Este estudo descreve um alto throughput, com base em imagens de ensaio de microneutralização para determinar o título de anticorpos neutralizantes específicos para o vírus sincicial respiratório (VSR). Este formato de ensaio foi testado em tipos diferentes de amostra.
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Artigo de método
Um ensaio de Microneutralização do vírus sincicial respiratório (VSR) melhorada e alta taxa de transferência
Neste artigo
Resumo
Resumo
Respiratórios sincicial vírus específicos anticorpos neutralizantes (RSV NAbs) são um importante marcador de proteção contra RSV. Um número de formatos diferentes de ensaio está atualmente em uso em todo o mundo para que haja a necessidade de um método de precisão e alta produtividade para medir RSV NAbs. Descrevemos aqui um ensaio de microneutralização com base em imagem que foi testado no subgrupo RSV A e também pode ser adaptado para o subgrupo RSV B e tipos de amostras diferentes. Este método é altamente reprodutível, com variações inter-ensaio para o soro de referência, sendo menos de 10%. Acreditamos que este ensaio pode ser prontamente estabelecido em muitos laboratórios em todo o mundo a um custo relativamente baixo. Desenvolvimento de um ensaio melhorado, elevado-throughput que mede RSV NAbs representa um significativo passo em frente para a padronização deste método internacionalmente, bem como sendo fundamental para a avaliação dos candidatos de vacina RSV romance no futuro.
Introdução
Vírus sincicial respiratório (VSR) é a principal causa de infecções do trato respiratório inferior na população pediátrica em todo o mundo1. Apesar de sua alta carga, não há ainda nenhuma vacina ou tratamento disponível. Desde 2013, a Organização Mundial de saúde (OMS) declarou-se desenvolvimento de vacina RSV como uma prioridade de pesquisa principais, com anual WHO consulta reuniões2,3. A OMS chegou a acordo sobre uso de RSV neutralizando a medição de anticorpo (NAb) para monitorar a imunogenicidade da vacina, como isto é reconhecido como o principal marcador serológico de proteção
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Protocolo
Nota: Todos os passos tem que ser executada em uma capa de BSL2, a menos que indicado de forma diferente. Titulação viral é necessária com antecedência um ensaio PRN para determinar a concentração ideal de RSV utilizada no ensaio de PRN. Recomenda-se alíquota as reservas de vírus em um pequeno volume que será descongelado uma vez e usado para cada ensaio de NAb. Também é recomendável utilizar o mesmo estoque viral para todos os ensaios de NAb realizados para todas as amostras de um estudo. Certifique-se de meios de cultura e tampão fosfato salino (PBS) é aquecido a 37 ° C antes de adicionar placas de célula.
1. RSV titulação ....
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Resultados
A titulação de um estoque de vírus foi realizada de 01:10 para 01:108 diluição para determinar a concentração de vírus estoque antes do ensaio do PRN (representante resultados mostrados na Figura 5). Da Figura 5, PFU pode ser contada de forma confiável em diluições de 01:104 e 01:105. Foi calculado o número médio de PFU de três vias poços na mesma diluição. Desde o número médio de pontos às 01:10<.......
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Discussão
Temos desenvolvido e aperfeiçoado um ensaio de microneutralização RSV simples e eficiente que pode ser facilmente adaptado na maioria dos laboratórios. Este ensaio é capaz de medir a capacidade de infecção viral, bem como a inibição da infecção viral por NAb a nível celular, usando a varredura de imagem computadorizada de medição. A utilização de uma plataforma baseada em imagem latente e sistemas baseados em anticorpos específicos aumentou a especificidade e a sensibilidade da deteção ponto comparada com placa tradicion.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer todos os participantes envolvidos. Reconhecemos o programa de apoio de infra-estrutura operacional do governo vitoriano. LPC é um destinatário NHMRC Fellowship de desenvolvimento de carreira.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Linhagem celular | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | fornecido pelo Dr. Keith Chappell, Universidade de Queensland |
| Cepas virais | |||
| RSV A2 | ATCC | VR-1540 | número de lote 60430286 |
| Reagentes | |||
| Acetona | Merck | 1000142511 | |
| Alexa-Fluor burro anti-cabra IgG (armazenado a 4 ° C) | Life Technologies | A11055 | |
| CMC sal de sódio em pó | Sigma-Aldrich | C5678-500G | |
| DMEM (sem soro, 3,7 g / L NaHC, P / S) (armazenado a 4 ° C) | Serviços Científicos – Cultura de tecidos | MCRI em casa fornecimento | |
| de soro fetal de bezerro (armazenado em alíquotas de 50 mL a -20 ° C) | Interpath | SFBS-F | |
| Cabra X anticorpo RSV | Merck | AB1128 | |
| anti-soro policlonal humano para vírus sincicial respiratório (RSV) (armazenado em 45 µ L alíquotas em -20 ° C) | BEI Resources | NR-4022 | Pedido gratuito através do BEI Resources mediante registro. Este soro pertence a um painel de anti-soro humano e imunoglobulina ao VSR (NR-32832) |
| M199 pó | Life Technologies | 31100035 | |
| Solução de bloqueio de diluente de leite (armazenada a 4 &graus; C) | Australian Biosearch | 50-82-01 | |
| Penicilina / Estreptomicina (armazenada em alíquotas de 6mL a -20 ° C) | Life Technologies | 15140122 | |
| s.d.H2O do dispensador Milli-Q | Merck | Dispensação interna | |
| Estéril 1x PBS para cultura (armazenado a 4 ° C) | Serviços Científicos – Cultura de tecidos | MCRI em fornecimento interno | |
| Tween 20 polissorbato | Sigma-Aldrich | 9005-64-5 | |
| Consumíveis Gerais | |||
| Tubos Falcon cônicos (50 mL) | Invitro Technologies | FAL352070 | |
| Unidade de filtro 0,22 μ m (500 mL) | Thermo Fisher | NAL5660020 | |
| Tubos Eppendorf estéreis (1,5 mL) | Austrália PL | AM12400 | |
| Placas estéreis de fundo plano (96 poços com tampa) | Interpath | 655180 | |
| Placas estéreis de fundo em U (96 poços com tampa) | Interpath | 650180 | |
| Pipeta sorológica de 5 mL | Sigma-Aldrich | CLS4487-200EA | |
| Pipeta sorológica de 10 mL | Interpath | 607180 | |
| Pipeta sorológica de 25 mL | Pipeta de ponta Sigma-Aldrich | CLS4251-200EA | |
| 1-200 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-esterilizado 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Pipeta de Ponta Fisher Biotec | TF-200-L-R-S | |
| 5-20 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-esterilizado 10RACKS x 96TIPS PKG960 | Pipeta de Ponta Fisher Biotec | TF-20-L-R-S | |
| 100-1,000 µ LClear Maxymum Recovery Racked Pré-esterilizado 10RACKS x 100TIPS PKG1000 | Fisher Biotec | TF-1000-L-R-S | |
| 1-10 µ L Clear Maxymum Recovery Racked Pré-esterilizado 10RACKS x 100TIPS PKG1001 | Fisher Biotec | TXLF-10-LRS | |
| Equipamentos e softwares | |||
| AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Estrasburgo, Alemanha | |||
| Software AID ELISpot versão 5.0 | AID iSpot, Autoimmun Diagnostika GmbH, Estrasburgo, Alemanha | ||
| Microsoft Excel 2007 |
Referências
- Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
- Modjarrad, K., et al.
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Reimpressões e permissões
