Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

Resumo

São protocolos detalhados para ambos in vitro e na célula seletiva 2'-hidroxila acilação analisados por experiências de extensão (forma) da primeira demão para determinar a estrutura secundária das sequências pre-mRNA de interesse na presença de uma pequena molécula de RNA-direcionamento apresentada neste artigo.

Resumo

No processo de desenvolvimento de drogas de RNA-direcionamento de pequenas moléculas, elucidar as mudanças estruturais em suas interações com sequências de RNA alvo é desejado. Aqui oferecemos uma detalhada em vitro e na célula seletiva 2'-hidroxila acilação analisados pela extensão da primeira demão protocolo (forma) para estudar a mudança estrutural de RNA na presença de uma droga experimental para a atrofia muscular espinhal (SMA), sobrevivência de motor neuron (SMN)-C2 e no exon 7 do pre-mRNA do gene SMN2. Em forma in vitro, uma sequência de RNA de 140 nucleotídeos contendo SMN2 exon 7 é transcrito por T7 RNA polimerase, dobrada na presença de SMN-C2 e posteriormente modificada por um reagente de acilação leve 2'-OH, imidazolide de ácido 2-methylnicotinic (NAI). Este aduto de 2'-OH-NAI é mais sondado por um ³²extensão da primeira demão P-etiquetadas e resolvido por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Por outro lado, 2'-OH acilação em forma na célula ocorre in situ com RNA celular SMN-C2 vinculado em pilhas vivas. A sequência de pre-mRNA do exon 7 no gene SMN2, juntamente com mutações induzida por forma a extensão da primeira demão, então foi amplificada por PCR e sujeitos a próxima geração sequenciamento. Comparando as duas metodologias, forma in vitro é um método mais econômico e não exige poder computacional para visualizar os resultados. No entanto, o modelo de SHAPE-derivado de RNA in vitro às vezes difere da estrutura secundária em um contexto de celular, provavelmente devido à perda de todas as interações com proteínas RNA-obrigatórias. Na célula forma não precisa de um material radioativo no local de trabalho e produz uma estrutura secundária mais precisa de RNA no contexto celular. Além disso, a forma na célula é geralmente aplicável para uma maior sequências de gama de RNA (~ 1.000 nucleotídeos) utilizando o sequenciamento de próxima geração, em comparação com in vitro da forma (~ 200 nucleotídeos) que geralmente se baseia na análise de página. No caso do exon 7 em SMN2 pre-mRNA, a in vitro e na célula forma derivada modelos de RNA são semelhantes entre si.

Introdução

Seletiva 2'-hidroxila acilação analisada pela extensão da primeira demão (SHAPE) é um método de medir a cinética de cada nucleotídeo em uma sequência de RNA de interesse e elucidação da estrutura secundária em single-nucleotide resolução¹. Metodologias de forma, tanto em condições in vitro^2,3,4 (RNA purificado em um sistema de buffer definido) e em^5,de células de mamíferos vivos⁶, foram desenvolvidos para investigar o secundário estrutura de sequências de comprimento médio do RNA (tipicamente <....

Protocolo

1. em forma de Vitro

Nota: O protocolo é modificado no protocolo publicado¹.

1. Preparar o modelo de RNA
   Nota: O modelo para a transcrição de T7 foi ordenado como sintético double-stranded DNA (dsDNA) e amplificado por qualquer inserção em um vetor de Escherichia coli que carrega um único par de sites de endonuclease de restrição EcoRI/BamHI, tais como pET28a, ou pelo PCR. O protocolo para amplificação por PCR é ilustrado abaixo.
   1. Misture o seguinte material: 50 μL de mestre PCR mix (ver Tabela de materiais), 2 μL para cada ....

Resultados

Demonstramos anteriormente que um RNA splicing modulador, SMN-C2, interage com motivo AGGAAG no exon 7 do pre-mRNA do gene SMN2 e usado de forma a avaliar as alterações estruturais do RNA na presença de SMN-C2⁶. O sítio de ligação do SMN-C2 é distinto do FDA-aprovado antisentido do oligonucleotide (ASO) para SMA, nusinersen, que se liga e bloqueia o silenciador emenda intrônicas (ISS) na intron 7^27,28 (

Discussão

Em forma in vitro, é fundamental usar modelo de RNA homogêneo de alta qualidade. Transcrição de T7, no entanto, muitas vezes produz sequências heterogêneas³⁶. Especialmente, sequências com ± 1 nucleotídeo no 3'-terminal com rendimentos não negligenciável³⁶ são geralmente difícil de ser removido pela purificação do gel de polyacrylamide. Modelo de RNA heterogêneo pode resultar em mais de um conjunto do sinal no gel de sequenciamento perfil do produto extensão da primeira dem.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DNA oligonucleotídeo	IDT		gBlock para síntese de DNA de >200 bp
Phusion Green Hot Start II PCR de Alta Fidelidade Master Mix	Thermo Fisher	F566S
NucleoSpin gel e kit de limpeza de PCR	Takara	740609.50
MegaScript T7 kit de transcrição	Thermo Fisher	AM1333	Contém 10x tampão de reação, enzima T7, NTP e Turbo DNase
Água tratada com DEPC	Thermo Fisher	750023
2x TBE-urea tampão de amostra	Thermo Fisher	LC6876
Solução de acrilamida/ bisacrilamida a 40% (29:1)	Bio-Rad	1610146
10x tampão TBE	Thermo Fisher	15581044
Nalgene Rapid-Flow™ Unidade de filtro	Thermo Fisher	166-0045
Kimwipe	Kimberly-Clark	34133
TEMED	Thermo Fisher	17919
Corante SYBR-Safe	Thermo Fisher	S33102
6% TBE-ureia mini-gel	Thermo Fisher	EC6865BOX
ChemiDoc	Bio-Rad
T4 PNK	NEB	M0201S
γ-32P-ATP	Perkin Elmer	NEG035C005MC
Hyperscreen™ Tela de intensificação	GE Healthcare	RPN1669	tela de fósforo de tungstato de cálcio
de armazenamento de fósforo	Molecular Dynamics	BAS-IP MS 3543 E
Amersham Typhoon	GE Healthcare
NAI (2M)	EMD Millipore	03-310
GlycoBlue	Thermo Fisher	AM9515
SuperScript IV Reverse Transcriptase	Thermo Fisher	18090010	Contém 5x RT buffer, SuperScript IV
dNTP mix (10 mM)	Thermo Fisher	R0192
ddNTP set (5 mM)	Sigma	GE27-2045-01
	Whatman	1001-917
Secador de gel	Hoefer	GD 2000
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51104	Também contém RNase A e protease K
SMN2 minigene34	Addgene	72287
FBS Thermo Fisher inativado		por calor 10438026
Pen-Strep	Thermo Fisher	15140122
Opti-MEM I	Thermo Fisher	31985062
FuGene HD	Promega	E2311
TrpLE	Thermo Fisher	12605010
DPBS sem Ca/Mg	Thermo Fisher	14190250
TRIzol	Thermo Fisher	15596018
RNeasy mini coluna	Qiagen	74104	Também contém RW1, buffer RPE
Conjunto DNase livre de RNase	Qiagen	79254	Contém DNase I e buffer RDD
Formamida	deionizadaThermo Fisher	AM9342
MnCl2• 4H2O	Sigma-Aldrich	M3634
nonâmero aleatório	Sigma-Aldrich	R7647
SuperScript First-Strand Synthesis System	Thermo Fisher	11904-018	Contém 10x tampão RT, SuperScript II transcriptase reversa
AccuPrime pfx DNA polimerse	Thermo Fisher	12344024
NextSeq500	Illumina
Coluna NucAway	Thermo Fisher	AM10070	para fins de dessalinização

telaPapel de filtro grande