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Artigo de método

Uma Nanoemulsão estabilizada tripeptídeo de ácido oleico

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DOI:

10.3791/59034

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27 de fevereiro de 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Brooklyn College, The City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 3Ph.D. Program in Biochemistry, The Graduate Center of The City University of New York, 4Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 5Women's Health Research Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 6Laboratory for Translational Research, Western Connecticut Health Network

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente para sintetizar uma Nanoemulsão de um conjugado de oleico acids-platinum(II) estabilizado com um tripéptido fenilalanina-lisina-tirosina (KYF). As formas de Nanoemulsão sob condições sintéticas suaves através de auto-montagem do KYF e o conjugado.

Resumo

Nós descrevemos um método para produzir uma Nanoemulsão composta de um núcleo de acids-Pt(II) oleico e um revestimento (KYF) de fenilalanina-lisina-tirosina (KYF-Pt-NE). KYF-Pt-NE encapsula Pt(II) a 10% do peso, tem um diâmetro de 107 ± 27 nm e uma carga negativa de superfície. KYF-Pt-NE é estável na água e no soro e é biologicamente ativo. A conjugação de um fluoróforo para KYF permite a síntese de uma Nanoemulsão fluorescente que é apropriado para a imagem latente biológica. A síntese da Nanoemulsão é executada em um ambiente aquoso e as formas de KYF-Pt-NE através de auto-montagem de um peptídeo KYF curto e um conjugado acids-platinum(II) oleico. A auto-montagem processo depende da temperatura da solução, a razão molar entre os substratos e a taxa de fluxo da adição de substrato. Etapas cruciais incluem mantendo a taxa ideal de agita durante a síntese, permitindo tempo suficiente para self-assembly e pre-concentrando a Nanoemulsão gradualmente em um concentrador centrífugo.

Introdução

Nos últimos anos, tem havido um interesse crescente na engenharia de nanopartículas para tais aplicações biomédicas, como a entrega da droga e bioimaging1,2,3,4. A multifuncionalidade dos sistemas baseados em nanopartículas necessita frequentemente incorporando vários componentes dentro de uma formulação. Os blocos de construção que são baseados em lipídios ou polímeros muitas vezes diferem em termos de suas propriedades físico-químicas, bem como sua biocompatibilidade e biodegradabilidade, que em última análise, pode afetar a função do nanostructure1, 5,6. Biologicamente derivada de materiais, tais como proteínas e peptídeos, há muito foram reconhecidos como promissoras componentes de nanoestruturas multifuncionais devido à sua flexibilidade de sequência7,8. Peptídeos auto-montagem em arquiteturas supramoleculares altamente ordenadas, formando helicoidal fitas9,10, andaimes fibroso11,12e muitos mais, abrindo assim o caminho para a construção -híbrida biomolécula nanoestruturas usando um ascendente abordagem13.

Peptídeos têm sido explorados para aplicações em medicina e biotecnologia, especialmente para a terapia anticâncer14 e doenças cardiovasculares15 , bem como para desenvolvimento de antibióticos16,17, metabólica distúrbios de18e infecções19. Há mais de uma centena de pequenas-peptídeo terapêutica submetidos a ensaios clínicos20. Peptídeos são fáceis de modificar e rápido para sintetizar a baixo custo. Além disso, eles são biodegradáveis, que facilita muito suas aplicações biológicas e farmacêuticas21,22. O uso de peptídeos como componentes estruturais inclui a engenharia de nanopartículas responsivos, baseado em peptídeo e depósitos de hidrogel para liberação controlada23,24,25,26 , 27, baseado em peptídeo biosensores28,29,30,31ou dispositivos bio-elétrica32,33,34. Importante, nem curtos peptídeos com dois ou três resíduos de aminoácidos que incluem fenilalanina foram encontrados para guiar a auto-montagem processa35,36,37 e criar emulsões estabilizadas38 .

Drogas baseada em platina, devido a sua alta eficácia, são usadas em muitos esquemas de tratamento de câncer, tanto sozinho como em combinação com outros agentes39,40. Compostos de platina induzem danos ao DNA, formando ligações cruzadas de monoadducts e intrastrand ou interstrand. As lesões do ADN-Pt são reconhecidas pela maquinaria celular e, se não reparado, levam a apoptose celular. O mecanismo mais importante, pelo qual Pt(II) contribui para a morte de células de câncer, é a inibição da transcrição de DNA41,42. No entanto, os benefícios da terapia de platina são diminuídos pela toxicidade sistêmica de Pt(II) que provoca efeitos colaterais graves. Isto leva a baixa dosagem clínica de Pt(II)43, que muitas vezes resulta em concentrações subterapêuticas de platina, atingindo o DNA. Como consequência, a reparação do DNA que segue contribui para a sobrevivência de células de câncer e adquirir resistência Pt(II). A quimioterapia-resistência de platina é um grande problema na terapia anticâncer e a principal causa de falha de tratamento44,45.

Nós desenvolvemos um nanosystem estável que encapsula o agente Pt(II) a fim de proporcionar um efeito de blindagem na circulação sistêmica e para diminuir os efeitos colaterais Pt II-induzida. O sistema é baseado em um núcleo de oleico acids-Pt(II) estabilizado com um tripéptido KYF para formar uma Nanoemulsão (KYF-Pt-NE)46. Os blocos de construção de KYF-Pt-NE, os aminoácidos do tripeptídeo, bem como o ácido oleico, têm o estatuto de geralmente reconhecidos como seguros (GRAS) com a Food and Drug Administration (FDA). KYF-Pt-NE é preparada usando um método de nanoprecipitation47. Em suma, o conjugado acids-Pt(II) oleico é dissolvido em um solvente orgânico e em seguida adicionado gota a gota à solução aquosa KYF (Figura 1) a 37 ° C. A solução é agitada por várias horas permitir a auto-montagem do KYF-Pt-ne A Nanoemulsão está concentrada em 10 kDa de concentradores centrífugos e lavada três vezes com água. A modificação química do KYF com um fluoróforo permite a síntese de fluorescente FITC-KYF-Pt-NE apropriado para a imagem latente biomedical.

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Protocolo

1. síntese do conjugado Acids–Platinum(II) oleico

  1. Ativação da Cisplatina
    1. Suspender a 50 mg (0.167 mmol) de cisplatina em 4 mL de água (por exemplo, nanopure) a 60 ° C.
    2. Adicionar gota a gota-mg 55,2 (0.325 mmol) de AgNO3 em 0,5 mL de água para a solução da cisplatina e mexa a reação pelo menos 2 h a 60 ° C. O precipitado branco de AgCl formarão indicando o progresso da reação.
    3. Para determinar se a reação de ativação é concluída, realize o teste com 10% HCl a presença de íons de Ag+ livre na solução. O teste deve ser negativo (nenhum precipitado de AgCl adicional deve formar).
    4. Centrifugue a mistura de reação no 3.220 x g durante 10 minutos e remover o precipitado branco de AgCl.
    5. Recolher o sobrenadante e filtrar através de um filtro de seringa 0,2 mm. Teste o sobrenadante para a presença de platina, aplicando-se 2-3 gotas da solução através de uma pipeta Pasteur de SnCl2 cristais. O teste é positivo se a cor do complexo coordenada de estanho com platina é amarelo/laranja-escuro.
    6. Use o sobrenadante com Pt(II) registrados para a segunda etapa.
  2. Reação do ácido oleico com Pt(II) registrados
    1. Suspender 94,2 mg de ácido oleico (0.333 mmol) em 3 mL de água a 60 ° C.
    2. Adicionar 13,3 mg (0.333 mmol) de NaOH em 1 mL de água e misturar com a solução de Pt(II) registrados da etapa 1.1
    3. Misture a reação para h 2 a 60 ° C e, em seguida, à temperatura ambiente durante a noite. O produto bruto é um precipitado marrom/amarelo oleoso.
    4. Centrifugue a mistura de reação no 3.220 x g durante 10 minutos e remover o sobrenadante. Seca o produto bruto a 25 ° C, usando um evaporador rotativo. Purifica o produto por várias lavagens com acetonitrilo. A cor final do conjugado acids–Pt(II) oleico puro é amarelo-pálido.

2. síntese de KYF-Pt-NE e o FITC-rotulado Nanoemulsão FITC-KYF-Pt-NE

  1. Síntese do tripeptídeo KYF e o tripeptídeo fluorescente etiquetado FITC-KYF
    1. Sintetiza o KYF usando química de peptídeo de estado sólido padrão. Usar o seguinte padrão de condições de acoplamento para anexar cada aminoácido: resina de Wang (2,19 mmol), aminoácido Fmoc protegido (4,38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4,38 mmol) e diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol). Dissolver os aminoácidos com TBTU em dimetilformamida (DMF) e DIPEA.
    2. Mergulhe 5,7 g de resina de álcool de 4-alkoxybenzyl de Fmoc-L-Phe (0.382 meq/g) em 25 mL de DMF para 1 h antes da utilização.
    3. DePROTECT o grupo amina do aminoácido L-fenilalanina com 15 mL de solução de piperidina/DMF 20% por 5 min, descartar o solvente e repita a lavagem com ciclo de 20 min.
    4. Lave a resina por 1 min com os seguintes solventes: DMF, álcool isopropílico (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. Descarte o solvente depois de cada lavagem.
    5. Realize o teste de Kaiser para determinar a presença do grupo de2 NH livre sobre a resina (ver sub-etapas) e se positivo (a semente da resina é roxa), adicionar o Fmoc-L-tirosina aminoácido e realizar o acoplamento durante a noite.
      1. Prepare o Kaiser teste soluções em frascos separados.
      2. Dissolva 5 g de ninidrina em 100 mL de etanol.
      3. Dissolva 80 g de fenol em 20 mL de etanol.
      4. Misture 2 mL de solução aquosa de 0,001 M de cianeto de potássio com
        98 mL de piridina.
      5. Adicione 2-3 gotas de cada Kaiser testar soluções de amostra e calor em água fervendo por 5 min.
    6. Após o bem sucedido acoplamento do segundo aminoácido, realize o teste de Kaiser e caso negativo proceder com protocolo de desproteção (etapas 2.1.3 para 2.1.5). Repita o processo com o Fmoc-fenilalanina aminoácido.
      1. Em cima de acoplamento de todos os aminoácidos, lave a resina por 1 min com 5 mL de DMF, IPA, DMF, metanol, diclorometano e éter dietílico, após cada lavagem descartar o solvente. Salve a resina para processamento adicional.
      2. Use metade da resina para as próximas etapas (2.1.7-2.1.9) para modificar o peptídeo com FITC. Para obter sem modificações KYF tripeptídeo, siga o procedimento começando em 2.1.10.
    7. Modifica o aminoácido N-terminal da KYF KYF-N3 com ácido 6-azidohexanoic. Para este fim, misture 1 g (0.382 mmol) de resina KYF Wang e 120,1 mg (0.764 mmol) do ácido 6-azidohexanoic com 245,2 mg (0.764 mmol) de TBTU e 197,1 mg (1.528 mmol) de DIPEA em 30 mL de DMF. Misture a reação durante a noite em temperatura ambiente.
    8. Obter o KYF-FITC da síntese do KYF-N3 com fluoresceína propargil através de uma reação de clique. Para este efeito, misture 253 mg (0.097 mmol) do KYF-N3 Wang resina com 3,78 mg (0.019 mmol) de CuI sólido, 71,9 mg (0.193 mmol) de fluoresceína propargílico e 2,24 mg (0,017 mmol) de DIPEA. A reação deve mudar a cor de verde para marrom.
    9. Após 24h, lave três vezes a resina por 1 min alternadamente com 5 mL de DMF e IPA cinco vezes, metanol e água três vezes, DMF e água três vezes e com diclorometano e éter dietílico. Descarte o solvente depois de cada lavagem.
    10. Cleave o KYF-FITC ou peptídeo KYF da resina com uma solução de ácido trifluoroacético (TFA) / triisopropylsilane (dicas) / h2O para a relação de 95/2.5/2.5 mais de 3 horas.
    11. Precipitar o peptídeo bruto em um éter etílico frio, lavar três vezes com éter frio e em seguida seco sob vácuo.
  2. Síntese da Nanoemulsão FITC-KYF-estabilizado com Pt(II) (FITC-KYF-Pt-NE) e KYF-Pt-NE
    1. Dissolva 10 mg (0.0126 mmol) de conjugado acids–Pt(II) oleico em 1,5 mL de isopropanol e coloque em uma seringa de 5 mL.
    2. Coloque a seringa com conjugado acids–Pt(II) oleico em uma bomba de seringa e definir o fluxo de 0,1 mL/min.
    3. Para sintetizar o FITC-KYF-Pt-NE, dissolver 1 mg (0.00105 mmol) de FITC-KYF e 1 mg (0.00219 mmol) de KYF (razão molar de 1:2 da FITC-KYF:KYF) em 20 mL de água e ajustar a temperatura da solução a 37 ° C. Cobrir as paredes do recipiente com papel de alumínio para evitar fotobranqueamento do fluoróforo FITC. Para sintetizar o KYF-Pt-NE, dissolver 2 mg (0.0044 mmol) de tripeptídeo KYF em 20 mL de água e ajustar a temperatura da solução a 37 ° C.
    4. Adicione gota a gota o oleico acids–Pt(II) conjugado à solução de tripeptídeo FITC-KYF/KYF ou KYF. Execute esta etapa sob o capô.
    5. Agitar a solução durante a noite em temperatura ambiente para evaporar os solventes orgânicos e permitir a auto-montagem de FITC-KYF-Pt-NE ou KYF-Pt-ne
    6. Concentrar o FITC-KYF-Pt-NE ou KYF-Pt-NE em um concentrador centrífugo (10K MWCO) e lavar três vezes com 4 mL de água nanopure.
    7. Armazenar as soluções aquosas de KYF-Pt-NE e FITC-KYF-Pt-NE a 4 ° C.
    8. Analise para platina conteúdo usando espectroscopia de absorção atómica (AAS), seguindo guia48 as indicações do fabricante.
      1. Prepare-se para a curva de calibração padrões de platina em solução de HCl 10% (escala eficaz para AAS é entre 100 a 1.200 ppb (partes por bilhão)).
      2. Dissolver 50 µ l de solução de KYF-Pt-NE da etapa 2.2 em 100 µ l de água régia (mistura de ácido clorídrico concentrado e ácido nítrico de 3:1) e deixar à temperatura ambiente durante a noite. Adicione 850 µ l de água para atingir um volume de amostra final de 1 mL. Analise a amostra usando AAS. A concentração de ácido final deve ser de 10% em todas as amostras analisadas.
      3. Gravar a leitura da concentração do Pt no ppb e calcular o teor final de platina na amostra (conta para diluição da amostra e o volume inicial de Nanoemulsão).

3. confocal imagem da absorção celular de FITC-KYF-Pt-NE

  1. 6 linhas de células de câncer de ovário (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G e ES2), de sementes para 4 bem-câmara confocal pratos com a densidade de 4,7 x 104 células, por câmara e pre-cultura durante a noite a 37 ° C.
  2. Após 24h, lavar as células três vezes com solução salina tampão de fosfato (PBS) e incube com FITC-KYF-Pt-NE, em meio de cultura celular (consulte a etapa 6.1 para celular linha detalhes específicos) por 15 min a 37 ° C.
  3. Após a incubação, remova a mídia e lavar as células três vezes com PBS.
  4. Consertar as células com metanol a frio por 5 min a-20 º C e lavar três vezes com 1 mL de PBS.
  5. Permeabilize as células com 1 mL de 0.1% Triton-X por 10 min a temperatura ambiente e lavar três vezes com 1 mL de PBS.
  6. Incube as celulas para 90 min com LAMP1 anticorpo conjugado com Alexa Fluor 647 (1ml) às 01:50 diluição em PBS em temperatura ambiente. Em seguida, lave as células 3 vezes com PBS.
  7. Dilua a solução-mãe DAPI (1 mg/mL) a 1 mg/mL em PBS. Em seguida, adicione 1 mL da solução diluída para cada câmara e incube por 15 min à temperatura ambiente. Lave as células 3 vezes com PBS.
  8. Lamelas de montagem em um slide usando o meio de montagem.
  9. Imagem das células usando o microscópio confocal de células vivas no comprimento de onda de excitação de 405 nm, 488 nm e 633 nm. Definir os parâmetros de deteção como segue: poder do laser de 0,2% e não mais de 1%, unidade de Pinole 1 arejado, ganhar mestre 650-750, deslocamento de Digital 0.
  10. Abrir imagem no software de imagem. Sob a imagem exibida, selecione gráficos e selecione Barra de escala de Insert, para inserir a barra de escala para a imagem.

4. estudos de liberação de drogas

  1. Realizar estudos de liberação de drogas em PBS. Ajuste os valores de pH de três buffers de PBS a 7,4, 6,8 e 5,0 respectivamente.
  2. Diluir 5 μL de KYF-Pt-NE em 180 μL de tampão PBS, pH adequado, transferir para 3,5 kDa copo de diálise mini MWCO e incubar a 37 ° C em PBS.
  3. Retire o tampão da cada três tubos de mini diálise em 2, 4, 6, 24, 48 e 140h e medir as concentrações de platina por AAS. Preparar todas as amostras de acordo com a etapa 2.2.8 Mas ajustar o volume final da amostra a 500 µ l.

5. métodos de cultura celular

  1. Células de cultura de linhas A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 em meio de cultura celular (DMEM) suplementado com 10% (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) ou com 15% (TOV - 21G, OV-90) de soro fetal bovino (FBS), com L-glutamina e penicilina/estreptomicina. Crescer todas as células em um 5% de CO2, atmosfera saturada de água a 37 ° C.
  2. Sementes de 3 x 105 células cada placa de 96 poços e pré-cultura durante a noite para experiências de incubação in vitro. Prepare as soluções KYF-Pt-NE, cisplatina e carboplatina em água. Ajuste a concentração de Pt(II) em KYF-Pt-NE para coincidir com a concentração de carboplatina e cisplatina para cada linha de celular. Incubar durante 72 horas a 37 ° C.
  3. Após a incubação, avalie a viabilidade celular usando um ensaio colorimétrico (o ensaio de proliferação celular de MTT). Brevemente, remover médio e adicionar 110 μL de 10% MTT em meio a cada bem e incubar durante 2 h a 37 ° C. Em seguida, adicionar 100 detergente μL de cada poço e incubar durante 5 h a 37 ° C.
  4. Verifique a absorvância a 570 nm, usando o leitor de placas. Analise os resultados usando análise estatística com o teste-Z e P-teste.

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Resultados

Imagem de representante TEM de KYF-Pt-NE preparada usando este protocolo é mostrada na Figura 2A. KYF-Pt-NEs são esféricos na morfologia, bem dispersa e uniforme no tamanho. O diâmetro do núcleo da KYF-Pt-NEs, medido diretamente a partir de três imagens de temperatura com um mínimo de 200 medições feito, é 107 ± 27 nm. O diâmetro hidrodinâmico de KYF-Pt-NE, analisado usando espectroscopia de luz dinâmica (DLS), foi encontrado para ser 240 nm, com um índice de...

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Discussão

Passos críticos na síntese Nanoemulsão incluem ajustando a relação molar entre os substratos, mantendo controle de taxa de fluxo e temperatura durante a adição de acids–Pt(II) oleico, proporcionando tempo suficiente para auto-montagem e purificar o produto usando um coluna de concentrador centrífugo. Estes parâmetros influenciam o tamanho e morfologia de KYF-Pt-NE; assim, é particularmente importante manter a relação molar adequada e ajustar as condições sintéticas corretamente.

A relação entr...

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Divulgações

Os autores não têm um conflito de interesses para divulgar.

Agradecimentos

Reconhecemos, com gratidão, apoio financeiro do Instituto Nacional de câncer, conceda SC2CA206194. Sem interesses financeiros concorrentes são declarados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônio
tetrafluoroborato (TBTU)		ANASPEC INC.:AS-20376
Prato confocal de câmara de 4 poçosSPPS Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific154526Para imagens de
ácido 6-bromohexanóicoChem-Impex INT' L INC.24477Clique na modificação para o peptídeo
A2780Generosamente doado pelo professor John Martignetti do Hospitalcelular de câncer de ovário
Barnstead NanopureThermo FisherD11901sistema de filtragem de água
BUCHI rotavapor R-3BuchiZ568090Para remoção de solvente e secagem de amostras
Centrífuga 5810 Reppendorf5811FPara separação de complexo de platina
Cis-diclorodiamina platina (II) 99%Acros Organics19376-0050testes in vitro
CP70Generosamente doado pelo professor John Martignetti do HospitalLinha celular de câncer de ovário
Banho-maria digitalVWR97025-134Para aquecimento de meios para cultura de células
Espalhamento dinâmico de luz (DLS)Brookhaven Instrument CorporationPara medições de tamanho de nanopartículas
ES-2ATCCCRL-1978linha celular de câncer de ovário
Fmoc-L-Lys (Boc) -OH 99,79%Chem-Impex INT ' L INC.00493SPPS
Fmoc-L-Phe 4-alcoxibenzílico resina de álcool (0,382 meq/g),Chem-Impex INT' L INC.01914SPPS
Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98%Alfa AesarH59730SPPS
HERACELL 150i Incubadora de CO2 IncubadoraThermo Scientific FisherBomba
seringa de alta pressãoNew Era1010-USPara adição de complexo de platina na síntese de nanopartículas
Placa de aquecimento/agitadorVWR12365-382Para agitação e aquecimento de amostras
Anticorpo LAMP-1 (cojugated com Alexa Fluor 647)Santa Cruz Biotechnologysc-18821 AF647Para imagem de
imagem N, N-diisopropiletilamina (DIPEA)Oakwood Chemical005027SPPS
Ninidrina 99%Alfa AesarA10409Kaiser teste
Ácido oleicoChem-Impex INT ' L INC.01421Para síntese de complexo de platina
OV90ATCCCRL-11732Linha celular de câncer de ovário
PBSCorning21-031-CVPara lavagem de células
Meio de montagem PermountFisher ChemicalSP15-100Para imagem de imagem
FenolFisher ChemicalA92500Teste Kaiser
Ácido fosfotúngsticoFisher ChemicalColoração negativa A248-25para TEM
Piperidina 99%BTC219260-2.5LSPPS
Platinum AAS soultion padrãoAlfa Aesar880861000ug / ml para curva
de calibração Brometo de propargyl 97%Alfa AesarL10595Para modificação de alcino de fluoresceína
Gabinete biológico científicoThermo Scientific Fisher1385Bio-hood para cultura de células
Sistema de vácuo autolimpanteWelch2028Bomba de vácuo para rotavapor
Nitrato de prataAcros Organics19768-0250Ativação da cisplatina
SKOV3ATCCHTB-77Linha celular de câncer de ovário
Hidróxido de sódioFisher ScientificS313-1Para síntese de complexo de platina
Cloretode estanho (II)Teste de 208256 Sigma Aldrichpara presença de platina
TOV21GATCCCRL-11730Linha celular de câncer de ovário
Ácido trifluoroacético 99% (TFA)Alfa AesarL06374SPPS
Triisopropilsilano (TIPS)Chem-Impex INT ' L INC.01966SPPS
Triton-XSigma AldrichT8787-100MLPara imagem em
pó de uranina 40%Fisher ScientificS25328APara modificação de alcino de fluoresceína
Vivaspin 20 (10000 MWCO)SartoriousVS2001Para lavagem e condensação de nanopartículas
VWR Microscópio invertido VWR89404-462Para monitoramento de cultura de células
Mount Sinai Linha Mount Sinai de

Referências

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  4. Roy Chowdhury, M., Schumann, C., Bhakta-Guha, D., Guha, G. Cancer nanotheranostics: Strategies, promises and impediments. Biomedicine & Pharmacotherapy. 84, 291-304 (2016).
  5. Jeevanandam, J., Chan, Y. S., Danquah, M. K. Nano-formulations of drugs: Recent developments, impact and challenges. Biochimie. , 99-112 (2016).
  6. Meerum Terwogt, J. M., Groenewegen, G., Pluim, D., Maliepaard, M., Tibben, M. M., Huisman, A., ten Bokkel Huinink, W. W., Schot, M., Welbank, H., Voest, E. E., Beijnen, J. H., Schellens, J. M. Phase I and pharmacokinetic study of SPI-77, a liposomal encapsulated dosage form of cisplatin. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 49 (3), 201-210 (2002).
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