Mutagenesis local-dirigido para In Vitro e In Vivo experimentos exemplificados com interações de RNA em Escherichia Coli

Resumo

Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no Ácido desoxirribonucleico (DNA). Este protocolo descreve como fazer o mutagenesis local-dirigido com um 2-passo e passo 3-cadeia da polimerase (PCR) com base em abordagem, que é aplicável a qualquer fragmento de DNA de interesse.

Resumo

Mutagenesis local-dirigido é uma técnica usada para introduzir mutações específicas no DNA para investigar a interação entre pequenas moléculas de ácido ribonucleico (sRNA) não-codificantes e alvo mensageiro RNAs (mRNAs). Além disso, mutagenesis local-dirigido é usado para mapear locais obrigatórios de proteína específica de RNA. Uma introdução de PCR com base em etapas 2 e 3-etapa de mutações é descrita. A abordagem é relevante para todas as proteínas-RNA e estudos de interação RNA-RNA. Em suma, a técnica baseia-se na elaboração de cartilhas com o mutation(s) desejado e através de 2 ou 3 passos de PCR sintetizar um produto PCR com a mutação. O produto do PCR é usado para clonagem. Aqui, descrevemos como executar o mutagenesis local-dirigido com a abordagem de 2 e 3 passos para introduzir mutações a sRNA, McaS e o mRNA, csgD, para investigar o RNA-RNA e RNA-proteína interações. Podemos aplicar esta técnica para investigar interações de RNA; no entanto, a técnica é aplicável a todos os estudos de mutagênese (por exemplo, interações DNA-proteína, amino-ácido adição/exclusão/substituição). É possível introduzir qualquer tipo de mutação exceto bases não-natural, mas a técnica só é aplicável se um produto PCR pode ser usado para aplicação a jusante (por exemplo, clonagem e modelo para mais de PCR).

Introdução

DNA é muitas vezes referida como a estrutura de uma célula viva, uma vez que todas as estruturas da célula são codificadas na sequência de seu DNA. Replicação exata e mecanismos de reparo do DNA certifique-se de que só muito baixas taxas de mutações ocorrem, que é essencial para sustentar as funções corretas dos genes codificados. Alterações da sequência de DNA podem afetar funções sucessivas em diferentes níveis, começando com o DNA (reconhecimento por enzimas de restrição e fatores de transcrição), em seguida RNA (alterações de estrutura secundária e complementaridade de pares de base) e/ou proteínas (amino ácido substituições, supressões, adições ou quadro-turnos).....

Protocolo

1. seleção do vetor

1. Escolha um vetor para realizar experimentos a jusante com. Qualquer vetor é aplicável para este método PCR de 2 e 3 passos.
2. Com base na escolha do vetor, escolha as enzimas de restrição apropriadas para clonagem.

2. projeto primer para site dirigido mutagênese

1. Decidir entre a estratégia do PCR-passo 2 ou 3 (2-passo é apenas para as mutações < 200 bp de ambas as extremidades do DNA de interesse). Para a PCR 2-passo, vá para o passo 2.2 e para o PCR do passo 3-Vá para o passo 2.3.
2. Desenho de primers para PCR 2-passo.
   1. Projeto cartilha 1 e 3 para amplificar o DNA de inter....

Resultados

Para investigar interações RNA sobre regulação pós-transcricional do csgD, foi escolhida uma configuração de duplo vetor: um para expressar o csgD mRNA e outra para expressar o pequeno RNA não-codificante, McaS. csgD foi clonado em pBAD33, que é um plasmídeo de médio-cópia inducible arabinose com resistência ao cloranfenicol e McaS foi clonado em mini pNDM220 R1, que é um plasmídeo de cópia baixa inducible isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) com resi.......

Discussão

Mutagenesis local-dirigido tem uma ampla gama de aplicações diferentes, e aqui, resultados representativos de uma in vivo e in vitro experimento foram incluídos como exemplos de como fazer conclusões biológicas usando a técnica. Mutagenesis local-dirigido foi, por muito tempo, o padrão ouro para estudos de interacção de RNA. A força da técnica reside na combinação da introdução de mutações relevantes com a jusante ensaios e experiências (por exemplo, borrão ocidental ou EMSA) para tirar conclusões sobre locais específico.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-GroEL produzido em coelho	Merck	G6532	Anticorpo primário
Azure c200	Azure	NA	Estação de trabalho de imagem em gel
Oligo de DNA personalizado	Merck	VC00021
DeNovix DS-11	DeNovix	NA	Espectrofotômetro para medições de ácido nucleico
Corante de carregamento de gel de DNA (6X)	Thermo Scientific	R0611
Solução de brometo de etídio 1% Kit de extração de	Roth	2218.1
GeneJET	Thermo Scientific	K0691
GeneRuler DNA Ladder Mix	Fermentas	SM0333
Gerard GeBAflex-tube Midi	Gerard Biotech	TO12	Tubos de diálise para eletroeluição
MEGAscript T7 Transcription Kit	Invitrogen	AM1334
Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-Rad	1704406	Sistema de eletroforese horizontal
Anticorpo monoclonal ANTI-FLAG M2 produzido em camundongo	Merck	F3165	Anticorpo primário
Imunoglobulinas de camundongo	Dako Cytomation	P0447	HRP anticorpo secundário conjucado
NucleoSpin miRNA	Macherey Nagel	740971	purificação de RNA
NuPAGE 4-12% Géis de proteína Bis-Tris	Thermo Scientific	NP0323BOX	géis Bis-Tris para separação de proteínas
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix com tampão HF	New England Biolabs	M0531S	DNA polimerase
PowerPac HC Fonte de alimentação de alta corrente	Bio-Rad	1645052
Rabbit Immunoglobulins	Dako Cytomation	P0448	HRP conjucado anticorpo secundário
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
SigmaPlot	Systat Software Inc	NA	Ferramenta de software de análise de gráficos e dados
T100 Termociclador	Bio-Rad	Máquina de PCR	1861096
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202	Ligase
T4 Polinucleotídeo Quinase	New England Biolabs	M0201S
Tampão TAE (Tris-acetato-EDTA) (50X)	Thermo Scientific	B49

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