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Artigo de método

Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

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⸱

DOI:

10.3791/58996

⸱

5 de fevereiro de 2019

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern Denmark

Neste artigo

Resumo

Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no Ácido desoxirribonucleico (DNA). Este protocolo descreve como fazer o mutagenesis local-dirigido com um 2-passo e passo 3-cadeia da polimerase (PCR) com base em abordagem, que é aplicável a qualquer fragmento de DNA de interesse.

Resumo

Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no DNA para investigar a interação entre pequenas moléculas de ácido ribonucleico (sRNA) não-codificantes e alvo mensageiro RNAs (mRNAs). Além disso, mutagenesis local-dirigido é usado para mapear locais obrigatórios de proteína específica de RNA. Uma introdução de PCR com base em etapas 2 e 3-etapa de mutações é descrita. A abordagem é relevante para todas as proteínas-RNA e estudos de interação RNA-RNA. Em suma, a técnica baseia-se na elaboração de cartilhas com o mutation(s) desejado e através de 2 ou 3 passos de PCR sintetizar um produto PCR com a mutação. O produto do PCR é usado para clonagem. Aqui, descrevemos como executar o mutagenesis local-dirigido com a abordagem de 2 e 3 passos para introduzir mutações a sRNA, McaS e o mRNA, csgD, para investigar o RNA-RNA e RNA-proteína interações. Podemos aplicar esta técnica para investigar interações de RNA; no entanto, a técnica é aplicável a todos os estudos de mutagênese (por exemplo, interações DNA-proteína, amino-ácido adição/exclusão/substituição). É possível introduzir qualquer tipo de mutação exceto bases não-natural, mas a técnica só é aplicável se um produto PCR pode ser usado para aplicação a jusante (por exemplo, clonagem e modelo para mais de PCR).

Introdução

DNA é muitas vezes referida como a estrutura de uma célula viva, uma vez que todas as estruturas da célula são codificadas na sequência de seu DNA. Replicação exata e mecanismos de reparo do DNA certifique-se de que só muito baixas taxas de mutações ocorrem, que é essencial para sustentar as funções corretas dos genes codificados. Alterações da sequência de DNA podem afetar funções sucessivas em diferentes níveis, começando com o DNA (reconhecimento por enzimas de restrição e fatores de transcrição), em seguida RNA (alterações de estrutura secundária e complementaridade de pares de base) e/ou proteínas (amino ácido substituições, supressões, adições ou quadro-turnos). Enquanto muitas mutações não afetam significativamente a função do gene, algumas mutações no DNA podem ter implicações enormes. Assim, o mutagenesis local-dirigido é uma ferramenta valiosa para estudar a importância dos locais específicos do DNA em todos os níveis.

Este protocolo descreve uma abordagem de mutagénese alvo usada para introduzir mutações específicas. O protocolo se baseia em duas diferentes estratégias PCR: um 2-passo ou um passo 3-PCR. Passo 2 PCR é aplicável se a mutação desejada está perto da extremidade 5' ou extremidade 3' do DNA de interesse (< 200 pares de bases (bp) da extremidade) e o PCR do passo 3-é aplicável em todos os casos.

Na abordagem PCR no passo 2, 3 primeiras demão são projetadas, na qual destina-se um conjunto de primers para amplificar o DNA de interesse (primeiras demão 1 e 3, para a frente e reverso, respectivamente), e um único primer é projetado para incorporar a mutação. A mutação, apresentando a primeira demão (cartilha 2) deve ter uma orientação reversa, se a mutação é perto da extremidade 5' e uma orientação para a frente se a mutação está perto da extremidade 3'. Na primeira etapa do PCR, cartilha 1 + 2 ou 2 + 3 amplifica um fragmento pequeno perto da extremidade 5' ou 3' final, respectivamente. O produto resultante da PCR é usado como um primer na etapa dois com primer 1 ou 3, resultando em um produto PCR com uma mutação no DNA de interesse (figura 1A).

No passo 3-PCR, 4 cartilhas destinam-se, na qual destina-se um conjunto de primers para amplificar o DNA de interesse (primeiras demão 1 e 4, para a frente e reverso, respectivamente) e um conjunto de primers é projetado para incorporar mutações específicas com sobreposição de complementaridade (primers, 2 e 3, reverter e encaminhar, respectivamente). Na etapa 1 e 2, as primeiras demão 1 + 2 e 3 + 4 amplificam a extremidade 5' e 3'. No terceiro passo, os produtos resultantes da PCR de passo um e dois são usados como modelos e amplificado com iniciadores 1 + 4. Assim, o produto resultante da PCR é o DNA de interesse com a mutação desejada (figura 1B).

Enquanto o DNA modificado pode ser usado para qualquer aplicação a jusante, este protocolo descreve como re-combinar o DNA em um vetor de clonagem. A utilização de vectores de clonagem tem diversas vantagens tais como facilidade de clonagem e aplicações experimentais específicas dependendo de características do vetor. Esse recurso é usado frequentemente para estudos de interacção de RNA. Outra técnica para estudos de interação RNA está sondando estruturais do RNA em complexo com outro RNA1,2 ou proteína3,4. No entanto, sondagem estrutural só é executada em vitro considerando mutagenesis local-dirigido e clonagem subsequentes permitem estudos de interação in vivo.

Mutagenesis local-dirigido tem sido extensivamente usado para estudos de interação RNA como apresentado aqui. No entanto, o método chave sobre 2 ou 3-passos PCR é aplicável a qualquer pedaço de DNA e, portanto, não apenas limitada a estudos de interação com o RNA.

Para exemplificar a técnica e seus possíveis usos, caracterização de regiões importantes para regulação pós-transcricional do mRNA, csgD, de Escherichia coli (e. coli) é usada. Em e. coli, csgD destina-se a pequeno RNA não-codificante, McaS, em cooperação com uma proteína, Hfq, para reprimir a expressão da proteína de CsgD2,4,5. A técnica é usada para introduzir mutações para a região de base-emparelhamento entre csgD e McaS e o sítio de ligação do Hfq de csgD. O DNA obtido é então clonado em um vetor apropriado para experimentos subsequentes. Aplicações a jusante da técnica incluem experimentos in vivo e in vitro. Para ilustração, exemplo 1 é caracterizado em in vivo usando um ensaio de borrão ocidental e exemplo 2 caracteriza-se in vitro usando um ensaio de turno de mobilidade electrophoretic (EMSA). Em ambos os casos, é ilustrado o mutagenesis local-dirigido como pode ser usado em combinação com outras técnicas para fazer conclusões biológicas sobre um gene de interesse.

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Protocolo

1. seleção do vetor

  1. Escolha um vetor para realizar experimentos a jusante com. Qualquer vetor é aplicável para este método PCR de 2 e 3 passos.
  2. Com base na escolha do vetor, escolha as enzimas de restrição apropriadas para clonagem.

2. projeto primer para site dirigido mutagênese

  1. Decidir entre a estratégia do PCR-passo 2 ou 3 (2-passo é apenas para as mutações < 200 bp de ambas as extremidades do DNA de interesse). Para a PCR 2-passo, vá para o passo 2.2 e para o PCR do passo 3-Vá para o passo 2.3.
  2. Desenho de primers para PCR 2-passo.
    1. Projeto cartilha 1 e 3 para amplificar o DNA de interesse e com uma 5' saliência que contém 4 nucleotídeos (por exemplo, ATAT ou AGCT) seguidos pelo site reconhecimento relevante restrição necessário para clonar no vetor escolhido.
    2. Projeto cartilha 2 introduzir mutation(s) no site desejado e flanquear a mutação com 10-15 nucleotídeos complementares em ambos os lados. Fazer o primer reverso se a mutação é introduzida na extremidade 5' ou encaminhar se a mutação é introduzida na extremidade 3'.
  3. Desenho de primers para PCR de 3 etapas.
    1. Projeto cartilha 1 e 4 para amplificar o DNA de interesse e com uma 5' saliência que contém 4 nucleotídeos (por exemplo, ATAT ou AGCT) seguidos pelo site reconhecimento relevante restrição necessário para clonar no vetor escolhido.
    2. O projeto da primeira demão, 2 e 3 para apresentar mutation(s) no site desejado e flanquear a mutação por 10-15 nucleotídeos complementares em ambos os lados. Cartilha 2 e 3 são inverter complementares.

3. amplificação por PCR selvagem do tipo de DNA para clonagem

Nota: Para obter detalhes sobre o PCR, ver6.

  1. Realizar PCR6 usando as primeiras demão 1 + 2 (2-passo PCR) ou 1 + 4 (passo 3-PCR) e usar o DNA de tipo selvagem como modelo para obter PCR produto eu uso o programa PCR na tabela 1.
  2. Valide o PCR por eletroforese em gel de agarose.
    1. Fazer um agarose gel de solução (2%) pela adição de 2 g de agarose por 100 mL de 1 x Tris-Acetato-ácido etilenodiaminotetracético ácido (EDTA) (TAE) buffer. Dissolva o agarose fervendo em um forno de microondas. Adicionar o DNA de coloração tintura brometo de etídio (para uma concentração final de ~ 0,5 µ g/mL) do gel de agarose a solução para visualização.
    2. Conversão de gel de agarose, colocá-lo em uma unidade de eletroforese e carregar amostras PCR (misturadas com corante de carregamento de DNA) e uma escada de DNA de tamanho conhecido. Execute amostras em 75 W para 45 min, ou até bandas são separadas adequadamente e visualizar as faixas em uma tabela de raios ultravioleta (UV) ou com um gel de sistema de imagem.
  3. Purificar o produto PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
  4. Armazene o DNA purificado a-20 ° C (em tampão Tris-EDTA (TE) – armazenamento de longo prazo) ou a 4 ° C (em dH2O – armazenamento de curto prazo) até usado na etapa 5.

4. PCR apresentar local-dirigido mutações no DNA

  1. PCR para o passo 2 PCR (consulte a etapa 4.2 para o passo 3-PCR)
    1. Realizar PCR6 usando cartilhas 1 + 2, se as mutações são na extremidade 5' ou 2 + 3 se as mutações são em 3' acabar e usar o DNA de tipo selvagem como um modelo para obter o produto do PCR II (ver tabela 1 para o programa PCR).
    2. Valide o PCR por eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
    3. Purificar o produto PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
    4. Loja DNA purificado a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O) até usado na etapa 5.
    5. Realizar PCR6 usando o produto do PCR II como o primer juntamente com a primeira demão 3 se as mutações são na extremidade 5' ou cartilha 1 se as mutações na extremidade 3' e usam o DNA de tipo selvagem como modelo para obter o produto do PCR III (ver tabela 1 para programa PCR).
    6. Valide o PCR por eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
    7. Purificar o produto do PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
    8. Loja DNA purificado a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O) até o passo 5.
  2. PCR para o passo 3-PCR
    1. Realizar PCR6 usando as primeiras demão 1 + 2 e 3 + 4 em reações separadas e usar o DNA de tipo selvagem como modelo para obter o produto do PCR II e III (ver tabela 1 para o programa PCR).
    2. Valide o PCRs por eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
    3. Purificar os produtos de PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
    4. Loja purificado DNA a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O).
    5. Realizar PCR6 usando as primeiras demão 1 + 4 e usar 2-5 ng de ambos os produtos PCR, II e III como os modelos (na mesma reação) para obter o PCR produto IV (ver tabela 1 para o programa PCR).
    6. Valide o PCR por eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
      Nota: Não é incomum obter várias bandas incorretas (às vezes pode ser reduzido pelo uso de menos modelo). No entanto, os produtos PCR incorretos podem ser ignorados se a banda corretamente tamanho é excisada e gel-extraído.
    7. Se correto, purificar o produto do PCR com um kit de extração do gel (Tabela de materiais) e medir a concentração de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais).
    8. Loja DNA purificado a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O) até o passo 5.

5. recombinação de tipo selvagem e mutante versão (ões) do DNA para o vetor escolhido

Nota: Para obter detalhes sobre as etapas a seguir, consulte7.

  1. Digest purificado produtos do PCR I e III (da etapa 2 PCR) e/ou IV (do passo 3-PCR) utilizando as enzimas de restrição relevantes.
    1. Em 20 µ l de tampão de digestão 1x com 1 µ l de cada enzima de restrição, digerir 200 ng do produto do PCR a 37 ° C por 30-60 min.
  2. Purificar o produto PCR digerido por gel-extração usando um kit de extração do gel (Tabela de materiais), medir a concentração de DNA de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais) e armazenar a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2 O) até utilizada para etapa 5.6.
  3. Digerir o vetor purificado com enzimas de restrição relevantes e tratar com a fosfatase alcalina para diminuir o vetor da re-ligadura eventos. Não trate os produtos de PCR com a fosfatase alcalina.
    1. Em 30 µ l de tampão de digestão com 1 µ l de cada enzima de restrição e 1 µ l de fosfatase alcalina, digerir 1.000 ng do vetor a 37 ° C por 30-60 min de 1x.
  4. Vetor digerido separada de resíduos de DNA (por exemplo, vetor sem cortes e recortada DNA) usando a eletroforese em gel de agarose etapa 3.2.1 e 3.2.2.
  5. Purificar o vetor digerido por gel-extração usando um kit de extração do gel (Tabela de materiais), medir a concentração de DNA de DNA purificado com um espectrofotômetro (Tabela de materiais) e armazenar a-20 ° C (em tampão TE) ou 4 ° C (em dH2O) até utilizada para etapa 5.6.
  6. Ligate produtos PCR digeridos em vetor digerido com as reações especificadas na tabela 2.
  7. Incubar a temperatura ambiente por 2 horas ou durante a noite a 16 ° C.
  8. Transforme o destinatário estirpe (por exemplo, Escherichia coli K12) com reações de ligadura.
    1. Crescer a tensão para OD600= 0.3-0.5 e transferência um 1ml cultura para tubos de 1,5 mL como muitos como reações de ligase.
    2. Girar a 3.500 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
    3. Ressuspender as células em 200 μL de tampão de transformação (10 mL de caldo de lisogenia (LB) com 0,1 g/mL polietilenoglicol 3350, 5% dimetil sulfato e 20 mM MgCl2).
    4. Adicionar a reação da ligadura e coloque os tubos no gelo por 30 min.
    5. Calor-choque por 2 min a 42 ° C.
    6. Adicionar 1 mL de LB para os tubos de 1,5 mL e permitir a expressão fenotípica da resistência aos antibióticos pelo menos 45 min a 37 ° C.
    7. Girar as células a 3.500 x g por 5 min, rejeitar 1 mL do sobrenadante e ressuspender as células no sobrenadante restante.
    8. As células em placas com antibióticos apropriados da placa e incubar durante uma noite a 37 ° C.
  9. Identifica transformants abrigar vetores com integração bem sucedida de inserção de DNA (por exemplo, por PCR utilizando primers específicos do vetor e inserção).
  10. Validar a sequência de DNA por sanger sequenciamento.
    Atenção: Não use os mesmos primers para sequenciamento como usado para etapa 5,9.

6. usando vetores construídos para experimentos in vitro ou in vivo

  1. Experimento in vivo
    Nota: Este é um exemplo do uso de um vetor para expressar o tipo selvagem/mutação RNA para caracterizar o Regulamento pós-transcricional. Para mais detalhes sobre a mancha ocidental, ver8.
    1. Crescer estirpes de Escherichia coli K12 com vetores construídos em meio apropriado e induzir a expressão, se necessário. Colheita de amostras por centrifugação.
    2. Preparar amostras para eletroforese em gel poliacrilamida – sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), dissolvendo-se aglomerados de células em tampão de amostra SDS 1x (pH de 62,5 mM Tris-HCl 6,8, 2,5% SDS, azul de bromofenol 0,002%, 5% β-Mercaptoetanol, 10% de glicerol) e ferver a 95 ° C por 5 min.
      Nota: É possível converter um gel ou use um gel pré-fabricado comercialmente disponível. O último foi usado nos resultados apresentados na Figura 3 (Tabela de materiais).
    3. Carregar 107 células de cada amostra em separado wells (incluem uma escada de proteína) e funcione o gel a 200 V, até que as proteínas são separadas (aproximadamente 45 min).
    4. Borre as proteínas para uma membrana de celulose por transferência semi seca em 80 mA por 1h.
    5. Bloquear a membrana com uma mistura de proteínas (por exemplo, 5% leite em pó dissolvido em 1 x Tween 20-Tris-buffered saline (TTBS) buffer).
    6. Adicione o anticorpo primário (dissolvido em 1 x TTBS buffer) que a proteína de interesse (por exemplo, GFP, bandeira ou HIS-etiquetado proteína) de destino e incubar durante 1 h com agitação suave.
    7. Lave a membrana em 1 x TTBS por 10 min para remover anticorpos não acoplados. Repita duas vezes mais.
    8. Adicione o anticorpo secundário (dissolvido em 1 x TTBS buffer) que tem como alvo os anticorpos primários e permitir detecção (por exemplo, com peroxidase de rábano (HRP)-conjugados com anticorpos secundários. Incube durante 1 h com agitação suave.
    9. Lave a membrana em 1 x TTBS por 10 min para remover anticorpos não acoplados. Repita duas vezes mais.
    10. Visualize a membrana com uma técnica compatível com os anticorpos secundários (por exemplo, imagem latente após incubação com uma derivado de luminol quimioluminescência, se utilizou-se um anticorpo secundário conjugado HRP).
  2. Experimento in vitro
    Nota: Este é um exemplo do uso do vetor como um modelo para in vitro a transcrição do RNA para caracterizar as interações RNA-proteína. Para mais detalhes sobre EMSA, consulte9.
    1. Fazer transcrições in-vitro usando um T7 em vitro kit de transcrição (Tabela de materiais) e vetores da etapa 5 como modelos.
    2. Separar os transcritos de RNA por página em uma ureia de 7m 4,5% gel de desnaturação e extrair o RNA diretamente do gel por eluição de electro com tubos de diálise (Tabela de materiais).
    3. Rotular o RNA (por exemplo, radioativos com γ -32P-ATP usando quinase T4-polinucleotídicas (Tabela de materiais) e purificar novamente com colunas (Tabela de materiais).
      Atenção: Antes de trabalhar com material radioativo, consulte-se com o oficial de segurança de radiação local.
    4. Misture rotulados-RNA com concentrações crescentes de proteína nas reações distintas em um tampão de ligação (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1mm ditiotreitol (DTT)) 1x.
      Nota: nos resultados apresentados (Figura 4), 2 nM de radiolabeled csgD mRNA foi misturado com um gradiente de proteína de Hfq 0 a 2 µM (concentração de monômero).
    5. Permitir que a proteína e RNA para cruzar antes de carregar o mix de hibridação em gel de poliacrilamida não-desnaturação e executar o gel para 1,5 h a 200 V.
    6. Visualize o gel com uma técnica compatível com a marcação de passo 6.1.3. (por exemplo, por phosphoimaging se radioativos foi aplicada).
    7. Quantificar a intensidade relativa das bandas deslocadas com uma programa de processamento de imagem e ajustar uma curva (sigmoidal) para os dados usando um gráfico e software de análise de dados (Tabela de materiais). Com base na curva equipada, valores (Kd) constantes de dissociação podem ser determinados automaticamente com o software.

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Resultados

Para investigar interações RNA sobre regulação pós-transcricional do csgD, foi escolhida uma configuração de duplo vetor: um para expressar o csgD mRNA e outra para expressar o pequeno RNA não-codificante, McaS. csgD foi clonado em pBAD33, que é um plasmídeo de médio-cópia inducible arabinose com resistência ao cloranfenicol e McaS foi clonado em mini pNDM220 R1, que é um plasmídeo de cópia baixa inducible isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) com resi...

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Discussão

Mutagenesis local-dirigido tem uma ampla gama de aplicações diferentes, e aqui, resultados representativos de uma in vivo e in vitro experimento foram incluídos como exemplos de como fazer conclusões biológicas usando a técnica. Mutagenesis local-dirigido foi, por muito tempo, o padrão ouro para estudos de interacção de RNA. A força da técnica reside na combinação da introdução de mutações relevantes com a jusante ensaios e experiências (por exemplo, borrão ocidental ou EMSA) para tirar conclusões sobre locais específico...

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Divulgações

Os autores declaram não interesses concorrentes.

Agradecimentos

Os autores gostaria agradecer subsídios de política de acesso aberto de Universidade do Sul da Dinamarca.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo anti-GroEL produzido em coelhoMerckG6532Anticorpo primário
Azure c200AzureNAEstação de trabalho de imagem em gel
Oligo de DNA personalizadoMerckVC00021
DeNovix DS-11DeNovixNAEspectrofotômetro para medições de ácido nucleico
Corante de carregamento de gel de DNA (6X)Thermo ScientificR0611
Solução de brometo de etídio 1% Kit de extração deRoth2218.1
GeneJETThermo ScientificK0691
GeneRuler DNA Ladder MixFermentasSM0333
Gerard GeBAflex-tube MidiGerard BiotechTO12Tubos de diálise para eletroeluição
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAM1334
Mini-Sub Cell GT CellBio-Rad1704406Sistema de eletroforese horizontal
Anticorpo monoclonal ANTI-FLAG M2 produzido em camundongoMerckF3165Anticorpo primário
Imunoglobulinas de camundongoDako CytomationP0447HRP anticorpo secundário conjucado
NucleoSpin miRNAMacherey Nagel740971purificação de RNA
NuPAGE 4-12% Géis de proteína Bis-TrisThermo ScientificNP0323BOXgéis Bis-Tris para separação de proteínas
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix com tampão HFNew England BiolabsM0531SDNA polimerase
PowerPac HC Fonte de alimentação de alta correnteBio-Rad1645052
Rabbit ImmunoglobulinsDako CytomationP0448HRP conjucado anticorpo secundário
SeaKem LE AgaroseLonza50004
SigmaPlotSystat Software IncNAFerramenta de software de análise de gráficos e dados
T100 TermocicladorBio-RadMáquina de PCR1861096
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202Ligase
T4 Polinucleotídeo QuinaseNew England BiolabsM0201S
Tampão TAE (Tris-acetato-EDTA) (50X)Thermo ScientificB49
gel Carl

Referências

  1. Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
  2. Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
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  11. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  12. Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
  13. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
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Reimpressões e permissões

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