O atual protocolo descreve um método integrado, investigando a migração de células de câncer e invasão em uma única plataforma em tempo real, fornecendo uma opção facilmente reproduzível e tempo-eficiente para estudar a morfologia e mobilidade celular.
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Artigo de método
Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha
Neste artigo
Resumo
Resumo
Mobilidade de células de câncer é crucial para a iniciação de metástase. Portanto, a investigação do movimento da célula e capacidade invasiva é de grande importância. Ensaios de migração fornecem uma visão básica do movimento de célula a um nível 2D, Considerando que os ensaios de invasão são fisiologicamente mais relevantes, imitando a expulsão de célula de câncer em vivo do site original e invadindo através da matriz extracelular. O protocolo atual fornece um único fluxo de trabalho para os ensaios de migração e invasão. Juntamente com a automatizado microscópica câmera integrada para imagens HD em tempo real e análise de built-in módulo, dá pesquisadores um tempo-eficiente, simples e reprodutível opção experimental. Este protocolo inclui também substituições para os consumíveis e métodos de análise alternativos para os usuários a escolher de.
Introdução
Migração celular e invasão são importantes processos biológicos que permitem que as funções normais do corpo humano, tais como fechamento de ferida, invasão da placenta no útero e glândula mamária morfogênese1,2,3. O corpo humano tem controle preciso e rigoroso destes eventos biológicos; no entanto, existem algumas exceções. Tumores malignos, por exemplo, são capazes de escapar esta salvaguarda, apresentam proliferação anormal e invadir no tecido vizinho, que é chamado de metástase. Metástase é a principal causa de mortalidade relacionadas ao câncer4.<....
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Protocolo
Nota: Duas linhas de célula devem ser tratadas separadamente. Os procedimentos a seguir devem ser aplicados a uma linha única célula se não especificados.
1. otimizar a densidade celular antes ferindo
- Cultura de células aderentes em frascos de cultura de tecidos de2 T75 cm a cerca de 80% confluência no de vermelho de fenol livre Dulbecco modificado águia médio (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 200 mM L-glutamina e 2 insulina µ g/mL a 37 ° C com 5% CO2 ( condições de incubação padrão para a maioria das linhas de células de câncer, formulações de cultura são células depend....
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Resultados
Este ensaio de migração/invasão baseia-se o ensaio de cura da ferida, que avalia a taxa das células entrando uma área livre de celular criada pela ferramenta zero 96 pinos. A diferença entre os ensaios de migração e invasão são que ensaios de migração células medida movendo-se sobre os tecido-cultura tratada plástico superfície e invasão medidas células movendo gel de ECM.
A ferramenta para raspar é projetada para tornar consist.......
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Discussão
Migração e invasão são parâmetros importantes para avaliar a mobilidade das células cancerosas. Usando a ferramenta para raspar 96-pin, é possível realizar a ferida cura ensaios em 2D e 3D simultaneamente. Além de facilitar a varredura automática, proporcionando um ambiente de cultura celular estável com o mínimo de interrupção, o zero ensaio realizado com o uso da ferramenta para raspar 96 pinos fornece consistentes feridas zero, permitindo que as experiências que são mais robustas e pode ser reproduzido. O formato de p.......
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Divulgações
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Agradecimentos
Nós gostaríamos de reconhecer nosso apoio financiamento pela Fundação de grupo de Bloomfield, através do Instituto de pesquisa médica do Hunter (HMRI 13-02). X.Z é suportado por uma bolsa de APA através da Universidade de Newcastle e a bolsa de doutoramento HCRA biomarcadores emblemática.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de tripsina-EDTA a 0,5% (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Diluir para 2x em DPBS |
| Countess II FL Contador de células automatizado | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Contador de células automatizado |
| Detergente 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | concentração de trabalho de 0,5% |
| Detergente 2 (Virkon S) | VetProduto DIRETO | 1% de trabalho concentração | |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium, sem fenol-vermelho | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Fornecido com 10% de FBS, 200 mM L-glutamina, 2 μ g/ml de insulina |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Fator de crescimento reduzido, sem vermelho de fenol |
| Essen ImageLock Placa de 96 poços, fundo plano | Essen | 4379 | |
| EVE Lâminas de contagem | BioTools | EVS-50 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96 poços de invasão de células de ferida de arranhão acessórios | Essen | 4444 | Incluindo CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Kit de migração de células | Essen | 4493 | Incluindo o bloco de pinos de 96 poços, 2x barcos de lavagem e o software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Sistema de análise de células vivas | |
| Solução de insulina humana | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| Solução de L-glutamina (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Balão de cultura de tecidos, área de crescimento de 75 cm2 | Greiner Bio-One | 658175 |
Referências
- Graham, C. H., Lala, P. K. Mechanisms of placental invasion of the uterus and their control. Biochemistry and Cell Biology. 70, 867-874 (1992).
- Affolter, M., Zeller, R., Caussinus, E. Tissue remodelling through branching morphogenesis. Nature Reviews Mo....
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Reimpressões e permissões
