Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

Seletiva 2'-hidroxila acilação analisada pela extensão da primeira demão (SHAPE) é um método de medir a cinética de cada nucleotídeo em uma sequência de RNA de interesse e elucidação da estrutura secundária em single-nucleotide resolução¹. Metodologias de forma, tanto em condições in vitro^2,3,4 (RNA purificado em um sistema de buffer definido) e em^5,de células de mamíferos vivos⁶, foram desenvolvidos para investigar o secundário estrutura de sequências de comprimento médio do RNA (tipicamente < 1.000 nucleotídeos para a forma na célula e < 200 nucleotídeos para a forma in vitro). É particularmente útil para avaliar alterações estruturais no receptor RNA mediante ligação a RNA-interagindo pequena molécula metabolitos^2,4,7,8 e estudar ações mecanicistas de moléculas de RNA-direcionamento durante o desenvolvimento de drogas^9,10.

RNA-direcionamento de fármacos recentemente chamou a atenção nos laboratórios acadêmicos e a indústria farmacêutica^11,12 através de diferentes abordagens e estratégias de^{14,13,15 ,16}. Exemplos recentes de pequenas moléculas de RNA-direcionamento para uso clínico incluem duas drogas experimentais estruturalmente distintas, LMI-070¹⁷ e^18,RG-7916¹⁹, para a atrofia muscular espinhal (SMA), que mostrou-se promissora resultados na fase de ensaios clínicos II²⁰. Ambas as moléculas foram demonstrou à sobrevivência de alvo de motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA e regular o processo de emenda do SMN2 gene^6,17,21. Temos demonstrado anteriormente a aplicação da in vitro e na célula forma um exame das mudanças estruturais na presença de um análogo de RG-7916 conhecido como SMN-C2⁶alvo do RNA.

Em princípio, a forma mede a taxa de acilação de 2'-OH de cada nucleotídeo de uma sequência de RNA na presença de quantidades em excesso de um reagente de acilação Self têmpera de forma imparcial. O reagente de acilação não é estável em água, com uma meia-vida curta de (por exemplo, T_1/2 = 17 s para anidrido de 1-metil-7-nitroisatoic; ou 1 M 7, ~ 20 min para imidazolide de ácido 2-methylnicotinic, ou NAI)²² e insensibilidade à identidade da as bases de²³. Isso resulta em uma acilação mais favorável dos grupos de bases flexíveis, que podem ser transformados em uma avaliação correcta da dinâmica de cada nucleotídeo 2'-OH. Especificamente, um nucleotídeo em um par de base é geralmente menos reativo do que um não pareado com um reagente modificando 2'-OH, tais como NAI e 1 M 7.

Olhando para a fonte do modelo de RNA e onde ocorre a acilação de 2'-OH, forma geralmente pode ser categorizada em forma in vitro e na célula. Em usos de vitro forma purificada T7 transcrito de RNA e não possui um contexto celular em projetos experimentais. Em forma na célula, a transcrição de modelo de RNA e a acilação de 2'-OH ocorrerem dentro de células vivas; Portanto, os resultados podem recapitular o modelo estrutural de RNA em um contexto celular. Na célula forma tem sido referida como vivo de forma para forma transportada em células vivas, na literatura²⁴. Desde que esta experiência não é executada em um animal, nós denominado esta experiência como forma na célula para a exatidão.

As estratégias para a fase de extensão da primeira demão de forma in vitro e na célula também são diferentes. Em forma in vitro, a transcrição reversa para na posição 2'-OH acilação, na presença de Mg^{2 +}. Uma extensão da primeira demão de ³²P-rotulados, portanto, aparece como uma banda em eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a intensidade da banda é proporcional à taxa de acilação¹. Em forma na célula, a transcrição reversa gera mutações aleatórias para o 2'-OH aduto posição na presença de Mn^{2 +}. A taxa mutacional de cada nucleotídeo pode ser capturada no sequenciamento de próxima geração de profundidade, e a reatividade de forma em single-nucleotide resolução pode então ser calculada.

Um problema potencial para a forma na célula é a baixa relação sinal-ruído (isto é, a maioria dos grupos 2'-OH é inalterada, enquanto as sequências não modificadas ocupam a maioria da leitura na próxima geração sequenciamento). Recentemente, um método para enriquecer o 2'-OH modificado do RNA, referidos como vivo clique em forma (icSHAPE), foi desenvolvido pelo laboratório Chang²⁵. Este método de enriquecimento pode ser vantajoso no estudo fracas moléculas pequenas tais como interações RNA, especialmente em um interrogatório de transcriptoma-largo.

1. em forma de Vitro

Nota: O protocolo é modificado no protocolo publicado¹.

1. Preparar o modelo de RNA
   Nota: O modelo para a transcrição de T7 foi ordenado como sintético double-stranded DNA (dsDNA) e amplificado por qualquer inserção em um vetor de Escherichia coli que carrega um único par de sites de endonuclease de restrição EcoRI/BamHI, tais como pET28a, ou pelo PCR. O protocolo para amplificação por PCR é ilustrado abaixo.
   1. Misture o seguinte material: 50 μL de mestre PCR mix (ver Tabela de materiais), 2 μL para cada primeira demão em 10 μM (ver tabela 1 para sequências), 200 ng de dsDNA modelo em 2 μL e 3 μL de Dimetilsulfóxido (DMSO) e 41 μL de H₂O. alíquota em dois PCR tubos (cada tubo contém 50 μL de mistura de reação).
   2. Configurar o termociclador da seguinte forma: fase 1) 95 ° C por 30 s; fase 2) 95 ° C por 20 s; fase 3) 56 ° C durante 20 s; fase 4) 72 ° C por 20 s; loop de fase 5) volta para a etapa 2 para 30 ciclos; fase 6) 72 ° C por 3 min; e a fase 7) infinita segurando a 4 ° C até o passo seguinte.
   3. Purificar o amplicon PCR por extracção de fatias do gel (veja Tabela de materiais e usar o protocolo do fabricante). Eluir o produto DNA com 35 μL de tampão Tris-EDTA (TE), contendo 10 mM Tris (pH 8.0) e 1 mM EDTA, para produzir um 0.1-0.5 μg/μL modelo. Normalize o modelo de DNA purificado em 0,10 μg/μL.
      Nota: Opcionalmente, a qualidade do modelo pode ser analisada em uma eletroforese em gel de agarose 1,8% com 0,10 μg de DNA. Espera-se uma única banda de DNA template desejado no gel.
   4. Configurar a reação de transcrição de T7 (volume total 40 μL) adicionando-se os seguintes materiais em um tubo PCR: 4 μL de 10 x 4 μL de ATP, 4 μL de CTP, 4 μL de GTP, 4 μL de UTP, 4 μL da enzima T7, amortecedor da reação (ver Tabela de materiais) , 4 μL de purificado PCR amplicons da etapa 1.1.3 (0,4 μg) e 12 μL de dietilo pyrocarbonate (DEPC)-água tratada. Misture por pipetagem e descer 4 x. Incube a 37 ° C para 4 – 16 h em um termociclador ou numa incubadora 37 ° C.
      Nota: Começa a configurar a etapa 1.1.6 enquanto a reação na etapa 1.1.4 está em curso.
   5. Adicionar 2 μL de DNase, misturar pipetando e descer de 4 x e incubar a 37 ° C durante 15 min. Mix com igual volume de 2 x Tris-borato-EDTA (TBE)-amortecedor da amostra de ureia (ver Tabela de materiais). Aquecer a 70 ° C por 3 min inactivar.
   6. Em um frasco livre de RNase, misturar 75 mL de solução de acrilamida/bisacrylamide 40% (29:1, consulte Tabela de materiais), 180,2 g de ureia e 50 mL de tampão de x TBE 10 (RNase-livres, consulte Tabela de materiais). Coloque a garrafa em um agitador orbital (250 rpm) até que todos os cristais de ureia são dissolvidos (pode levar até 2 h). Ajuste o volume para 500 mL com água tratada DEPC. Filtrar a solução com uma membrana de 0,2 μm (ver Tabela de materiais).
      Nota: Neste processo, evitar usando especulares e agitar-bar para evitar a contaminação de RNase. A solução pode ser armazenada a 4 ° C por até 1 ano.
   7. Limpe duas placas de vidro de electroforese de um tamanho adequado (16,5 x 24 cm) com água desionizada e 70% EtOH, usando um pedaço de papel a limpar. Alinhar as placas com um par de espaçadores de 2,0 mm (a placa com uma superfície siliconizada está enfrentando para dentro) e selar a borda das placas com fita adesiva. Dupla-fita o canto da placa para evitar fugas.
   8. Num copo, misture 200 mL de solução de acrilamida da etapa 1.1.6, 2,0 mL de solução de persulfato de amónio de 10% e 100 μL de tempted (TEMED) com uma ponta da pipeta RNase-livre por agitação rapidamente por 30 s. Tilt as placas em um pedaço de tampa de bancada e despeje a solução da gap das placas. Bata a placa para levantar as bolhas e colocar a placa plana na capa de bancada. Imediatamente inserir o pente e deixe o gel polimerizar pelo menos 1 h.
      Nota: Se o gel é para ser usado dentro no dia seguinte, encobri o topo do gel com um pedaço de papel-toalha e envoltório com uma parte maior de plástico. Coloque-o deitado horizontalmente a 4 ° C.
   9. Remova a fita e prenda a placa em um stand de electroforese. Retirar o pente e adicionar 1 adequada x TBE reserva no topo e no fundo do reservatório. Pre-funcione o gel por 30 min a 20 w.
      Nota: Opcionalmente, se o conteúdo do RNA desejado ~ 90% ou mais, um mini gel pode ser usado em substituição de um gel preparativa.
   10. Cada um dos poços de carregamento lave pipetando para cima e para baixo duas vezes com o líquido no reservatório. Adicione o RNA bruto da etapa 1.1.5 nos poços. Funcione o gel a 20 W até corante xileno cianol FF (luz azul) passa cerca de dois terços do comprimento do gel (~ 60 min).
       Nota: Certifique-se para carregar a não mais de um terço da altura do poço (se necessário, usar vários poços).
   11. Imergir o gel em 1 buffer de x TBE com 1:10,000 de diluição do cofre tingir (ver Tabela de materiais) em um recipiente grande o suficiente para o gel. Colocar o recipiente em um agitador orbital por 5 min a 80 rpm.
   12. Sob a luz UV, identificar a banda desejada do RNA e rapidamente cortar uma faixa fina do gel usando uma lâmina limpa. Coloque fatias de gel de 1 – 2 em um tubo de 1,7 mL.
   13. Recupere o RNA da fatia gel por eluição passiva. Adicione a mistura de eluição/precipitação adequada (~0.3 mL por fatia) para cada tubo: 0.3 M NaOAc (pH 5.2), 2,5 M LiCl, 1 mM EDTA, 0,1% Dodecil sulfato de sódio (SDS) na água tratada DEPC. Gire o tubo que contém o gel de splice(s) a 4 ° C, durante 16 h.
       Nota: Uma taxa de recuperação típica é ~ 75% nesta etapa. Para aumentar o rendimento, remover e recolher o eluente e adicionar o mesmo volume de tampão de eluição, Então repita este passo.
   14. Combine o eluente em um novo tubo de 1,7 mL. Adicionar 2,5 x gelada EtOH, inverter os tubos seis vezes para misturar o líquido e coloque os tubos a-80 ° C durante pelo menos 1 h.
   15. Centrifugar durante 10 minutos a 10.000 x g e 4 ° C. Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem. Lave a pelota do RNA adicionando 80% EtOH (1 mL por tubo), vórtice durante 15 s e centrifugar durante 10 minutos a 10.000 x g e 4 ° C.
   16. Remover o sobrenadante e deixe secar naturalmente a pelota do RNA por 5 min. Adicione 50 μL de água livre de RNase e misture pipetando acima e para baixo 10 vezes. Normalize a concentração de RNA para 0,10 μg/μL. Armazenar o RNA purificado a-80 ° C.
       Nota: Não seque em demasiado a pelota do RNA.
   17. Opcionalmente, para analisar a qualidade do RNA, diluir 1 μL (100 ng) do RNA de passo 1.1.16 em 5 μL de água e misturar com 5 μL de tampão, amostra 2 x TBE-ureia. Então, o calor a 70 ° C por 3 min e carga em um gel mini TBE-ureia de 6%.
       1. Funcione o gel em 180 V para h. 1 executar a coloração como feito na etapa 1.1.11. Visualize o gel com UV em um sistema da imagem latente. Uma única banda é esperada para o comprimento desejado.
2. Preparando a ³²cartilha P-etiquetado
   1. Configurar a reação misturando os seguintes materiais: 10 μL de γ -³²P-ATP (~1.5 mCi, ~ 25 μM, consulte Tabela de materiais), 2 μL de primer de transcrição reversa (RT) (100 μM, para ver de sequência tabela 1), 2 μL da quinase de polinucleotido 10 x T4 (PNK) amortecedor da reação, 1 μL de T4 PNK (ver Tabela de materiais) e 5 μL de água livre de RNase. Incube a 37 ° C, durante 1 h.
      Atenção: Proteção adequada é necessário passos 1,2-1,5 em um local de trabalho autorizado de materiais radioactivos.
   2. Calor-inativar por 20 min a 65 ° C. Adicione as amostras em uma coluna do desalting e centrifugar a 1.000 x g por 1 min. Misture o eluente com 25 μL de tampão de amostra 2x TBE-ureia. .
      Nota: Armazene o produto bruto rotulado a-20 º C se não deve imediatamente ser purificado.
   3. Execute um gel de acrilamida 10% a 20 W por 1h.
      Atenção: Carregar o ³²cartilha P-rotulado de 1.2.1 pisar o gel e evitar sangramento a radioatividade no reservatório superior. Não foi possível carregar mais de um terço da altura do poço para garantir uma banda fina sobre o gel (usar vários poços, se necessário). O líquido do reservatório inferior pode ser altamente radioativo.
   4. Remover as placas de vidro da fita gel e colocar o gel em um pedaço de filme plástico. Dobre o envoltório plástico para cobrir o topo do gel para fazer um sanduíche estanque. Coloque o gel de sanduíche em uma tela de fósforo de tungstato de cálcio e expor com um instrumento de imagem. O gel novamente com luz regular para saber onde estão as bordas do gel da imagem.
   5. Use uma software de processamento de imagem para sobrepor as duas imagens. Alinhe o gel sobre a imagem impressa. Use uma lâmina de barbear fresca para cortar as bandas desejadas fora do gel. Coloque fatias de gel de 1 a 2 em um tubo de 1,7 mL.
      Nota: Certificar-se de que a imagem impressa tem o mesmo tamanho que o gel real. Verifique o alinhamento por imagem o gel sobra novamente após cortar a fatia de gel.
   6. Recupere o primer P-rotulado de ³²seguindo as etapas 1.1.13 para 1.1.16. Leve 1,0 μL da solução num tubo de 0,4 mL e diluir a primeira demão com buffer de TE 1 x para obter a radioatividade de 1,0 μL em cpm de ~ 100.000. Armazene o purificado ³²cartilha P-etiquetadas a-80 ° C até reação de modificação do RNA 2'-OH, mas por não mais que 4 semanas.
3. Ligação de pequenas moléculas e modificação de 2'-OH do RNA
   1. Para preparar quatro amostras, adicione 8 pmol RNA em 32 μL de tampão, TE x 0,5 para um tubo de 1,7 mL, calor a 80 ° C por 2 min e snap-cool no gelo pelo menos 1 min.
      Nota: Use a seguinte equação para calcular o peso molecular aproximado de RNA: MW = (número de bases) x 340 Da.
   2. Adicione 8 μL de 5x dobradura mistura contendo 500 mM HEPES (pH 8.0), 20 mM MgCl₂e 500 mM de NaCl. Alíquota 9 μL da mistura em cada uma das quatro PCR RNA tubos e rotulá-las #1-#4. Adicionar 1 μL de 10% de DMSO no #1 tubo, 1 μL de solução concentrada de molécula pequena (10% de DMSO) em #2, 1 μL de solução diluída de molécula pequena (10% de DMSO) #3 e 1 μL de água em #4.
   3. Incube os tubos PCR a 37 ° C em um termociclador por 30 min.
   4. Bem antes da reação de modificação de 2'-OH, dilua 1 μL de solução NAI (2 M) com 3 μL de água tratada DEPC para produzir uma solução de trabalho de 0,5 M. Sem demora, adicione 1 μL de NAI trabalhando solução nos tubos de #1, #2 e #3 e 1 μL de 25% DMSO em #4. Incube a 37 ° C em um termociclador por 15 min.
   5. Adicione 100 μL de eluição/precipitação misturar (ver passo 1.1.13 para receita), 2 μL de glicogênio (15 mg/mL) e transferir todo o líquido em cada tubo PCR para um tubo de 1,7 mL. 0,34 ml de gelado 200-prova EtOH (volume de 3 x) em cada tubo. Mix vortexing para 5 s e lugar os tubos em um freezer-80 ° C durante pelo menos 1 h.
      Nota: Durante este período, inicie a criação do gel de sequenciamento deve ser usado na etapa 1.5.1.
   6. Centrifugar por 15 min em 14.000 x g e 4 ° C. Remova o sobrenadante sem perturbar a pelota do RNA. Lave a pelota do RNA adicionando 80% EtOH (0,5 mL por tubo), vórtice durante 15 s e centrifugar por 15 min em 20.000 x g e 4 ° C. Remova o sobrenadante novamente.
      Nota: Opcionalmente, use um contador Geiger para garantir a pelota radioativa no tubo de retenção.
   7. Secar ao ar livre a pelota do RNA por 5 min. Adicione 9 μL de água livre de RNase e misture pipetando acima e para baixo 10 vezes.
      Nota: Não seque em demasiado a pelota do RNA. Precipitação de todos é esperada para ser dissolvida no final desta etapa.
4. Extensão de preparação e da primeira demão do marcador
   1. Transferir o RNA modificado em 4 novos tubos de PCR e a etiqueta #1-#4 como anteriormente. Adicionar 2 pmol controle RNA em 7 μL de água tratada DEPC para 4 tubos PCR adicionais e a etiqueta #5-#8. Adicione 2 μL de radiolabeled do primer (etapa 1.2.6) em todos os oito tubos. Calor para recozer a 65 ° C por 5 min e, em seguida, imediatamente esfriar até 4 ° C no termociclador.
   2. Adicionar 4 μL de 5 x tampão RT (ver Tabela de materiais), 1 μL de ditiotreitol (DTT, 0.1 M) e 1 μL dNTP Mix (10 mM cada) para cada um dos oito tubos PCR.
   3. Adicione 2 μL de DEPC tratada H₂O para tubos #1 – #4. Adicione 4 μL de ddATP (5 mM), 4 μL de ddTTP (5 mM) e 4 μL de ddCTP (5 mM) para tubos #5-#7, respectivamente. Adicione 1 μL de ddGTP (5 mM) e 3 μL de água tratada DEPC para tubo #8. Pipete quatro vezes para misturar.
   4. Aqueça a 52 ° C por 1 min no termociclador. Adicionar 1 μL de transcriptase reversa (ver Tabela de materiais), em seguida, misture pipetando e descer quatro vezes. Incube a reação a 52 ° C por 20 min.
   5. Adicione 1 μL de 5 M de NaOH em cada um dos tubos para hidrolisar o RNA. Aqueça os tubos a 95 ° C por 5 min.
   6. Adicionar 5 μL de 1 M de HCl e repita a precipitação do álcool etílico (etapas 1.3.5 e 1.3.6), exceto omitir o glicogênio e transferência de líquidos.
      Nota: Omitindo o passo 1.4.6 resultados em uma região de indefinição no meio do gel, conhecido como o"sal".
   7. Secar o sedimento de DNA por 5 min. Adicione 10 μL de H₂O e 10 μL de 2x TBE-ureia amostra amortecedor do carregamento e pipeta acima e para baixo 10 vezes para redissolver. Calor a 70 ° C por 5 min. Coloque os tubos no gelo antes do carregamento para o gel.
5. Análise de página
   1. Para preparar um gel de sequenciamento de poliacrilamida 8%, siga os passos 1.1.6 para 1.1.10 com as seguintes modificações: use 100 mL de solução de acrilamida/bisacrylamide de 40% (29:1) para preparar uma solução de acrilamida 8% e usar placas de vidro de gel de sequenciamento (por exemplo, 46 x 57 cm) com um espaçador de 0,4 mm.
   2. Carrega 10 μL da amostra da etapa 1.4.7. Funcione o gel em 65 W por 2 h ou até que o corante de fundo atinge 3/4 do gel.
      Nota: Guarde o resto das amostras a-80 ° C para repetir se necessário.
   3. Remova a placa de vidro siliconizado superior removendo o espaçador e inserir delicadamente uma espátula. Coloque um pedaço grande de papel de filtro para cobrir o gel e pressione suavemente para permitir que o gel cumprir o papel de filtro. A partir da extremidade inferior, levante o papel de filtro e retire o gel da placa de vidro juntos.
   4. Coloque o gel junto com o papel de filtro em um pedaço de plástico que é grande o suficiente para cobrir o gel todo (papel de filtro virado para cima). Transferi o sanduíche do envoltório de papel de filtro/gel/plástico para um gel seco com o lado do papel de filtro virado para baixo.
      Atenção: Para evitar a contaminação de material radioativa, use 3 a 4 mais pedaços grande de papel de filtro entre o sanduíche de gel e gel seco.
   5. Seca o gel a 70 ° C, durante 1 h com um vácuo. Transferi o sanduíche de gel em uma fita de tela de armazenamento de fósforo foto-branqueada. Expor a radioatividade do gel para a tela de 4-16 h.
   6. Coloque a tela de armazenamento de fósforo em um dispositivo de imagem e digitalização com resolução média (~ 30 min).
      Nota: Se um artefato de sorriso, como está presente na imagem de gel, use software corrigindo (por exemplo, SAFA) para processar a imagem para uma qualidade publicável. Tenha em mente que a lane de marcador padrão é mais do que as pistas de modificação de 2'-OH 1 nucleotídeo.

2. na célula forma

1. Projeto da primeira demão
   Nota: Ao contrário de forma in vitro, na célula forma não precisa desenhar uma gaveta de expressão. No entanto, um conjunto ideal da primeira demão deve ser usado e deve ser avaliado antes de forma experimentar.
   1. Gere pelo menos três pares de cartilha original por uma ferramenta de design de primeira demão BLAST-based (por exemplo, Primer-BLAST). Para estudar pre-mRNA em células humanas, selecione o genoma humano (não transcriptome) como um banco de dados de referência em Primer par especificidade verificando parâmetros. Escolha o tamanho do amplicon na faixa de 200-1.000-pares de base (PB).
   2. Extrair o DNA genômico de ~ 10⁶ células de interesse com um método baseado em coluna de rotação com o tratamento do RNase A e protease K (ver Tabela de materiais e usar o protocolo do fabricante). Normalize o DNA genômico purificado no buffer de TE 0,1 μg/μL.
   3. Teste PCR com o protocolo realizado nas etapas 1.1.1 e 1.1.2.
      Nota: O conjunto desejado da primeira demão deve produzir uma única banda em um gel de agarose 1,8%.
2. Preparação e modificação de 2'-OH da pilha
   Nota: Para aumentar a abundância de pre-mRNA do interesse, um minigene com a sequência correta sob promotor de citomegalovírus (CMV) para expressão constitutiva é transfectada nas células do hospedeiro.
   1. Pré-aquecer o meio de cultura contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1 x antibiótico mistura em de Dulbecco modificado águia médio (DMEM) a 37 ° C. Células de 293T semente a confluência 50% 24 h antes da transfecção em meio de cultura. Mudar o meio em 2% FBS em DMEM sem antibióticos ~ 1 h antes do transfection.
   2. Adicione 10 μg de plasmídeo minigene em 100 μL de mídia soro reduzida (ver Tabela de materiais) em 1 bem de uma placa de 96 poços. Adicionar a solução de subir e descer quatro vezes para misturar.
   3. Adicionar 40 µ l de reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais) em 100 μL de mídia reduzida soro em outro poço da placa. Pipetar acima e para baixo quatro vezes para misturar. Incube a temperatura ambiente por 5 min.
   4. Adicione a solução inteira do plasmídeo para a suspensão de reagente de transfeccao. Pipetar acima e para baixo quatro vezes para misturar. Incube a temperatura ambiente por 30 min.
   5. Adicionar o DNA inteiro / mistura de reagente de transfeccao gota a gota sobre a superfície do meio em todo o prato. Incube a 37 ° C, durante 6-12 h.
   6. Aspire o meio e delicadamente, lave uma vez com 5 mL de tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4, sem CaCl₂ e MgCl₂, consulte a Tabela de materiais). Trypsinize as células com 3 mL de solução de tripsina. Incube a temperatura ambiente por 5 min.
   7. Bata o prato suavemente para dissociar as células do fundo do prato. Neutralize a tripsina com 6 mL de meio de cultura. Centrifugar a 300 x g durante 4 min e remova o meio.
   8. Ressuspender as células de⁶ ~ 10 para cada amostra em 199 μL do meio de reação (1% FBS em DMEM) e transferir a suspensão de célula em uma placa de 96 poços. Incube as celulas com 1 μL de solução de trabalho de composto ou 1 μL de DMSO em todos os três controles por 30 min a 37 ° C.
      Nota: Três amostras de controle devem ser incluídas: controle de DMSO com NAI, RNA desnaturado com NAI NAI e controle negativo.
   9. Adicione 10 μL de 2m NAI para cada amostra, exceto para o controle de desnaturação (DC) RNA e controles negativos NAI. Pipetar acima e para baixo quatro vezes para misturar. Incube a 37 ° C por 15 min. Agite suavemente as placas para re-suspender as células cada 5 min.
   10. Transferi as células nos tubos de 1,7 mL e centrifugar 400 x g por 2 min sem demora. Remova o sobrenadante sem perturbar o centrifugado.
   11. 0,4 ml de tiocianato de guanidínio (ver Tabela de materiais). Vórtice por 15 s para homogeneizar. Incube as amostras à temperatura ambiente por 5 min.
       Nota: As amostras podem ser armazenadas a-20 ° C até prosseguir para o próximo passo.
3. Extração de RNA
   1. Adicione 0,2 mL de clorofórmio para cada uma das amostras guanidínio tiocianato homogeneizado. Vórtice de 15 s. Incubar à temperatura ambiente por 2 min.
   2. Centrifugue por 5 min em 12.000 x g e 4 ° C. A camada aquosa incolor superior contém RNA. Transferência de ~ 380 μL de solução aquosa para um novo tubo de 1,7 mL.
      Atenção: Não perturbe a interfase para evitar contaminação.
   3. Adicionar 1,5 x volume de EtOH (~ 570 μL). Vórtice por 15 s para misturar.
   4. Transferir 600 μL de mistura de RNA em uma rotação-coluna de isolamento de RNA (ver Tabela de materiais). Centrifugar a 12.000 x g durante 15 s. descarte o eluente. Repita esta etapa para passar através de todo o líquido para a mesma coluna de rotação.
   5. Lavar a coluna com 0,35 mL de tampão de RW1 (ver Tabela de materiais) girando por 15 s. Adicionar 80 μL de DNase RNase-livre eu no buffer RDD (ver Tabela de materiais). Incube a temperatura ambiente por 20 min.
      Nota: É fundamental para eliminar a contaminação de DNA todas.
   6. Posteriormente, lavar a coluna com 0,35 mL de tampão de RW1 e 0,6 mL de tampão de x RPE 2 (ver Tabela de materiais) por fiação por 15 s em cada etapa. Seque a coluna por centrifugação a coluna de rotação com um tubo vazio coleção a 12.000 x g por 1 min.
   7. Adicione 32 μL de água livre de RNase ao centro da coluna. Incubar durante 1 min. centrifugar a 12.000 x g por 30 s para obter ~ 30 μL de solução de RNA purificada. Coloca as amostras a-20 º C durante o processamento da amostra desnaturada.
4. Preparação de controle desnaturada do RNA
   1. Lugar 30 µ l do RNA da amostra para DC em um tubo de plástico de 1,7 mL no gelo. Adicionar 50 μL de formamida e 15 μL de tampão de DC contendo 300 mM HEPES (pH 8.0) e 25 mM EDTA no tubo.
   2. Calor para desnaturar o RNA a 95 ° C por 1 min. rapidamente adicionar 5 μL de solução NAI (2 M), então o filme duas vezes para misturar e coloque o tubo de volta para o bloco de aquecimento. Incubar a 95 ° C por um adicional 1 min, em seguida, imediatamente, colocar o tubo no gelo.
   3. Adicione 0,4 mL de tiocianato de guanidínio. Repita as etapas 2.3.1–2.3.4.
   4. Lavar a coluna com 0,6 mL de tampão de x RPE 2 (ver Tabela de materiais) por fiação por 15 s em cada etapa. Seque a coluna por centrifugação a coluna de rotação com um tubo vazio coleção a 12.000 x g por 1 min.
   5. Adicione 32 μL de água livre de RNase ao centro da coluna. Incubar durante 1 min. centrifugar a 12.000 x g por 30 s para obter ~ 30 μL de solução de DC RNA recuperada.
5. Extensão da primeira demão
   1. Normalize a solução de RNA de 2.3.7 e 2.4.5 em 0.5 μg/μL com água livre de RNase. Na hora prepare 30mm MnCl₂ solução de MnCl₂∙4H pó de O₂.
   2. Transferi 9 μL de solução de RNA para cada amostra em uma tira PCR. Adicione 1 μL de 10mm dNTP e 1 μL de primer de gene-específico 2 μM (GSP) em cada tubo. Pipetar acima e para baixo quatro vezes para misturar. Incubar a 65 ° C por 5 min em um termociclador e colocar no gelo para > 1 min.
      Nota: Alternativamente, 1 μL de uma nonamer aleatório pode ser usado em substituição do SPG.
   3. Em cada tubo PCR, adicione uma mistura de 2 μL de 10x buffer de RT (ver Tabela de materiais), 4 μL de 30mm MnCl₂e 2 μL de 100 mM DTT. Pipetar e descer 4 x para misturar. Incube a 42 ° C por 2 min.
   4. Adicionar 1 μL de transcriptase reversa (ver Tabela de materiais). Pipetar e descer 4 x para misturar. Incube a 42 ° C em um termociclador para 3h.
6. Preparação de biblioteca e sequenciamento de próxima geração
   1. Configurar uma reação de PCR adicionando 1 μL de DNA polimerase, 5 μL de 10x buffer de DNA polimerase (ver Tabela de materiais), 2 μL de DMSO, 1,5 μL de cada um dos primers (10 μM), 34 μL de H₂O e 5 μL de cDNA da etapa 2.5.4.
   2. Configurar o termociclador da seguinte forma: fase 1) 95 ° C por 2 min; fase 2) 95 ° C por 30 s; fase 3) 60 ° C por 30 s; fase 4) 68 ° C por 30 s; loop de fase 5) volta para a etapa 2 para 30 ciclos; fase 6) 68 ° C por 3 min; e a fase 7) infinita segurando a 4 ° C até o passo seguinte.
   3. Purifica o amplicon usando gel de agarose 1,8%.
      Nota: A banda PCR deve aparecer como uma única banda no gel.
   4. Construa a biblioteca usando padrão fragmentação e métodos de ligadura estabelecidos na literatura^6,26.
   5. Sequência em um equipamento de sequenciamento de próxima geração, usando 1 x 75 único-extremidade leituras para gerar aproximadamente 10 milhões lê por amostra.
   6. Analisar os resultados usando o software SuperFold e ShapeMapper pacotes desenvolvidos por semanas as grupo²⁶.

Demonstramos anteriormente que um RNA splicing modulador, SMN-C2, interage com motivo AGGAAG no exon 7 do pre-mRNA do gene SMN2 e usado de forma a avaliar as alterações estruturais do RNA na presença de SMN-C26. O sítio de ligação do SMN-C2 é distinto do FDA-aprovado antisentido do oligonucleotide (ASO) para SMA, nusinersen, que se liga e bloqueia o silenciador emenda intrônicas (ISS) na intron 727,28 (figura 1A). Mais conhecidos reguladores de emenda de SMN2 exon 7 estão dentro do intervalo de ~ 100 nucleotídeos do exon 7 no pre-mRNA29; Portanto, um RNA nucleotídeos de comprimento 140 e 276 sequências foram usadas para forma in vitro e na célula, representativa, que abrange exon 7 e região adjacente intrão (figura 1A).

Nesta análise representativa de forma in vitro, a sequência de RNA de interesse é incorporada dentro de um estojo otimizado desenvolvido pelo laboratório de semanas, que é compatível para a maioria das sequências de RNA1. Ocasionalmente, a sequência de interesse interage ou interfere com esta fita. Nesses casos, uma gaveta modificada pode ser usada com as seguintes três características: i) um sítio de ligação do primer específico de 3'-extremidade com uma afinidade de hibridação mais eficiente para a primeira demão do que qualquer parte da sequência de RNA, ii) um loop de gancho de cabelo altamente estruturados localizado diretamente acima do sítio de ligação a cartilha que mostrará específicos e reprodutíveis sinal forma (isso irá funcionar como ambos um controle interno para a experiência e o método para alinhar o sinal de experimento para experimento) e iii) uma estrutura de grampo do 5'-final elemento, que indica o final do sinal de forma. A fita de forma ainda mais é flanqueada com self fendendo ribozima sequências em ambos os 5'-3'-extremidades a fim de gerar uma homogênea de RNA30e. Descobrimos que tubarão-martelo e hepatite delta vírus ribozimas são compatíveis ao estojo forma e geralmente dão alto rendimento do RNA desejado. O modelo resultante do RNA tem um 3'-extremidade de 2', 3'-cíclico fosfato e um 5'-final do grupo hidroxila, que não interfiram com a extensão da primeira demão. Uma longa sequência de 140-nucleosídeo cobrindo exon 7 do SMN2 e região adjacente em pre-mRNA foi sintetizada em forma e ribozima gaveta, conforme ilustrado no esquema 1.

Em geral, a sequência de interesse ligado na gaveta a expressão deve ser suficiente para cobrir a ordem secundária ou superior potencial de estrutura. No caso de SMN2 exon 7, uma região de 140-nucleotide contém dois Hairpin loop estruturas6,31. A estrutura da região de interesse varia caso a caso e deve ser avaliada por tentativa e erro.

Gel de polyacrylamide sequenciamento com produtos de extensão de primer P-etiquetada 32foi escolhido para visualizar o perfil em vitro forma nesta experiência representativa. Um método de visualização alternativa é usar a eletroforese capilar com uma fluorescente etiquetadas DNA cartilha32. Em gel de poliacrilamida sequenciamento, ~ 20 nucleosídeos perto da extremidade 5'- e ~ 10 nucleotídeos perto de 3'-extremidade da sequência de RNA de interesse não vai ser visualizado quantitativamente, devido a ocasionalmente para nas etapas de iniciação da transcrição reversa e intensa bandas na página géis para transcrições completos1.

Uma maneira alternativa para recuperação de gel preparativa de um modelo de RNA (etapas 1.1.6 para 1.1.12) é a sobrecarga de um mini gel se o rendimento do modelo de RNA desejado é > 90%. É aconselhável remover o NTP excesso de produto o RNA por dessalinização a coluna e o RNA em 50 µ l de tampão TE de eluição. Medir a concentração do RNA e carregar 5,0 µ g em cada poço. Durante a depuração passo do T7 transcrito modelo de RNA, pare a página quando o corante xileno cianol FF (luz azul) passado dois terços dos 6% desnaturado gel de TBE-ureia. O fragmento de RNA autoclivagem (< 80 nucleosídeos) passado através do gel, que deixou o RNA desejado como a única grande banda no gel em cima da mancha (figura 1B).

SMN-C2 (Figura 1) foi sintetizado de acordo com o procedimento publicado33 e dissolvido em solução de DMSO 10 mM. A solução é mais diluída em 500 e 50 µM em solução 10% de DMSO para atingir concentrações finais de 50 e 5 µM, respectivamente. Snap-refrigeração RNA dobrado para seu estágio de equilíbrio na presença de DMSO ou SMN-C2 dentro de 30 min a 37 ° C. Um tempo de incubação não alterou o resultado do experimento. Duas amostras experimentais (5 e 50 µM SMN-C2), dois controles (DMSO e NAI-controles) e quatro marcadores (A, T, G, C) foram tratado por extensão da primeira demão. Depois de expor o gel para tela de armazenamento de fósforo, irá mostrar uma experiência bem sucedida de forma: i) uma banda única e mais intensa na parte superior do gel e bandas ii) em todo o gel em single-nucleotide resolução sem esfregaço (Figura 1). Um problema comum em análise de página é que uma região de esfregaço, conhecida como o"sal" pode aparecer no meio do gel (Figura 1E). Isto é provavelmente devido à alta concentração de sal, DMSO, ou outros indesejados substância na amostra de carregamento que pode ser removida por precipitação do álcool etílico.

Em in vitro forma um modelo de RNA puro é a chave para uma experiência bem sucedida. Um modelo de RNA impuro é geralmente a causa de resultados indesejados. Se a análise de página mostra claramente um padrão de 2 conjuntos de marcadores, indica que o modelo de RNA não é homogêneo e precisa de ser que seja repurificado por preparativa TBE-ureia do gel.

Para a forma na célula, uma chave para uma experiência bem sucedida é projetar um conjunto otimizado de cartilha para amplificação. Com 0,10 µ g do modelo de cDNA livre de DNA genômico, uma única banda deve ser observada dentro de 25 ciclos PCR na análise do gel do agarose. As sequências repetitivas intrão, portanto, devem ser evitadas. Para estudar o estrutural impacto do SMN-C2 na SMN2 pre-mRNA, três conjuntos de cartilha (tabela 2) foi testado, e todos eram satisfatórios (Figura 2A).

Um número baixo de cópia de uma sequência do alvo do RNA é geralmente um problema para a forma na célula. Para enriquecer o RNA de interesse, um minigene que contém a sequência de RNA de interesse sob um forte promotor CMV foi transfectada em 293T células. Porque o padrão de emenda do minigene SMN2 recapitula do SMN2 endógena, com ou sem SMN-C219,34, vislumbramos que a estrutura do RNA interagindo na Blumental SMN2 pre-mRNA provável era a mesma que SMN-C2 o produto do gene endógeno. Enquanto o CE50 de SMN-C3 no ensaio de emenda foi ~0.1 µM6,19, utilizou-se uma concentração na extremidade mais elevada (20 µM) para garantir o estado de ligação da molécula pequena e sequência do alvo do RNA.

Após isolamento do RNA, as primeiras demão gene-específico e aleatórias podem ser usadas para a extensão. No caso do exon 7 do SMN2, achamos que SMN2E7-338-RV (tabela 2) produz uma cópia maior do cDNA desejado do que um nonamer aleatório, evidenciado por uma banda mais intensa na amplificação por PCR com conjunto de cartilha SMN2E7-276 (tabela 2) após 25 ciclos. Na etapa de modificação de 2'-OH, uma concentração de NAI final µM 91 foi usado por um período de incubação de 15 min. Se um tipo de célula diferente ou médio é usado, o tempo de incubação deve ser re-otimizado. Se o tempo de incubação é muito longo, análise do gel do agarose do amplicon às vezes falhará ao mostrar uma banda.

Um programa baseado em python, ShapeMapper, desenvolvido pelas semanas laboratório35 foi utilizado para analisar os dados gerados pelo sequenciamento de nova geração [para dados brutos de SMN-C2 tratados na célula forma de SMN2 exon 7 pre-mRNA, consulte para a sequência de leitura arquivo (SRA) banco de dados]. Em todo o amplicon, a reatividade de forma não alteram significativamente a (> 1), que indicou que a estrutura secundária permanece na presença de SMN-C2 (Figura 2B). Isto também é confirmado por parcelas arco geradas pelo SuperFold35. As linhas de conexão indicam o possível base emparelhamento com base na forma de atividade de cada nucleotídeo. SMN-C2 e DMSO-tratados com modelagem de RNA é essencialmente o mesmo (Figura 2). Reatividade de diferencial na célula forma foi calculada para cada nucleotídeo (Figura 2B), e a alteração de reatividade a maioria ocorreu no TSL-1 (5'-final do exon 7) mas não TSL-2 (3'-extremidade do exon 7). Este resultado concorda com o forma in vitro; embora, o emparelhamento base mudou de in-vitro modelagem RNA de forma em forma na célula analisa (Figura 2D).

Um problema comum de forma na célula é a taxa de mutação baixa em todo o amplicon. Isto é geralmente devido à contaminação de DNA genômica. DNA não contiver o grupo 2'-OH; Portanto, nenhum produto de acilação é formado com NAI. Amplificação por PCR, portanto, reflete apenas a taxa de mutação baixa da DNA polimerase. Isolamento de RNA de guanidinium seguido por digestão de DNase na coluna é suficiente para remover todo o ADN na maioria dos casos. Se a contaminação de DNA persistir, repita a etapa 2.3 para isolamento de RNA.

Esquema 1: sequência de DNA para o modelo de transcrição do RNA. A sequência de bp 12 dentro da sequência de ribozima Hammerhead vírus em vermelho é o complemento inverso do primeiro 12 bp da fita 5'. A sequência de RNA de interesse aqui apresentado é um 140 bp pre-mRNA sequência contém exon 7 do gene SMN2 humano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 1: Delineamento experimental e resultado de forma in vitro para SMN2 exon 7 pre-mRNA na presença de SMN-C2. (A) visão geral da sequência de interesse para estudos in vitro e em células de forma do gene SMN2. SMN-C2 vincula o motivo AGGAAG no exon 7, um local distinto do local de ligação do nusinersen. (B) purificação do produto T7 transcrição. Cada uma das três pistas contém 5,0 µ g de RNA bruto. O gel de TBE-ureia estava manchado com SYBR-Safe (01:10, 000) por 5 min em 1 x TBE de buffer. Caixa tracejada vermelha indica a borda da excisão para recuperação de RNA. (C) a estrutura do SMN-C2. (D), experimento de forma In vitro com NAI e um 140 modelo de RNA nucleotídeos de comprimento contendo exon 7. 1 = DMSO; 2 = SMN-C2 (50 ΜM); 3 = SMN-C2 (5 ΜM); 4 = falta de NAI; 5-8 = escadas geradas pela adição de ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP e durante a extensão da primeira demão. PÁGINA foi levada para fora em um gel de sequenciamento de TBE-ureia em 60 W por 3 h. Red asteriscos indicam banda maior intensidade com 50 µM SMN-C26. Experimento (E), um exemplo de uma região de "sal da frente" da caixa tracejada vermelha de um separado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Na célula forma derivada modelagem RNA para SMN2 exon 7 pre-mRNA. (A), PCR amplificação com todos os conjuntos de três da primeira demão (tabela 2) rendida uma única banda na análise do gel do agarose. 1 = SMN2E7-338, 2 = SMNE7-276, 3 = SMN2E7-251, 4 = escada de DNA. (B) diferencial reatividade de forma na célula em células de SMN2 293T minigene-transfectadas para 10 µM SMN-C2 e DMSO em TSL1. FORMA de reatividade em single-nucleotide resolução. Seu desvio-padrão foi calculado por ShapeMapper software35. Verdes asteriscos indicam mudança de reatividade de forma significativa induzida por 10 µM SMN-C2. A numeração dos nucleótidos no amplicon bp 276, mostrado em x-eixo. Barras de erro foram estimadas pela forma-Mapper software26. (C) parcela de arco gerada pelo SuperFold35 para a estrutura secundária de RNA mais plausível de modelagem de dados de forma na célula. (D) In vitro e na célula modelagem forma-dirigido do exon 7 e regiões adjacentes. Para modelo de RNA in vitro, forma estabilizando cassette (laranja) e nucleotídeos 1-19 (azul) é mostrada no desenho. Para o modelo de RNA na célula, nucleotídeo numeração está alinhado com o modelo in vitro de forma. Nucleotídeos, 1-18 e 120-140 foram omitidos. Alterações significativas de reatividade são indicadas em asteriscos vermelhos e verdes para forma in vitro e na célula, respectivamente. As estruturas secundárias que foram anteriormente denominadas TSL1 e TSL231 são colocadas em caixas azuis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: As sequências de primer utilizadas no experimento representativo.

Tabela 2: A primeira demão define para a amplificação da sequência de interesse pre-mRNA. Todos os conjuntos de três primeira demão rendem um amplicon único em uma reação de PCR com modelo de cDNA livre de DNA genômico.

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.