Single-produção complementares técnicas analíticas de alta resolução para caracterização de misturas complexas de matéria orgânica Natural

Summary

Este protocolo descreve uma única taxa de transferência de técnicas complementares, analíticas e omics, culminando em uma caracterização-pareado de matéria orgânica natural e proteomics microbiana nos diferentes ecossistemas. Esta abordagem permite comparações robustas para a identificação de vias metabólicas e transformações importantes para descrever a produção de gás de efeito estufa e prevendo respostas a mudanças ambientais.

Abstract

Matéria orgânica natural (NOM) é composta por uma mistura altamente complexa de milhares de compostos orgânicos que, historicamente, revelou-se difícil caracterizar. No entanto, para entender os termodinâmicos e cinéticos de controles na produção de gás (dióxido de carbono [CO₂] e [CH₄] de metano) com efeito de estufa resultantes da decomposição de NOM, uma caracterização do nível molecular juntamente com microbiana análises de Proteome é necessário. Além disso, clima e mudanças ambientais são esperadas para perturbar os ecossistemas naturais, potencialmente perturbador interações complexas que influenciam tanto o fornecimento de substratos matéria orgânica e microorganismos realizando as transformações. Uma detalhada caracterização molecular da matéria orgânica, proteomics microbiana e os caminhos e transformações pelo qual a matéria orgânica é decomposta será necessária prever a direção e a magnitude dos efeitos das mudanças ambientais. Este artigo descreve um throughput metodológica para caracterização do metabólito abrangente em uma única amostra por injeção direta de Fourier transform íon cíclotron ressonância espectrometria de massa (FTICR-MS), espectrometria de massa de cromatografia gasosa (GC-MS), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR), espectrometria de massa de cromatografia líquida (LC-MS) e análise proteômica. Essa abordagem resulta em um conjunto de dados totalmente emparelhados que melhora a confiança estatística para inferir caminhos de decomposição de matéria orgânica, a resultante de CO₂ e taxas de produção de₄ CH e suas respostas a perturbação ambiental. Aqui apresentamos os resultados da aplicação deste método para NOM amostras coletadas de turfeiras; no entanto, o protocolo é aplicável para qualquer amostra NOM (por exemplo, turfa, solos florestais, sedimentos marinhos, etc.).

Introduction

Globalmente, as zonas húmidas são estima-se que contêm Pg 529 de carbono (C), principalmente como orgânico C enterrado em depósitos de turfa¹. Atualmente, tais turfeiras atuam como uma líquido C pia, sequestrando 29 Tg C y^-1 na América do Norte sozinho¹. No entanto, perturbações ambientais tais como drenagem, incêndios, seca e temperaturas mais quentes podem compensar esse coletor C, aumentando a decomposição de matéria orgânica, resultando em aumento C perdas através de gases de efeito estufa (dióxido de carbono [CO₂] e ^1,de produção metano [CH₄

Protocol

1. sequencial extração de matéria orgânica do solo, sedimentos ou turfa

1. Coletar o solo, sedimentos ou turfa através do dielétrico e dividir os núcleos de acordo com a hipótese que está sendo testado (por exemplo, profundidade). Loja de amostras em politetrafluoretileno revestido recipientes e congelam a-80 ° C para armazenamento antes da análise.
   Nota: Aproximadamente 25 mg C é necessária para este protocolo. Para turfa (normalmente 45% C), 50 mg de turfa seca é necessária. Maiores quantidades de amostra podem ser necessária para baixas amostras orgânicas como solos minerais ou florestais planaltos dependendo o C (até 5 g) de conteúdo. E....

Results

Realizamos o protocolo descrito análise complementar e comparado a turfa com profundidade no pântano S1 no site Spruce e turfeiras resposta sob mudando ambientes (SPRUCE) em Minnesota, EUA. Estes resultados são comparados aos de um pântano de permafrost e fen do norte da Suécia, para mostrar como sites podem variar em atividades metabólito e enzima. Nós identificamos 3.312 enzimas na análise proteômica. Uma análise das atividades enzimas com profundidade revela que o número de enzimas declina acentuadamente entre 15cm e .......

Discussion

O single-produção, fluxo de análise totalmente acoplados usado para caracterizar metabólitos e o proteome fornece insights sobre os caminhos pelos qual C ciclismo está ocorrendo em um complexo ecossistema. Solo e a turfa são matrizes heterogêneas, e, portanto, uma das etapas críticas desse método ocorre nos primeiros passos no sentido de garantir que a partida de turfa ou material de solo é altamente homogênea. É preferível moer a amostra, bem como agregados podem reduzir a eficiência de extração. Este é um problema part.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
cloridrato de metoxiamina	Sigma Aldrich	226904	agente de derivitização
sonda fria tolerante a sal de ressonância tripla	instrumentação Bruker
Coluna HP-5MS (30 m &vezes; 0,25 mm &vezes; 0,25 μ m)	Agilent	AG19091S-433	instrumentação
coluna híbrida de superfície carregada de fase reversa (3,0 mm &vezes; 150 mm &vezes; 1,7 μ m tamanho de partícula)	Instrumentação ThermoFisher
frascos de vidro de 2 mL, frascos de amostra	VWR International	46610-722	frascos
amostrador automático, VWR	International	97055-324; 9467671	frascos de amostra:
clorofórmio	VWR International	JT9174-3	solvente
, etanol	VWR International	BDH67002.400
metanol	VWR International	BDH85681.400	solvente
piridina	VWR International	BDH67007.400	solvente
2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato-d6	Sigma Aldrich	178837	padrão
C8-C24 éster metílico de ácidos graxos	Sigma Aldrich	CRM18918	padrão
N-metil-N- (trimetilsilil)trifluoroacetamida	Sigma Aldrich	24589-78-4	padrão
Suwanee River Fulvic Acid padrão	International Humic Substances Society	2S101F	padrão
trimetilclorossilano	Sigma Aldrich	89595	solução de
ajuste	Agilent
FTICR-MS software de análise	Bruker	Compass DataAnalysis 4.1
Formularity Software	Pacific Northwest National Laboratory	Formularity	disponível para download em: https://omics.pnl.gov/software/formularity
GC-MS		Agilent Agilent GC 7890A com sorvente à base de sílica MSD 5975C
	Phenomenex (Torrance, CA)	Strata C18-E (PN 8E-S001-DAK)
TUBO DE RMN 3MM 8 150 CS5	VWR International	KT897820-0008	Tubo de RMN
Espectrômetro de RMN de 600 MHz Direct Drive da Varian	Espectrômetro de RMN	600 MHz Varian	Inova
de RMN Chenomx NMR Suite 8.3	Chenomx	Chenomx NMR Suite	Software de RMN
de ultra-desempenho cromatógrafo líquido	águas	Aquity UPLC H	cromatógrafo líquido
Espectrômetro de massa Velos-ETD Orbitrap	Espectrômetro de massa ThermoFisher	Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos