Um simples ensaio de medição da ATP e método de coloração ao vivo/morto foram usados para quantificar e Visualizar Neisseria gonorrhoeae sobrevivência após o tratamento com ceftriaxona. Este protocolo pode ser estendido para examinar os efeitos antimicrobianos de qualquer antibiótico e pode ser usado para definir a concentração inibitória mínima dos antibióticos em biofilmes bacterianos.
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Artigo de método
Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos
Neste artigo
Resumo
Resumo
O surgimento de resistentes aos antibióticos Neisseria gonorrhoeae (GC) é uma ameaça para a saúde no mundo e destaca a necessidade de identificar as pessoas que não o tratamento. Esta bactéria Gram-negativa causa a gonorreia exclusivamente em seres humanos. Durante a infecção, é capaz de agregados de forma e/ou biofilmes. O teste de concentração inibitória mínima (CIM) é usado para determinar a susceptibilidade aos antibióticos e definir o tratamento adequado. No entanto, o mecanismo de erradicação em vivo e sua relação com os resultados de laboratório não são conhecidos. Foi desenvolvido um método que examina como GC agregação afeta a susceptibilidade aos antibióticos e mostra a relação entre tamanho de agregação e suscetibilidade aos antibióticos. Quando agregado de GC, são mais resistentes ao antibiótico matar, com bactérias no centro sobrevivendo ceftriaxona tratamento melhor do que aqueles na periferia. Os dados indicam que a agregação de N. gonorrhoeae pode reduzir sua susceptibilidade à Ceftriaxona, que não é reflectida usando os métodos MIC de baseados em placa de ágar padrão. O método utilizado neste estudo permitirá aos pesquisadores testar susceptibilidade bacteriana em condições clinicamente relevantes.
Introdução
Gonorreia é que um comum sexualmente transmissíveis infecção (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), uma bactéria Gram-negativa de diplococcal, é o agente causador da doença. Sintomas de infecção genital podem resultar em dor durante a micção, dor genital generalizada e descarga uretral. Infecção é frequentemente assintomática2,3,4,5, e isto permite a colonização estendida. Estas infecções não tratadas são uma preocupação de saúde importantes, como eles têm o potencial para facilitar a transmissão do organismo e ....
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Protocolo
1. manutenção de cepas de GC
- Raia de cepas de N. gonorrhoeae em ágar GCK com 1% Kellogg suplementos18 (tabela 1, tabela 2) dos estoques de congelador e incubar a 37 ° C com 5% de CO2 para 16-18 h. uso MS11 expressando Opa de fase variável (MS11Opa +), nenhuma Opa (MS11ΔOpa), ou um LOS truncado (MS11ΔLgtE).
- Escolha cuidadosamente pili negativo (colônia sem borda escura) ou positivo (colônia com borda escura) colónias de cada estirpe baseado na colônia morfologia19 usando um microscópio de luz dissecação e raia em uma nova placa GCK.
- Incube a 37 ° C com 5% ....
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Resultados
Foram utilizados dois métodos: um ensaio de utilização do ATP e um ensaio de coloração ao vivo/morto. Os resultados podem ser combinados ou usados individualmente pela análise de sobrevivência bacteriana dentro agregados após tratamento com antibióticos. O ensaio de utilização de ATP foi mostrado para medir com precisão viáveis bactérias S. aureus biofilmes20,21. Aqui, MS11Opa + Pil + estirpe foi usado para examinar o pap.......
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Discussão
As bactérias podem formar biofilmes durante a infecção do organismo humano. Teste de MIC tradicional pode não refletir a concentração necessária para erradicar as bactérias em um biofilme. Para testar os efeitos de agentes antimicrobianos em um biofilme, métodos baseados em biomassa de biofilme, bem como do chapeamento CFUs podem ser errôneos devido ao impacto da estrutura do biofilme. Por exemplo, o método de chapeamento só funciona se o biofilme pode ser interrompido. Daí, o UFC obtida pode ser menor que o número real .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma concessão do Instituto Nacional de saúde para a Premier e W.S. AI123340. L.-CW, J.W., ar-condicionado, e E.N. foram apoiados em parte/participação no programa de "O primeiro ano inovação & pesquisa experiência" financiado pela Universidade de Maryland. Os financiadores não tinham qualquer papel no estudo design, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Reconhecemos o UMD CBMG Imaging Core para todos os experimentos de microscopia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 100x suplemento | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxona | TCI | C2226 | |
| Difco GC base média | BD | 228950 | |
| Nitrato férrico, nonahidratado | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamina Pó Cristalino | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight coloração viva/morta | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Cepa | gentilmente fornecida pelo Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Pesquisa | ||
| Fosfato de potássio dibásico (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Cloreto de sódio (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Amido solúvel | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Pirofosfato de tiamina | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipamento | |||
| Placas de Petri | VWR | 25384-302 | |
| 8 poços câmara de fundo de lamínula | de | Thermo Fisher Scientific | |
| Corning, Falcon | 3370 | ||
| Gabinete de Biossegurança (NU-425-600 Classe II, Capuz de Risco Biológico de Fluxo Laminar A2) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubadora | Fisher Scientific | Microscópio confocal modelo 3530 | |
| equipado com câmara de imagem ao vivo | Leica | SP5X | |
| Corning Microplaca de Poliestireno Preto de 96 Poços | Iluminador Corning | 3904 | |
| Glomax | Pontas de pipeta Promega | E6521 | |
| (0.1-10 µ L) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Ponteiras de pipeta (1000 µ L) | VWR | 83007-382 | |
| Ponteiras de pipeta (200 µ L) | VWR | 53509-007 | |
| Espectrofotómetro Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Tubos cónicos estéreis de 15 ml | VWR | 21008-216 | |
| Tubos de microcentrífuga estéreis (1,7 ml) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Aplicadores estéreis com ponta de poliéster | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivalente a 9110001 |
Referências
- CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm (2017).
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorr....
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Reimpressões e permissões
