Deteção de imunoglobulina Antiaquaporina-4 G de soro humano por ensaio baseados em células

Resumo

Baseada em célula de ensaio é um método amplamente utilizado para detectar imunoglobulina de soro antiaquaporina-4 G. Esse método pode ser aplicado para o diagnóstico clínico e pesquisas científicas de transtornos do espectro óptico Neuromielite.

Resumo

Antiaquaporina-4 (AQP4) Imunoglobulina G (IgG) é o biomarcador de núcleo diagnóstico para transtornos do espectro do Neuromielite optica (NMOSD). O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método amplamente utilizado para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano com alta sensibilidade e especificidade. Brevemente, soro anti-AQP4 IgG é capturado pela célula AQP4-transfectadas que é fixada sobre o biochip então detectada por um anticorpo secundário marcado com fluoresceína. Microscopia de fluorescência é utilizada para visualizar a fluorescência, e a intensidade da fluorescência é avaliada pelo menos dois médicos experientes. Um diagnóstico final de NMOSD pode ser feito com base na combinação de resultados de deteção de IgG anti-AQP4, manifestações clínicas e achados neurorradiológica. De acordo com estudos anteriores, a CBA é mais sensível e específica do que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4, e pode ser aplicada para diagnóstico clínico e estudos de NMOSD. O método tem limitações; por exemplo, a escala internacional para avaliar a concentração de IgG do soro anti-AQP4 é ainda insuficiente. Aqui, um protocolo detalhado para a deteção de IgG anti-AQP4 soro humano usando CBA é descrito.

Introdução

Soro AQP4 IgG é um biomarcador de diagnóstico de núcleo para Neuromielite optica espectro transtornos (NMOSD)¹. O ensaio de baseada em célula (CBA) é um método de deteção de IgG anti-AQP4 amplamente utilizado com alta sensibilidade e especificidade. Aqui, um protocolo detalhado para a CBA é introduzido.

AQP4, uma proteína de canal de água, possui seis unidades de membrana que mede e dois domínios helicoidais em torno um aquosa pore². IgG anti-AQP4 está envolvida na patogênese da NMOSD por meio de ligação ao seu alvo AQP4, que situa-se principalmente sobre o endfeet de astrócitos³. Tem sido demonstrado que IgG anti-AQP4 é positivo em cerca de dois terços dos pacientes NMOSD⁴. Nos mais recentes critérios diagnósticos internacionais para NMOSD, IgG anti-AQP4 é considerado ser um biomarcador diagnóstico do núcleo⁵. A este respeito, é fundamental estabelecer um protocolo confiável para detectar soro humano IgG anti-AQP4 e facilitar o diagnóstico clínico de NMOSD.

Atualmente, vários métodos de deteção de IgG anti-AQP4 estão disponíveis, tais como a CBA, ensaio baseado em tecido, ensaio imunoenzimático e citometria de fluxo^6,7. CBA emprega EU90 células, que são transfected com AQP4 humano, para capturar IgG anti-AQP4. O IgG anti-AQP4 capturado é detectado pelos anticorpos secundários fluorescentes e posteriormente visualizado por microscopia. Acumular evidências tem mostrado que a CBA é mais sensível e específico do que outros anti-AQP4 IgG deteção métodos^6,7. De acordo com uma meta-análise, a sensibilidade e especificidade do CBA foram mostrados para ser de 76% e 99%, que eram superiores baseados em tecido e ensaios de enzima-lig da imunoabsorção⁶. Além disso, uma comparação multicêntrico de ensaios de diagnósticos de IgG anti-AQP4 foi realizado⁷. Um total de 193 estudo sujeitos de 15 centros de diagnósticos europeus foram matriculados⁷. Quatro diferentes métodos foram utilizados para detectar soro de IgG anti-AQP4⁷. Foi demonstrado que a CBA foi mais sensível e específico do que os outros métodos⁷. Como AQP4 é expressa em duas isoformas principais (AQP4-M1 e M23-AQP4), célula de captura de IgG anti-AQP4 é transfectada com AQP4-M1 ou AQP4-M23. No entanto, o tipo de célula de captura é melhor permanece controverso. Uma investigação apoiou AQP4-M1 baseado CBA⁸, enquanto outros têm indicado que AQP4-M23 baseado CBA é melhor^7,9,10. No entanto, CBA AQP4 M23-baseados pode produzir resultados falso-positivos devido a inespecíficos IgG ligação⁸. Jarius et al.. ¹¹ relataram que não houve significativa diferença em taxas de detecção de IgG anti-AQP4 entre AQP4-M1 e CBAs AQP4-M23-baseado.

Em resumo, soro anti-AQP4 IgG é um biomarcador de núcleo para NMOSD. CBA tem maior especificidade e sensibilidade que outros métodos de deteção de IgG anti-AQP4. Permanece controverso se AQP4-M1-AQP4 M23-baseado ou CBA é melhor. Neste artigo, um protocolo detalhado para a CBA AQP4 M1-baseada é descrito, que pode aplicar para o diagnóstico clínico e estudos de NMOSD.

Protocolo

Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de ética da Universidade primeiro Hospital de Jilin e realizou-se em aproximadamente 1.500 indivíduos.

1. se o paciente registro e coleta de amostra de sangue

1. Aplica a detecção laboratorial de soro de que IgG anti-AQP4 aos pacientes da clínica com os principais queixas e sintomas listado abaixo. Realize exames físicos também.
   
   Neurite óptica: pacientes sofrem com déficits visuais, tais como a perda dos campos visuais e redução da acuidade visual.
   Mielite aguda: os pacientes podem apresentar com paralisia, déficits sensoriais e disfunção autonômica.
   Síndrome de área postrema: os pacientes podem ter sintomas de soluços inexplicados, náuseas ou vómitos.
   Síndrome de tronco cerebral aguda: lesões do tronco cerebral podem resultar em diferentes sintomas e sinais físicos, dependendo da localização das lesões.
   Narcolepsia sintomática ou aguda síndrome clínica diencephalic com lesões diencephalic NMOSD-típicas do MRI.
   Síndrome cerebral sintomático com lesões NMOSD-típicas do cérebro.
   
   Nota: De acordo com os critérios de diagnóstico de consenso internacional para NMOSD⁵, um diagnóstico de NMOSD pode ser feita se o paciente é soro anti-AQP4 IgG-positivo e tem pelo menos uma das características clínicas do núcleo acima mencionados. No entanto, não recomendamos teste de IgG anti-AQP4 em pacientes com neurite óptica apenas.
2. Coleta de amostra de sangue
   Nota: pacientes não precisa ser em jejum.
   1. Desenhe 2-3 mL de sangue venoso em um tubo de coleta de sangue do vácuo de 4 mL.
   2. Permitir que o soro coagular por 30 min à temperatura ambiente (RT).
      Nota: Prolongada de coagulação pode aumentar os níveis séricos devido ao escapamento de plaquetas.
   3. Centrifugar 2100 x g por 5 min., cuidadosamente, transferir o soro para um novo tubo.
   4. Analisar o soro imediatamente ou alíquota e armazenar a -20-80 ° c.
      Nota: Armazenamento-20 ° c é para o armazenamento de meses, enquanto a-80 ° C é para o armazenamento de anos.

2. pesquisa de anticorpos anti-AQP4

Atenção: As amostras dos doentes e dos reagentes utilizados devem ser considerados materiais infecciosos. Reagentes contendo azida de sódio no kit são tóxicos. Um gráfico de fluxo do protocolo é fornecido na Figura 1.

1. Preparação
   1. Trazer o kit para RT antes do uso.
      Nota: Armazene o kit de 2-8 ° c.
   2. Preparar pelo menos 200 mL de tampão de lavagem PBS contendo 0,2% Tween 20. Despeje um copo de 500 mL, 100 mL de tampão de lavagem.
   3. Diluir o soro amostras x 10 com tampão de lavagem. Prepare os controles positivos e negativos de acordo com as instruções do distribuidor.
2. Incubação da amostra
   1. Adicione 30 µ l do pre-diluídas amostras, controle positivo, controle negativo ou para os campos de reação da bandeja do reagente (Figura 2).
      Nota: Evite bolhas de ar.
   2. Remova a tampa protetora nas corrediças de biochip.
      Nota: Não toque os biochips para evitar o desprendimento e a contaminação de células fixas. Segure a slide lado a lado antes de remover a tampa.
   3. Aplica o slide de biochip para a bandeja do reagente (Figura 2). Começar uma incubação de 30 min a RT
      Nota: Cada amostra deve ser uma gota individual conectada para o biochip correspondente sem misturar com outras gotículas.
   4. Lave suavemente o slide de biochip que uma vez com o tampão de lavagem. Mergulhe o slide de biochip para o copo de 500 mL preenchido com 100 mL de tampão de lavagem durante pelo menos 5 min. lugar o copo num agitador se possível.
   5. Tire o slide biochip do tampão de lavagem. Cuidadosamente Limpe o tampão de lavagem residual fora os campos de reação com uma toalha de papel. Expor o slide de biochip que ao ar livre por 1-2 minutos evaporar o tampão de lavagem residual no campo de reação.
      Nota: Não seca os campos de reação. Não toque os biochips com toalha de papel.
3. Incubação do anticorpo secundário
   1. Prepare a solução de anticorpo secundário de acordo com as instruções do distribuidor.
   2. Adicione 25 µ l de anticorpo secundário fluorescente para os campos de reação de uma bandeja limpa reagente.
   3. Aplica o slide de biochip para a bandeja de reagente carregada com anticorpo secundário. Incubar durante 30 min à RT.
4. Montagem
   1. Deite fora o tampão de lavagem usado e adicionar 100 mL de tampão de lavagem fresca no copo medidor. Repeti a lavagem como descrito nos passos 2.2.4 e 2.2.5.
   2. Adicione cuidadosamente encastre médio para os campos de reação em um slide de biochip (uma gota por campo de reação). Sele o slide de biochip com um pedaço de vidro de tampa. Evite bolhas de ar.
5. Deteção de fluorescência
   1. Ligue a lâmpada fluorescente do microscópio e pré-aquecimento de 15 min. escolha um filtro de 488 nm.
   2. Software de fotografia aberta. Tire fotos das áreas transfectadas e untransfected de todos os campos de reação com diferentes ampliações. Primeiro, tirar uma foto com ampliação de 4x para uma visão geral e, em seguida, tirar mais fotos com 10x e 20 x de ampliações.
      Nota: O protocolo detalhado é mostrado na tabela 1. Interpretação dos resultados é discutida na seção resultados representativos.

3. o diagnóstico de pacientes

1. Se o paciente é soro anti-AQP4 IgG-positivo e mostra pelo menos uma característica clínica do núcleo de NMOSD (veja a seção de discussão), diagnosticar o paciente com NMSOD⁵. No entanto, se o paciente é anti-AQP4 IgG negativo, o diagnóstico de NMOSD não pode ser excluído.

Resultados

Usando o procedimento descrito aqui, anti-AQP4 específicos IgG no soro é detectável. Durante o procedimento, pre-diluídas amostras, um controle positivo e um controle negativo foram adicionados aos campos de reação, que contêm áreas transfectadas e untransfected (Figura 2). Fluorescência do controlo negativo numa área transfectada indicado principalmente a vinculação não específico do anticorpo secundário às células transfectadas em biochips (

Discussão

Descrevemos um método amplamente acessível para detectar IgG anti-AQP4 no soro humano. IgG anti-AQP4 está intimamente relacionado com NMOSD, e que estabelece um método de deteção de IgG anti-AQP4 confiável é fundamental para o diagnóstico clínico de NMOSD. Primeiro, o IgG anti-AQP4 é específico para NMOSD. Esclerose múltipla é também uma doença imune-mediada do sistema nervoso central e compartilha muitas semelhanças com NMOSD¹². No entanto, o IgG anti-AQP4 só é positivo em NMOSD^...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anti-aquaporina-4 IIFT	Euroimmun	FA 1128-2005-50	Contém lâminas de biochip revestidas com células EU 90 transfectadas e não transfectadas com AQP4-M1, IgG anti-humana marcada com fluoresceína, anticorpo anti-AQP4 como controle positivo, amostra negativa para anticorpo, sal para PBS pH 7.2, Tween 20 e meio de inclusão.
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