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Nota: Uma visão geral de todo o processo MEMA, incluindo o tempo estimado, é descrita no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. Este protocolo detalha a fabricação de MEMAs em placas de 8 poços. O protocolo pode ser adaptado para outras placas ou lâminas.
1. preparação de buffers de proteína, diluente e coloração
- Equilibrar frascos de ECMs, ligantes e citocinas à temperatura ambiente (RT) e centrifugar brevemente. Adicione o volume apropriado do buffer RT apropriado, conforme indicado na folha de dados do produto. Siga a recomendação do fabricante para concentrações de ações.
Nota: Uma lista completa dos ligantes e ECMs com suas ações e concentrações finais são fornecidas na tabela 1 e na tabela 2. Os ligantes e os ECMs são usados tipicamente na concentração a mais elevada da escala recomendada pelo fabricante que provoca um efeito biológico em ensaios padrão da cultura de 2 dias. Manuseie as proteínas suavemente e em armários de biossegurança fluxo laminar para evitar a contaminação.
- Incubar frascos com balanço suave em RT para 1 h. Não vórtice proteínas como isso pode causar-lhes a desnaturar.
- Proteínas alíquotas para armazenamento de longo prazo para que todas as alíquotas sejam de uso único apenas para evitar a degradação com ciclos repetidos de congelamento/descongelação. Armazene as proteínas liofilizadas a-80 ° c (salvo indicação em contrário) até que seja necessário. Tome cuidado para coletar todos os metadados para referência futura, tais como: (i) nome da proteína, (II) data preparada, (III) número lote/lote, (IV) fornecedor, (v) número do catálogo, (vi) concentração, (VII) volume, e (VIII) preparador.
- Prepare o tampão diluente contendo 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 e esterilizar filtro. Mantenha este tampão estéril e armazene em RT.
- Prepare o tampão de coloração contendo 2% (p/v) BSA, 1 mM MgCl2e 0, 2% Nan3 em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Filtrar e armazenar a 4 ° c.
2. preparação de uma placa de origem ECM
- Remova estoques aliquotados de proteínas ECM a serem impressos e descongelar no gelo. Registre todos os números de lote para rastreamento de metadados.
- Flick tubos de proteínas descongelados suavemente para garantir a ressuspensão adequada e girar para baixo em uma centrífuga.
-
Faça misturas de impressão ECM (EPMs) e uma fonte fluorescente para ser usada por um robô de manuseio de líquidos que criará as placas de origem 384-well aleatórias.
Nota: as placas de fonte 384-well serão usadas por uma impressora da disposição do pino do toque para criar as matrizes impressas em 8 placas do poço.
- Rotule tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada EPM e o
- Prepare cada EPM combinando 125 μL de tampão diluente (ver passo 1,4) com o volume adequado de estoque de ECM e leve a mistura até um volume total de 250 μL com PBS. As concentrações finais em cada tubo EPM serão 1x proteína ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol, e 100 mM Tris.
- Prepare uma solução fluorescente, dissolvendo-a no tampão apropriado especificado pelo fabricante e transfira 250 μL para um tubo de transmissão rotulado.
3. criação da placa de origem usando um manipulador de líquidos
- Projete um layout de placa 384-well que randomize as posições dos ECMs e seja otimizado para a cabeça do pino da impressora matriz que está sendo usada. Projete a colocação do material de forma que ele será impresso na linha 1, coluna 1 posição de cada poço para auxiliar na orientação da matriz.
Nota: Um total de 14 − 15 repetições de cada ECM é usado para assegurar dados robustos. Inclua réplicas adicionais de colágeno ou outro ECM que produz um acessório robusto para avaliação da uniformidade de ligação. O layout pode precisar utilizar várias placas 384-well, dependendo do número de ECMs de interesse.
- Transfira tubos EPM para um manipulador líquido, mantendo os tubos a 4 ° c com um rack de tubo resfriado ou usando um robô de manuseio de líquidos localizado em uma sala fria.
- Usando o software do manipulador de líquidos, execute um programa para transferir 15 μL de cada EPM e a base para os poços pré-designados dentro da placa de origem 384-well (s).
- Pipet PBS em qualquer poços não utilizados para aumentar a umidade e proteção contra a dessecação durante o processo de impressão.
Nota: Consulte a Figura 2 para obter um exemplo de um conjunto de placas de origem 384 bem otimizado para uma cabeça de pino de 4 x 7 e inclui um bloco de colágeno I e PBS.
- Placa (s) de vedação e mantenha a 4 ° c até estar pronto para imprimir.
4. imprimindo MEMAs usando um robô de impressão de matriz
Nota: A parte seguinte do protocolo descreve especificamente a preparação e o uso de MEMA para investigar o impacto de diferentes proteínas do microambiente no crescimento e proliferação de células MCF7. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para usar diferentes ligantes, ECMs e células para estudar outras linhas celulares e pontos de extremidade de interesse.
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Usando uma impressora de pinos de toque, imprima EPMs e pontos de identificação em 8 placas de poços. Imprima várias repetições de cada condição de ECM para garantir a reprodutibilidade.
Nota: outros formatos de chapa ou lâminas podem ser usados para impressão, mas a otimização de buffer pode ser necessária para alcançar a formação ideal do ponto.
- Imprima os ECMs para o MEMA usando pinos do diâmetro de 350 μm arranjados em uma configuração da cabeça de cópia 4 x 7. Imprima as matrizes nas placas de 8 poços como 20 colunas por 35 linhas, para um total de ~ 700 pontos. As matrizes maiores são possíveis nestas placas mas vêm com um trade-off de efeitos aumentados da borda na ligação e na mancha da pilha.
- Após a impressão, guarde as chapas num dessecador durante um período mínimo de 3 dias antes da utilização.
5. criação de placas de tratamento de ligantes
- Projete uma disposição da placa do 96-well que inclui ligantes do interesse. Para facilitar o tratamento de muitas placas MEMA ao mesmo tempo, projetar esta placa com espaçamento que permite o uso de um Pipet multi-canal com 4 pontas espaçadas para transferir líquidos entre os poços de 8-bem MEMAs e uma placa 96-well.
Nota: Neste protocolo, são utilizados o conjunto completo de ligandos listados na tabela 2 .
- Thaw ligantes no gelo. Momentaneamente Flick e gire para baixo cada tubo.
- Diluir os ligantes para um estoque de trabalho de 200x usando o buffer recomendado pelo fabricante (tipicamente PBS).
- Pipet 10 μL de cada estoque do ligante 200x no poço correspondente dentro da placa 96-well.
- Selar e armazenar chapas a-20 ° c.
Nota: Faça placas de tratamento de ligantes em lotes, capturando todos os metadados para análise a jusante.
6. cultivando células em MEMAs
- Bloco MEMAs por 20 min com 2 mL por poço de tampão de bloqueio não incrustante contendo 1% de agente de bloqueio não incrustante (tabela de materiais) em água destilada dupla (DDH2O).
- Aspirar o tampão de obstrução e os poços triplos da enxaguadura com PBS. Para evitar a dessecação, deixe o volume final de PBS em poços até estar pronto para a plaqueamento celular.
Nota: É extremamente útil ter dois trabalhadores do banco para etapas da cultura da pilha em MEMAs. Um trabalhador do banco pode executar etapas da aspiração, quando o segundo executar etapas da adição. Recomenda-se usar um Pipet multicanal de 1 mL com pontas espaçadas para coincidir com a placa de 8 poços para pipetagem e um divisor de Y com duas pipetas Pasteur para aspirar vários poços de uma só vez.
- Sementes 2 x 105 MCF7 células por poço em 2 ml de Dulbecco ' s modificado médio de Eagle ' s médio (DMEM) contendo 10% soro fetal bovino (FBS).
Nota: Antes de um experimento MEMA completo, realize uma experiência de titulação de célula para otimizar números de células, de forma que os pontos MEMA tenham números de células altas (mas não são confluentes) no final da duração experimental desejada.
- Após 2 − 18 h de adesão, aspirado a meio e substituir com 2 mL de meio de crescimento reduzido (DMEM com 0,1% FBS).
Nota: Soro reduzido (por exemplo, 0,1% FBS) ou condições de fator de crescimento empobrecido podem ser usados neste momento para isolar o impacto estimulatório de ligantes específicos.
- Descongelar uma placa de tratamento de ligantes no gelo. Placa de centrifugação descongelada a 200 x g durante 1 min.
- Transferir 200 μL de meio de cada poço na placa de cultura para o poço adequado na placa de tratamento. Pipet para cima e para baixo para misturar o volume do ligante com o meio e para transferir esta mistura de volta ao poço apropriado na placa de Mema.
- Levemente rocha à mão e devolva as placas MEMA à incubadora. Cultura para a duração do experimento na presença da combinação ligand/ECM a 37 ° c e 5% CO2.
Nota: Um experimento MEMA típico é executado por 72 h; os experimentos de longa duração podem requerer a reposição de meio e retratamento com ligantes.
- Os poços MEMA do pulso em 71 h com 100x 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) para uma concentração final de 10 μM. Incubar em condições experimentais com EdU para 1 h em 37 ° c e 5% CO2.
Nota: Outros tratamentos de células ao vivo também podem ser usados neste momento.
7. fixação e coloração MEMAs
- Após 72 h e quaisquer tratamentos de células ao vivo, aspiram poços. Fix MEMAs em 2 mL por poço de 2% paraformaldeído (PFA) por 15 min em RT.
- Aspirar a PFA. Permeabilize com 2 mL por o poço do surfactante nonionic de 0,1% por 15 minutos.
- Aspirar o surfactante não iônico e lavar com 2 mL por poço de PBS. Aspirar PBS. Lave com 2 mL de PBS com 0, 5% de polissorbato 20 (PBS-T).
Nota: A superfície de MEMA é hidrofóbica, e a falha lavar com PBS-T antes que a incubação da mancha e do anticorpo conduzirá à formação de vazios nos poços durante etapas da incubação e dê origem aos artefatos de coloração.
- Aspirar PBS-T. Adicionar reagentes de reação de detecção EdU. Incubar por 1 h em RT, balançando e protegido da luz. Após 1 h incubação, saciar a reação com o tampão de têmmata comercial fornecido.
Nota: A deteção de EdU e as etapas da mancha/anticorpo podem ser executadas em 1,5 mL por o poço para reduzir o custo.
- Aspirar o tampão de têmmata e lavar com PBS-T antes de incubação com manchas ou anticorpos.
- Incubar os poços de MEMA com anticorpos contra a histona H3K9me3 (1:1000) e fibrillarina (1:400) em tampão de coloração contendo 2% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA), 1 mM MgCl2 e 0, 2% Nan3 durante a noite a 4 ° c.
Nota: Realize titulações de anticorpos para determinar as concentrações ideais antes de usá-las em um conjunto MEMA completo.
- Após a incubação preliminar do anticorpo ou da mancha, lave os poços 2x com PBS e uma vez com PBS-T.
- Adicionar anticorpos secundários (asno anti-rato IgG e asno anti-coelho IgG, ambos 1:300) e 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Incubar por 1 h na RT no escuro.
- Lave os poços 2x com 2 mL por poço de PBS, deixando-os no final 2 mL PBS.
- Proceda à imagem ou armazene MEMAs manchadas para a imagem latente mais atrasada no PBS em 4 ° c protegido da luz.
8. imagem latente de MEMAs
- Imagem MEMA em um sistema automatizado da imagem latente com os canais de deteção fluorescentes apropriados.
- Saída de dados de imagem resultante para um sistema de gerenciamento de imagem. Segmentar células e calcular níveis de intensidade usando o CellProfiler8.
9. análise de dados
Nota: A análise de dados consiste em normalização, correção de variação e compactação dos dados brutos do CellProfiler. Nesta instância, o R-Environment com código personalizado é usado para executar todas as etapas. No entanto, qualquer ambiente estatístico ou programa de software pode ser utilizado para executar as ações equivalentes. Um exemplo do código personalizado de fonte aberta para o ambiente de R para análise está disponível em: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Pré-processar e normalizar os dados de imagem segmentada.
- Determine a contagem de células Spot usando os núcleos corados DAPI.
- Intensidade de EdU de porta automática para rotular células como EdU+. Medir a proliferação usando a proporção de células EdU+ em cada local.
- A mediana resume as manchas citoplasmáticas e as medições da morfologia nuclear no nível Spot.
- Realize a remoção da normalização indesejada de variação (RUV) nos dados para melhorar a qualidade dos dados9.
Nota: Essa abordagem é aplicada a cada sinal de intensidade e morfologia independentemente como uma matriz com matrizes usando as linhas e pontos como as colunas como descrito anteriormente9.
- Aplique a normalização de loess bivariada aos resíduos normalizados RUV usando a linha de matriz e a coluna de matriz como as variáveis independentes para corrigir efeitos espaciais ou de intensidade relacionados.
- Uma vez que a normalização é terminada, a mediana resume as repetições para cada condição do microambiente para relatar e uma análise mais aprofundada.