Este artigo fornece um método para isolar tecidos embrionários puros de codorna e galinha de embriões que podem ser combinados para formar ex vivo de órgãos quimérico.
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Artigo de método
Isolamento de tecidos embrionários e formação de órgãos quiméricoes codorna-frango, usando o exemplo do Timo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A capacidade de isolar tecidos embrionários foi um passo essencial para o estabelecimento do sistema de codorna-frango Quimera, que por sua vez tem proporcionado contribuições indiscutível para desvelar processos-chave na biologia do desenvolvimento.
Aqui é descrito um método otimizado para isolar tecidos embrionários de codornas e galinhas por microcirurgia e digestão enzimática, preservando suas propriedades biológicas. Após o isolamento, os tecidos de ambas as espécies são associados em um ensaio in vitro de organotypic para 48 h. codorniz e tecidos de frango podem ser discriminados por distintas características nucleares e marcadores moleculares, permitindo o estudo da Cruz-conversa entre celulares heterospecific Associação dos tecidos. Esta abordagem é, portanto, uma ferramenta útil para estudar interações do tecido complexo em processos de desenvolvimento com modificações espaciais altamente dinâmicas, tais como os que ocorrem durante a morfogênese da faringe e a formação do foregut órgãos derivados endoderme. Esta abordagem experimental foi desenvolvida para estudar as interações epitelial-mesenquimal durante os estágios iniciais de formação do timo. Neste, a endoderme-derivado rudimento prospectivo do Timo e derivados mesoderme mesênquima, foram isoladas a partir de embriões de codorna e galinha, respectivamente.
A capacidade dos tecidos associados para gerar órgãos pode ser ainda mais testada por enxertia-los para a membrana corioalantoicas (CAM) de um embrião de galinha. O CAM fornece nutrientes e permite trocas gasosas aos tecidos explantados. Após 10 dias de no desenvolvimento do ovo, os órgãos quiméricoes podem ser analisados nos explantes colhidos pelos métodos convencionais de morfológicos. Este procedimento também permite estudar as contribuições específicas do tecido durante a formação do órgão, de seu desenvolvimento inicial (desenvolvimento in vitro) para as etapas finais da organogênese (no desenvolvimento do ovo).
Finalmente, o método de isolamento melhorada também fornece tridimensional (3D) preservado tecidos embrionários, que também podem ser usados para análise topográfica de alta resolução de padrões de expressão gênica-tecido-específica.
Introdução
Na década de 1970, um sistema de Quimera de codorna-frango elegante foi desenvolvido por Le Douarin, abrindo novas vias para compreender o papel da migração celular e interacções celulares durante o desenvolvimento,1,2. O modelo foi concebido na premissa de que troca de células entre as duas espécies não incomodaria significativamente a embriogênese, confirmada mais tarde quando costumava estudar inúmeros processos de desenvolvimento, incluindo a formação do sistema nervoso e o hematopoiéticas sistemas de1. Tomando este último como um exemplo, as ondas cíclicas de progenitores hematopoi....
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Protocolo
Todas estas experiências sigam os cuidados com animais e diretrizes éticas do Centro Académico de Medicina de Lisboa.
1. fertilizados incubação de ovos de codorna e galinha
- Lugar fertilizado ovos de codornas japonesas (Coturnix japonica coturnix) numa incubadora umidificado de 38 ° C durante 3 dias. Incube os ovos (fim brusco do ovo) virada para cima na câmara de ar.
Nota: O ambiente umidificado é conseguido colocando um recipiente de água na parte inferior da incubadora. - Incube os ovos fertilizados de galinha (Gallus gallus) 2,5 dias numa incubadora umidificado de 38 ° C. Incubar os ovos na posição ....
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Resultados
O protocolo detalha um método para isolar tecidos embrionários aviária para ser usado em várias abordagens técnicas de biologia celular e do desenvolvimento. Este método foi empregado anteriormente para estudar interações epitelial-mesenquimal durante as fases iniciais de Timo formação5. Neste documento, novos resultados são mostrados na Figura 1 e Figura 2, usando abordagens semelhantes.
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Discussão
O procedimento de isolamento de tecido embrionário detalhado aqui foi melhorado de técnicas anteriores para produzir embriões quiméricoes de codorna-frango em diferentes contextos biológicos3,5,6.
Essa abordagem é apropriada isolar tecidos embrionários puros sem a necessidade de manipulação genética ou o uso de marcadores de tecido-específica, que muitas vezes são indeterminadas, limitando o uso de mo.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores são gratos à Isabel Alcobia para a leitura crítica do manuscrito, a Mário Henriques para a narração e para Vitor Proa do serviço de histologia do Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, para suporte técnico. Estamos particularmente agradecidos a Paulo Caeiro e Hugo Silva da Unidade de audiovisuais (unidade do Audiovisual), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa para seu compromisso excepcional para a produção deste vídeo. Reconhecemos a Leica Microsystems para gentilmente fornecendo um estereoscópio equipado com um sistema de vídeo e a Interaves - Sociedade Agro-Pecuári....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ovos fertilizados com galinha (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Fazenda avícola | |
| Ovos fertilizados com codornas (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| Tubos de centrífuga PP de 15 mL Tubos de centrífuga de PP de 15 mL | Corning | 430052 | |
| Tubos de centrífuga PP de 50 mL Corning | 430290 | ||
| Pratos de pirex de 60 x 20 mm | Grupo Duran 21 | 755 41 | |
| Pratos de pirex de 100 x 20 mm | Grupo Duran | 21 755 48 | |
| Grade de metal | Goodfellows | de malha fina grade de aço inoxidável | |
| Filtro de membrana | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore |
| Placa de Petri, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Tigelas de pirex de 60 x 30 mm (tamanho pequeno) | do supermercado | ||
| Tigelas de pirex de 100 x 50 mm (tamanho grande) | do supermercado | ||
| Pipetas de transferência | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | mL pipeta de plástico |
| Pipeta de pasteur de vidro | Normax | 5426015 | |
| Fita | de supermercado | ||
| Citoqueratina (pan; ácida e básica, citoqueratinas tipo I e II), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Pancreatina | Sigma-Aldrich | P-3292 | Prepare uma solução de 25 mg/mL de acordo com as instruções do fabricante; centrifugue e filtre antes da aliquote e armazene a -20&C. As alíquotas podem ser mantidas congeladas por vários anos. |
| Paraformaldeído | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| anticorpo QCPN | Estudos de desenvolvimento Banco de hibridoma | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, suplemento GlutaMAX | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Kit de Elastômero de Silicone 1.1Kg | ELKEM/Silmid | RH141001KG | Para preparar a base traseira para placa de Petri |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Pinça fina |
| Tesoura Bonn extra fina, curvada | Ferramentas de Ciência Fina | 14085-08 | Tesouras curvas Alfinetes de |
| insetos | Ferramentas de Ciência Fina | 26001-30 | 0.3 mm Pino de aço inoxidável |
| Micro espátula | Fine Science Tools | 10087-12 | Colher de transplante |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | 0,2 mm Microbisturi de aço inoxidável |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Microbisturi de aço inoxidável |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science | Tools 26016-12 | Suporte de pino niquelado |
| Moria Colher perfurada | Ferramentas de Ciência Fina | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Tesoura de Olho | Ferramentas de Ciência Fina | 15010-11 | |
| Câmera | Leica Microsystems | MC170 | |
| Leica Microsystems | DM2500 | ||
| NanoZoomer S360 Digital scanner de slides | Estereoscópio Hamamatsu Photonics | C13220-01 | |
| Leica Microsystems | Leica M80 |
Referências
- Le Douarin, N. The Nogent Institute--50 years of embryology. The International Journal of Developmental Biology. 49 (2-3), 85-103 (2005).
- Le Douarin, N. M., Teillet, M. A. The migration of neural crest cells to t....
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