, cultura de célula insere, microcentrifuga tubos e pontas de pipetas no frigorífico (4 ° C) pelo menos 2 h antes de trabalhar com a matriz extracelular.
  5. Uso de fontes de refrigerados do capuz de cultura de tecidos, matriz extracelular de 10 mg/mL diluído 1:1 com mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro a uma concentração final de 5 mg/mL.
    Nota: Sempre manter o estoque e a matriz extracelular diluída no gelo. A relação da matriz extracelular, a mídia pode ser ajustada com base nas propriedades da linha celular utilizada no ensaio.
  6. Uso de fontes de refrigerados do capuz de cultura de tecidos, adicione 100 μL de matriz extracelular diluída para as inserções (ver Tabela de materiais) que tenham sido colocadas na placa de 24. Certifique-se que a matriz é nível sem quaisquer bolhas. Coloque a placa de 24 poços contendo inserções matriz revestidos em incubação a 37 ° C, para permitir que a matriz a endurecer.
  7. Para preparar células para o ensaio da invasão, lavam-se células com 1 mL de 1X PBS, Aspire a PBS e adicione 500 µ l de tripsina-EDTA de 1x a cada poço. Coloque a placa de 6 na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, umidade de 95% e 5% CO2até que todas as células têm destacado da parte inferior da placa.
  8. Uma vez que as células têm destacado, adicione 500 µ l de mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro a cada poço das células trypsinized.
  9. Transferência de 1.000 µ l de células desanexadas microcentrifuga tubo e spin-down por 5 min a 400 x g a 4 ° C.
  10. Aspirar a mídia e ressuspender as células em mídia fenol-vermelho-livre, sem soro (volume dependerá concentração de células). Contagem de células usando uma célula automatizada counter (consulte Tabela de materiais) e ajustar o volume da suspensão de células para uma concentração final de 5 x 105 células por mL.
    Nota: Um hemocytometer e microscópio também podem ser usados para contar as células.
  11. Adicione 600 μL de mídia completo crescimento aos poços da placa de 24 poços que será usado para o ensaio de invasão.
    Nota: Quimioatraentes adicionais ou tratamentos podem ser adicionados ao meio de crescimento completo no poço (câmara baixa). As experiências descritas adicionado veículo (1X PBS) ou 100 dexametasona nM, diluído em 1X PBS para a câmara baixa.
  12. Lugar do pré-revestida inserir em cada poço contendo meio de cultura completo que será usado para o ensaio de invasão. Em seguida, adicione 200 μL de células no topo de cada inserção de célula pré-revestidos (câmara superior) para um total de 1 x 105 células.
    Nota: Como um controle negativo para este ensaio, um volume igual de mídia fenol-vermelho-livre, livre de soro (sem pilhas) pode ser adicionado para a câmara superior.
  13. Coloque a placa de 24 na incubadora laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade por 24 h.
    Nota: O período de incubação de 24 h foi otimizado para as células do trofoblasto imortalizado do primeiro trimestre e ainda mais testes podem ser necessária para determinar o período de incubação necessário em outras linhas de célula.
  14. Após incubação durante a noite, sucção os restantes meios de comunicação da câmara superior e inferior sem perturbar a matriz extracelular. Em seguida, Retire cuidadosamente a matriz extracelular e células não-invadida de parte superior da inserção com um cotonete de algodão, esfregar-se tantas vezes quanto necessário para remover a matriz extracelular.
  15. Lavagem de cada inserir 3x com PBS 1x, adicionando PBS para ambas as câmaras superiores e inferiores do poço. Aspire PBS depois de cada lavagem.
  16. Consertar as células anexadas para as inserções, colocando inserções em 100% de metanol gelada por 30 min a 4 ° C. Lavagem insere 3x com 1X PBS e PBS remover depois de lavar o final. Manche as células anexadas para as inserções por 10 min com violeta de cristal de 0,2% em etanol a 20%.
  17. Lavar 3x com água desionizada e aspirar água desionizada após a lavagem final.
  18. Secar ao ar inserções por 1h à temperatura ambiente. Usando fórceps e uma lâmina de barbear, cuidadosamente, corte a membrana da parte inferior da inserção e montar sobre uma lâmina de vidro com o lado inferior voltada para cima. Permitir que a mídia de montagem secar à temperatura ambiente.
  19. Obter pelo menos 4 imagens únicas de células invadidas por amostra, usando um microscópio de luz com um objectivo de 20 x. Conte o número total de células em cada imagem e normalizar o número de células para amostras de controlo e plotar dados (Figura 2).

4. proliferação ensaio

  1. Passo seguinte 1.4, contar as células trypsinized do recipiente usando um contador de célula automatizada e sementes em placas de 6-poços em uma densidade de 2 x 105 células por poço em mídia padrão de crescimento.
  2. Colocar as células em uma incubadora de laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade por 4 h ou até células aderiram.
  3. Mídia de mudança para o vermelho de fenol mídia completada, se necessário, incluindo inactivados por calor, carvão dextran-despojado FBS livre e adiciona tratamento desejado. As experiências descritas adicionado veículo (1X PBS) ou 100 dexametasona nM, diluído em 1X PBS. Coloca as placas 6-poços em uma incubadora de laboratório mantida a 37 ° C, 5% de CO2e 95% de umidade.
  4. Remova a mídia e substitua com tratamento e novas mídias cada 48 h.
  5. Após 24, 48 ou 72 h tratamento, as células com 1 mL de 1X PBS de lavagem e adicionar 500 µ l de tripsina-EDTA para cada poço. Coloque placa de 6 na incubadora até células tem separada da placa.
  6. Uma vez que as células têm retirado a placa, adicione 500 µ l da mídia livre de vermelho de fenol complementada para desactivar a tripsina.
  7. Adicionar 5 µ l de células trypsinized a 5 µ l de Trypan azul em um tubo separado e misture por pipetagem.
  8. Contar as células de cada poço em duplicado usando um contador automatizado de células.
  9. Média do número de células por poço em cada ponto do tempo e a trama em função do tempo (Figura 3).

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Resultados

As linhas de célula humana imortalizado primeiro trimestre trofoblasto Sw.71 e HTR-8/SVneo foram utilizadas nesses experimentos para determinar o papel de glicocorticoides no trofoblasto celular migração12. Os glicocorticoides foram utilizados nesses experimentos como eles recentemente foram mostrados para alterar funções de trofoblasto, embora tratamentos alternativos podem ser usados12. Ambas as linhas de célula foram tratadas com veículo ...

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Discussão

Este procedimento baseia-se na utilização de migração e invasão ensaios para incluir a taxa de proliferação celular, como um contribuinte potencial medidos diferenças no movimento de células do trofoblasto. Usados em conjunto, estes ensaios in vitro são métodos simples e eficazes que podem ser usados para identificar os caminhos celulares que regulam a migração do trofoblasto. Conforme descrito acima, as células do trofoblasto podem ser tratadas com hormonas, citocinas, fatores de crescimento ou outras moléculas para det...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores agradecer Dr. Gil Mor para fornecer as células Sw.71. Esta pesquisa foi apoiada por um Albert McKern Scholar Award para S.W.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,4% de mancha azul de tripanoThermo Fisher Scientific15250-061
0,5% de tripsina-EDTALife Technologies15400-054
1,0 M HEPESAmericanBioAB06021-00100
10 mM Aminoácidos não essenciais MEMLife Technologies11140-050
100 mM piruvato de sódioLife Technologies11360-070
Inserções de transwell de placa de 24 poçosCorning3422Contêm filtros de policarbonato com um 8 μ m tamanho dos poros
Carvão dextrano FBSGemini Bio-Products100-119
Contador de Células Automatizado Countess IIThermo Fisher ScientificAMQAX1000
Cristal VioletaSigma AldrichC0775
Cytoseal 60Thermo Fisher Scientific8310-4
Dexametasona (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-metil-11β, 17, 21-triol-3, 20-diona; ≥ 98% TLC)EsteralóidesP0500-000
DMEM / Presunto ' s F12Life Technologies11330-032
Soro Fetal BovinoSigma AldrichF2442
IncuCyte Placas ImageLock de 24 poçosEssen BioScience4365Se estiver usando o sistema de imagem IncuCyte Zoom, semeie as células nas placas IncuCyte ImageLock. Essas placas têm marcadores fiduciais na parte inferior da placa que são usados como referência para imagens repetidas em um campo de visão constante.
Software IncuCyteEssen BioScience2010A Rev2
Sistema IncuCyte ZOOM EssenBioScienceN/AAs imagens do ensaio Scratch foram capturadas e analisadas usando a predefinição " Ferida de arranhão" parâmetros no sistema IncuCyte ZOOM. Outros microscópios de lapso de tempo também podem ser usados.
Matriz de Membrana MatrigelBecton Dickinson356231Fator de crescimento reduzido, livre de vermelho de fenol
Micro SlidesVWR International, LLC48311-7003
Vidro de cobertura do microscópioFisher Scientific12-545-E
Microscópio invertido Olympus IX71OlympusIX71
Penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 µ g / mL)Life Technologies151-40-122
Sem fenol vermelho DMEM / Ham's F12Life Technologies11039-021
Ferramenta semiautomática para fabricação de feridasEssen BioScienceN / A

Referências

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  14. Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 12, Unit 12 18 (2004).

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