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Artigo de método

Avançado de imagem do pulmão Homing linfócitos humanos em um Experimental em modelo Vivo de inflamação alérgica baseada em microscopia de luz-folha

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DOI:

10.3791/59043

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16 de abril de 2019

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1Department of Medicine 1, University Hospital of Erlangen, 2Department of Medicine 3, University Hospital of Erlangen

Neste artigo

Resumo

O protocolo introduzido aqui permite a caracterização da capacidade pulmonar localizador de linfócitos humanos primários sob condições inflamatórias em vivo. Infiltração pulmonar de enviaram transferidas células imunes humanas em um modelo do rato da inflamação alérgica pode ser fotografada e quantificada por microscopia de fluorescência de luz-folha de tecido pulmonar quimicamente limpo.

Resumo

Esmagadora de acumulação de tecido de células do sistema imunológico altamente ativadas representa uma marca registrada de várias doenças inflamatórias crônicas e emergiu como um alvo terapêutico atraente no manejo clínico dos pacientes afetados. Para otimizar ainda mais as estratégias destinadas a terapêutico regulamento de infiltração de tecido patologicamente desequilibrada de células do sistema imunológico pró-inflamatórias, será de grande importância para atingir melhorou introspecções em doenças e órgão-específicas Localização de propriedades de linfócitos periféricos. O protocolo experimental descrito aqui permite monitorar o acúmulo de pulmão de linfócitos humanos fluorescente etiquetados e enviaram transferidos no contexto de inflamação pulmonar induzida por papaína. Em contraste com ensaios in vitro padrão frequentemente utilizados para a análise da migração de células imunes e quimiotaxia, a configuração em vivo agora introduzida leva em conta os aspectos de pulmão específicas de organização do tecido e a influência do complexo inflamatório cenário que ocorrem no organismo vivo murino. Além disso, imagem microscópica tridimensional transversal fluorescência de luz-folha só não fornece dados quantitativos sobre a infiltração de células do sistema imunológico, mas também descreve o padrão de localização da célula imune dentro do pulmão inflamado. Em geral, somos capazes de introduzir uma técnica inovadora de alto valor para a investigação imunológica no campo das doenças pulmonar inflamatória crônica, que pode ser facilmente aplicado, seguindo o protocolo passo a passo fornecido.

Introdução

Desordens inflamatórias clássicos do pulmão, como alérgica asma e doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), são conhecidos para ser conduzido por um maior recrutamento de linfócitos ativados no tecido pulmonar1,2. Linfócito-lançado citocinas (por exemplo, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IFN-γ e TNF-α) promover quimiotaxia de células do sistema imunológico inatas e adaptativas, induzir a remodelação das vias respiratórias fibrótica ou danificar diretamente o de parênquima pulmonar2. Até agora, os mecanismos subjacentes responsáveis para o acúmulo patológico de linfócitos no tecido pulmonar não são ainda totalmente compreendidos. Em analogia à impressão de tecido-seletiva de célula T descrito para hospedagens de intestino e pele, pulmonares células dendríticas (DCs) são obviamente capazes de prime periféricas células T para infiltração pulmonar preferencial, pelo menos em parte através da indução de expressão CCR4 na superfície de linfócitos3. Além de CCR4, as células T infiltrando as vias aéreas também são caracterizadas por uma expressão particularmente aumentada dos receptores de chemokine CCR5 e CXCR3 em comparação com as células T no sangue periférico1,4,5. Globalmente, existentes de dados são consistentes com o conceito que homing de pulmão dos linfócitos T sob condições fisiológicas ou inflamatórios envolve uma série de chemokine diferentes receptores e seus respectivos ligantes e assim crucialmente depende uma estreita colaboração controlada a colaboração entre células do sistema imunológico inato e adaptativo1. Especialmente, durante a fase inicial de exposição do patógeno ou alérgeno, células do sistema imunológico inato respondem à estimulação TLR ou do cross-linking IgE mediada pela liberação imediata de diferentes quimioatraentes, como LTB4, CCL1, CCL17, CCL22, CCL20, CXCL10 e PGD21,6,7. Como um exemplo, a interação entre o PGD2 e o receptor quimiotático CRTh2 é conhecido por ser de particular importância para a quimiotaxia de células Th2 e assim apareceu o alvo terapêutico tão promissor no manejo clínico de asma. De fato, pacientes com asma moderada mostraram uma melhoria dos sintomas e um aumento significativo do volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF1) após o tratamento com um antagonista seletivo de CRTh2 em comparação com o placebo grupo8 ,9. Em um estado mais progrediu da resposta inflamatória, já recrutou as células T são capazes de amplificar ainda mais o acúmulo de linfócitos pulmonar através da liberação de IL-4 e IL-13 como potentes estímulos para DCs pulmonares. Posteriormente, essas células inatas mieloide-derivado up-regulam a expressão de CCL17 e CCL22 em um STAT6-dependente maneira1,10,11.  Embora a complexidade do cenário descrito ainda dificulta uma compreensão completa do pulmão de células T de orientação, oferece uma infinidade de alvos moleculares para um controle terapêutico potencialmente otimizado de doenças pulmonares inflamatórias ou alérgicas. Portanto, há uma necessidade urgente de técnicas experimentais inovadoras, capazes de complementar nosso conhecimento no campo da quimiotaxia de células T e hospedagens de pulmão e aprofundar ainda mais.

Devido ao fato de que a orientação do pulmão de linfócitos dentro do corpo humano é influenciada por vários parâmetros celular, humoral e física1, a maioria dos métodos experimentais existentes não é capaz de modelar a toda complexidade deste processo imunológico. Em vez disso, muitos protocolos padrão para a análise do pulmão orientação seletivamente focar um aspecto específico envolvido em cascata de atração de linfócitos, adesão, migração e retenção. Além de uma determinação puramente descritiva do padrão de expressão do mRNA ou proteínas dos receptores integrinas e chemokine em linfócitos periféricos ou pulmão infiltrando e a medida complementar do chemokine respectivos níveis no sangue, lavagem broncoalveolar (BAL) ou tecido pulmonar12,13,14,15, ensaios de cultura de células in vitro bem-estabelecida permitem uma caracterização funcional da aderência dos linfócitos ou quimiotaxia após definidas condições experimentais16,17,18. Em princípio, os ensaios de aderência in vitro estático monitoram a capacidade de ligação de linfócitos culturas uma monocamada endotelial ou lâminas de vidro revestidas com moléculas de adesão endotelial recombinante (por exemplo, MAdCAM-1, VCAM-1), enquanto norma in vitro ensaios de quimiotaxia geralmente são aplicados de forma a quantificar a capacidade dos linfócitos de migrar ao longo de um gradiente de chemokine em um sistema de transwell19. Ambas as configurações em vitro permitem um ajuste controlado e modulação das condições experimentais, mas por outro lado, falta variáveis importantes conhecidas por criticamente o impacto na quimiotaxia in vivo e aderência dos linfócitos. Predominantemente, ensaios de cultura estáticas de célula desconsiderar a influência das forças de cisalhamento causado pelo fluxo de sangue permanente19 e potencialmente negligenciam o envolvimento do meio circundante de imunológico e interação não-linfócitos células imunes, os dois presentes em um organismo vivo. Para superar essas limitações, a interpretação dos resultados adquiridos em ensaios in vitro de quimiotaxia ou aderência estáticos precisa mais validação em experimentos de adesão dinâmico sob condições de fluxo20,21 e em modelos de vivo do órgão inflamatória patologia19. De facto, importante na regulação do pulmão de células T orientação sob condições inflamatórias ou alérgicas poderia-se conclusões de estudos com animais analisando geneticamente modificado ratos em modelos definidos de diferentes doenças pulmonares3, 22 , 23. a comparação quantitativa do pulmão infiltrando linfócitos entre sua ratos e camundongos com deficiência para um gene específico de interesse representa uma ferramenta bem estabelecida e amplamente utilizada para definir o impacto de celular particular caminhos ou receptores no padrão de distribuição de células T orientada para a doença. No entanto, em contraste com antes de que discutidos ensaios de cultura de células in vitro, um estudo design baseado em modelos animais clássicos não possui a capacidade de analisar e monitorar primárias células T humanas, diretamente derivadas do sangue ou BAL de pacientes que sofrem de um pulmão inflamatório doença. Assim, ainda permanece desafiador para validar funcionalmente se uma doença de pulmão para o diagnóstico especificado é capaz de imprimir linfócitos humanos para tropismo preferencial do pulmão e quão longe de parâmetros clínicos podem impacto sobre esse cenário. Recentemente, uma abordagem muito elegante em vivo foi introduzida no contexto de doenças inflamatória intestinal (IBD), que foi capaz de superar a maioria destas limitações e abriu novos caminhos para estudos avançados de translação no linfocito intestinal homing24 . Aproveitando-se dos protocolos para compensação de tecido à base de solvente, seguido por microscopia de fluorescência de luz-folha transversal como uma poderosa ferramenta de geração de imagens, foi possível visualizar a infiltração e a distribuição de pilhas de T humanas enviaram transferidas no intestino de camundongos imunodeficientes colitic24. Em particular, essa configuração experimental implementado duas inovações principais: (1) células do sistema imunológico humano primário podem ser analisado sob condições in vivo experimentalmente definidas; (2) uma área bastante grande do órgão doente (aproximadamente 1,5 x 1,5 cm) pode ser fotografada em qualidade de alta resolução, seguida de reconstrução 3D. Além disso, vários estudos recentes estabeleceram com êxito o uso de tecido à base de solvente limpando e microscopia de fluorescência de luz-folha como ferramentas importantes para o pulmão avançado de imagem25,26. Para beneficiar desta evolução tecnológica no campo da imunologia pulmonar, adotamos o sistema de análise de hospedagens de pulmão.

O protocolo apresentado aqui oferece uma introdução passo a passo como purificar e fluorescente etiqueta primária humana T células para transferência em ratos com inflamação pulmonar induzida e, além disso, descreve em detalhes o processo subsequente de luz-folha fluorescência microscópico imagem latente, incluindo preparação de órgão e processamento de imagem. Em geral, esperamos apoiar estudos translacionais futuros no campo das doenças pulmonares inflamatórias ou alérgicas introduzindo um sofisticado, mas o modelo experimental, no entanto, viável para o monitoramento de hospedagens de pulmão linfócito humano nas condições in vivo.

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Protocolo

Foram realizados experimentos envolvendo animais em conformidade com os protocolos aprovados pelas autoridades locais relevantes em Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Alemanha). Os ratos foram alojados em condições específicas isentos de organismos patogénicos. A coleção de sangue humano foi aprovada pelo Comitê de ético local e o Conselho de revisão institucional da Universidade de Erlangen-Nuremberga. Cada paciente deu consentimento escrito.

1. induzir inflamação alérgica pulmonar em ratos

Nota: Conforme descrito em anteriores estudos27, o seguinte procedimento experimental permite a indução de inflamação alérgica das vias respiratórias em camundongos e, consequentemente, provoca o acúmulo de células do sistema imunológico inatos e adaptativos em BAL. O protocolo descrito foi estabelecido em camundongos C57BL/6J, mas adoção para outras tensões puras padrão deve ser possível.

Consulte a Figura 1A , para obter um resumo do procedimento experimental in vivo.

  1. ANESTHETIZE ratos por injeção intraperitoneal de xilazina/cetamina.
    Nota:     apenas usar camundongos C57BL/6J mais velhos do que 6 semanas e com um peso corporal de pelo menos 16 g.
    1. Preparar a solução de xilazina/cetamina em PBS (12 mg/mL cetamina; xilazina 1,6 mg/mL) e determinar o peso exato dos ratos.
    2. Injetar o primeiro rato com 8 µ l/g de peso vivo de xilazina/cetamina solução intraperitonealmente e confirmar a anestesia profunda através da ausência de reflexo de pitada a pata antes de prosseguir para a etapa 1.3.
  2. Na hora prepare 5 mg/mL de papaína em PBS. Lentamente, pipete 10 µ l (50 µ g) da solução de papaína na narina. Monitore cuidadosamente o mouse até despertar.
  3. Repita as etapas 1.1 e 1.2 para todos os mouses incluídos no experimento. Execute as etapas 1.1-1.3 em três dias consecutivos.

2. purificar e etiqueta fluorescente CD4 de sangue periférico humano+ células T

Nota: Processos células em condições estéreis.

  1. Recolha 18 mL de sangue total humano de uma veia periférica. Realize a centrifugação gradiente de Ficoll-Hypaque para selecionar a fração de células mononucleares de sangue periférico (PBMC).
    Nota: Coleta e análise de material humano primário precisam ser aprovada pelas autoridades locais de éticas. Somente uma pessoa com uma qualificação médica adequada é permitida para coletar o sangue de uma veia periférica.
    1. Coletar sangue em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-contendo monovettes (1,6 mg sangue EDTA/mL) para evitar a coagulação.
      Opcional: Use o sangue de buffy coat, um subproduto da doação de sangue enriquecido em leucócitos, em vez de sangue venoso completo.
    2. Transferir o sangue para um tubo cónico de 50 mL e diluir a 1:2 em salina tamponada fosfato (PBS). Cuidadosamente, adicionar 10 mL de Ficoll e médias (densidade 1,077 g/mL) como uma camada de fundo sob o sangue diluído. Centrifugar a amostra (800 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente sem freio).
    3. Cuidadosamente remova o tubo de centrífuga e transferir a interfase PBMC, contendo em um novo tubo cónico de 50 mL. Descarte o superior e a camada inferior. Encha o tubo contendo PBMC com PBS e centrífuga (300 x g durante 10 minutos a 4 ° C). Remova o sobrenadante.
      Nota: Opcionalmente, se necessário, realize a lise de eritrócitos remanescentes. Cuidadosamente, adicione 3 mL de tampão de lise (ACP) de amónio-cloreto-potássio (cloreto de amônio de 155 mM, 19mm potássio hidrogênio carbonato e 0,68 mM EDTA; pH 7,27) para a ressuspensão centrifugado e vortex a amostra. Agite os tubos por 3 min. Para remover o tampão de Lise ACP, adicione 40 mL de PBS e centrífuga (300 x g durante 10 minutos a 4 ° C). Descarte o sobrenadante.
  2. Purificar o CD4+ T células através de microbeads CD4.
    Nota: Em geral, existem vários distribuidores de microbeads magnéticos para a purificação de CD4 humano+ células, o que deverá resultar em níveis comparáveis de pureza de célula. Escolha do produto deve ser baseada nas preferências individuais. As seguintes etapas do protocolo (2.2.2–2.2.7) são ajustadas para um produto de Microconta de CD4 definido e separação respectivas colunas como mais indicado na Tabela de materiais. Algumas modificações do protocolo podem ser exigidas no caso que um produto de Microconta de CD4 alternativo está seleccionado.
    1. Resuspenda o pellet PBMC em um mínimo de 80 µ l de PBS contendo 0,5% de soro fetal bovino (FBS) e 2 mM de EDTA (/ FBS/EDTA-tampão PBS) por 107 PBMC. Uso uma população inicial de cerca de 30 x 106 PBMC para acabar-se com cerca de 3 x 106 6 x 106 purificado CD4 humano+ T células.
    2. Adicionar 20 µ l de CD4 microbeads por 107 PBMC, misture delicadamente e incube por 20 min a 4 ° C. Encha o tubo com/FBS/EDTA-tampão PBS (refrigerado até 4 ° C) e centrifugar (300 x g durante 10 minutos a 4 ° C). Remova o sobrenadante.
    3. Coloca uma coluna de separação em um campo magnético. Lave a coluna com 3 mL de PBS/FBS/EDTA-tampão. Ressuspender as células em 500 µ l de PBS/FBS/EDTA-buffer (refrigeração até 4 ° C) e transferir a suspensão de células para a coluna de separação enxaguado colocada dentro de um campo magnético.
    4. Lavar a coluna de separação três vezes com 3 mL de PBS/FBS/EDTA-tampão (refrigerado até 4 ° C) e descartar o efluente.
    5. Remover a coluna de separação de campo magnético e colocá-lo em um tubo de 15 mL. Eluir o CD4+ fração celular em 5 mL de PBS/FBS/EDTA-buffer usando o êmbolo.
    6. Encha o tubo com PBS e centrífuga (300 x g durante 10 minutos a 4 ° C). Remova o sobrenadante. Repita este passo de lavar duas vezes.
    7. Determine o número de células rendidos por um método padrão de escolha (por exemplo, câmara de Neubauer).
  3. Rotular o CD4+ T células com um corante de proliferação celular fluorescente.
    1. Resuspenda CD4+ T células em PBS (até 107 células/mL; não use menos de 500 µ l de PBS).
    2. Preparar uma solução de 6 µM de uma proliferação de célula excitável-luz vermelha tingir (ver Tabela de materiais) em PBS (pré aquecido à temperatura ambiente). Misturar esta solução 1:2 com o antes preparado suspensão de células e vórtice completamente (concentração final de 3 µM).
    3. Incube durante 10 minutos a 37 ° C (protegido da luz). Depois, adicionar cinco volumes de meio RPMI contendo 10% FBS e incubar durante 5 min no gelo (protegido da luz).
    4. Lavagem rotulado células três vezes em RPMI médio contendo 10% FBS (centrifugar x g por 10 min a 4 ° C). Resuspenda as pilhas etiquetadas em PBS, armazenar no gelo e proteger da luz até o uso.
      Nota: Prolongado de armazenamento de células (> 60 min) pode ter um impacto negativo na sobrevivência da pilha.
      Opcional: Determinar a pureza do CD4+ fração e a eficácia do processo de rotulagem celular por citometria de fluxo. Resuspenda 0,5 x 106 a 1 x 106 CD4+ células em 100 µ l de tampão (1% FBS, 2 mM EDTA em PBS) e adicionar um anticorpo de CD4 anti-humano juntamente com um corante fluorescente de escolha. Incubar durante 30 min a 4 ° C. Adicione 1 mL de tampão e centrífuga (300 x g durante 10 minutos a 4 ° C). Descarte o sobrenadante. Prosseguir com a medição de fluxo cytometric da amostra (representativo resultado está representado na Figura 1B, C).

3. enviaram transferir CD4 humano+ T células em papaína-expostos Mmice destinatário

Nota: Consulte a Figura 1A , para obter um resumo da vivo em executou o procedimento experimental. Realizar a transferência de células um dia após a última administração intranasal de papaína.

  1. Ajustar a suspensão de CD4 humano fluorescente etiquetadas+ T células (etapa 2.3.4) a uma concentração de 1 x 107 células/mL de PBS. Preencher 100 µ l de suspensão de células em um 1ml/30 G-seringa.
  2. Coloque cuidadosamente o primeiro papaína-expostos C57BL/6J mouse (passos 1.1-1.3) em um dispositivo de retenção para injeção de veia da cauda. Use a seringa preparada (passo 3.1) para perfurar a veia da cauda e lentamente injete 100 µ l de suspensão de células contendo 1 x 106 rotulado CD4 humano+ células. Não imediatamente puxe a agulha após a injeção, mas espere adicionais 5 segundos para evitar a descarga da suspensão celular.
  3. Solte o mouse do dispositivo de retenção e prosseguir com o próximo animal. Manter pelo menos um animal exposto a papaína, que não sejam objecto de transferência com células fluorescente etiquetadas para servir como controle negativo para microscopia de fluorescência de luz-folha.

4. prepare o tecido pulmonar por microscopia de fluorescência de luz-folha

Nota: As seguintes etapas são executadas 3 h após transferência de fluorescente etiquetado células humanas (passo 3.2). Os procedimentos experimentais descritos, incluindo a colheita do tecido pulmonar, fixação e tecido à base de solvente de compensação foram adaptados de protocolos descritos atualmente24,28.

  1. Sacrifica o mouse por inalação de dióxido de carbono (C02).
  2. Perfundir o pulmão in situ com PBS contendo 5 mM EDTA.
    1. Abra o tórax através de corte ao longo do esterno para expor o coração. Punctate ventrículo direito com uma cânula 21G conectado a um cateter.
    2. Abra o ventrículo esquerdo por um corte e, assim, permitir que o fluido do sangue e da perfusão sair. Lentamente perfundir o pulmão com 20 mL de PBS gelado contendo 5 mM EDTA através do cateter.
  3. Para efetuar a fixação in situ do pulmão, não remova o cateter do ventrículo direito. Lentamente perfundir o pulmão com 2 mL de gelado paraformaldeído 4% (PFA), resolvido em PBS. Remova o cateter e a cânula.
    Nota: Baseado em PFA fixação in situ do tecido pulmonar representa uma técnica bem estabelecida para preparar o tecido do pulmão murino para posterior análise microscópica29,30.
    Atenção: PFA é tóxico e tem que ser feito sob um capuz com cuidado.
  4. Encha o pulmão com agarose 0,75% in situ.
    1. Preparar a agarose 0,75% em PBS e mantê-lo sólido a 50 ° C em um thermo-shaker até o uso. Remover as glândulas salivares do mouse, corte o músculo sternohyoid e expor a traqueia deslizando um fórceps por baixo.
    2. Pontuam a traqueia exposta com uma agulha de 30g e substitui-lo por um cateter de 30g contundente para evitar causar mais danos da traqueia resultando em vazamento indesejado de agarose. Sele a junção entre o cateter inserido e da traqueia usando um porta-agulha.
      Opcional: Combinar o aqui descrito procedimento com coleção de BAL analisar células humanas infiltradas no BAL recentemente descrita em detalhe31 (ver Figura 2,E para resultados representativos).
    3. Com cuidado, encha as vias aéreas com 0,75% de agarose (arrefecido à temperatura do corpo) através do cateter até a revelação completa do pulmão; Espere até a completa solidificação da agarose a. Remover o cateter e colher cuidadosamente o pulmão em um tubo de 2ml escurecida cheio com 4% PFA.
  5. Para fixação adicional incubar a amostra em 4% PFA resolvido em PBS durante 2 h a 4 ° C, sob rotação contínua (31 rpm).
  6. Desidrata-se tecido incubando-se posteriormente a amostra em rotação contínua (31 rpm) a 4 ° C em etanol a 50% (pH 9), etanol 70% (pH 9) e 100% de etanol; cada passo pelo menos 4 h. No final, realizar uma segunda incubação em fresco 100% de etanol para 4 h.
  7. Execute limpeza solvente-baseado do tecido usando cinamato de etila (ECi). Portanto, transferi a amostra para o CSE. Incubar durante a noite em temperatura ambiente (sob constante rotação) até que o tecido aparece translúcido (ver Figura 1D para imagens representativas).
    Nota: As amostras armazenadas em ECi à temperatura ambiente (protegida da luz) são estáveis ao longo de várias semanas a meses.

5. executar a microscopia de fluorescência de luz-folha dos lobos do pulmão murino Wwhole

Nota: Por favor veja a Tabela de materiais para obter detalhes sobre o microscópio de fluorescência de luz-folha e o software correspondente, no qual se baseiam as etapas a seguir. Sistemas comparáveis de outros fabricantes, no entanto, podem ser usados também com modificações específicas do desenvolvedor do protocolo a seguir. Antes de começar, familiarize-se com o manual de instruções específicas do microscópio e siga as instruções técnicas pela pessoa responsável no site.

  1. Configure o microscópio de luz-folha.
    1. Ligue o microscópio de luz-folha e abrir o respectivo software no computador de imagem. Encha a câmara de amostra com ECi filtrado (filtro de 100 µm) e coloque-o na sua posição entre os raios laser.
    2. Use uma pequena gota de cola de estável ao solvente orgânica para manter o pulmão ao titular da amostra. Para manter a profundidade de penetração necessária das folhas de luz tão pequena quanto possível, defina o lóbulo do pulmão vertical. Em seguida, coloque o porta-amostras em sua câmara.
    3. Defina o índice de refração do objectivo de 3.5 quando usando CSE como reagente de compensação.
  2. Ajuste as configurações para o microscópio de luz-folha para detectar células humanas no contexto do órgão inteiro.
    1. Selecione necessários lasers (filtro para medição > ativar checkboxes de lasers exigidos) e escolha intensidades adequadas do software de controle (transmissão controlo laser > use o controle deslizante para definir laser intensidade > aplicam-se). Usar um comprimento de onda de excitação de 488 nm (filtro de 525/50) para detectar autofluorescent do tecido pulmonar e 640 nm (680/30 filtro) para excitar as células humanas rotuladas com um fluoróforo emitem no espectro vermelho.
    2. Concentre-se na amostra animada com 488 nm e adaptar o foco através da ferramenta 'correção cromática' no comprimento de onda de excitação de 640 nm (use o controle deslizante para definir a correção cromática > aplicar).
    3. Escolher um fator de zoom apropriado; Use uma visão baixa ampliação (por exemplo, 6.3 x) para determinar a distribuição geral de pilhas etiquetadas dentro do tecido pulmonar e imagens ampliadas (por exemplo, 32 x) para a localização detalhada.
    4. Selecionar uma largura de folha uniformemente elucidar o órgão inteiro ou uma seção específica do interesse (óptica > use o controle deslizante para definir a largura da folha; geralmente entre 20-40%). Definir a abertura numérica da folha (NA) com maior NA criação de imagens mais nítidas (óptica > use o controle deslizante para definir a folha NA; para um lobo do pulmão murino expandido para seu tamanho fisiológico um nd de 0.025% muitas vezes pode ser usado).
    5. Selecione o número de folhas de luz deve ser usado em 'configurações de medição avançada'. Em caso de iluminação bidirecional, mesclar luz-folhas de esquerda e direita para criar uma imagem homogênea iluminada (Avançado > merge lightsheets > selecione modo de mesclagem > use os controles deslizantes para definir a sobreposição entre as duas folhas de luz).
      Nota: Recomenda-se tirar proveito da iluminação bidirecional da amostra com três luz-folhas cada.
      Opcional: Para aumentar ainda mais a qualidade da imagem, use a operação foco dinâmico. Isso permite que para mover o foco na direção x, durante a aquisição de imagens.
    6. Definir as posições inicial e final da z-pilha a ser medido e definir o tamanho de passo de 5 µm (xyz-tabela Z > varredura gama).
      Nota: Posições inicial e final de uma z-pilha dependem de tamanho e posicionamento do lobo pulmonar dentro da câmara de amostra. No entanto, cerca de 300 a 800 z-pilhas geralmente são adquiridos para um lobo do pulmão único (tamanho de passo de 5 µm).
    7. Salvar os arquivos usando 'configurações de AutoSalvar' e iniciar a medição para capturar imagens. Após terminar de aquisição de dados, limpe o porta-amostras contaminadas com ECi e câmara sob água corrente.
      Nota: Use as mesmas configurações à imagem de vários lóbulos pulmonares que deveriam ser comparados posteriormente.

6. pós-imagem processamento e quantificação de células humanas de pulmão-acumulado

Nota: Por favor consulte Tabela de materiais para obter detalhes sobre o software de imagem de pós para análise 3D, em que se baseiam as etapas a seguir. No entanto, alternativa pós-softwares de imagem pode ser usada também.

  1. Carregar a primeira imagem de um z-pilha (ativar o botão surpass, arquivo > abrir > selecione imagem) para iniciar a abertura de todas as outras imagens de z-pilha escolhida e sua reconstrução 3D automática.
  2. Para garantir a exibição correta de x, y e z de dimensões, verificar tamanhos de voxel e ajustá-las, se necessário (Editar > Propriedades da imagem > inserir manualmente o tamanho de voxel). Para o tamanho de voxel de z, insira o tamanho escolhido da etapa entre duas imagens (aqui 5 µm).
  3. Exibir cada canal em uma cor distinta (Editar > Mostrar visor ajuste). Clique em cada canal um após o outro para definir uma cor de escolha (na Figura 2A, B, C, D , o sinal de autofluorescência é exibido em cinza e rotulado CD4 humano+ células em vermelho).
  4. Ajustar a intensidade, nível de preto e contraste para cada canal (Editar > Mostrar visor ajuste) usando os triângulos nas barras de canal ou ao inserir números exatos nas configurações do canal. Para o ajuste de intensidade, use o triângulo retângulo. Para ajuste de nível de preto, use o triângulo à esquerda e para ajuste de contraste, use o triângulo médio.
    Nota: Uso o pulmão derivado do mouse controle sem transferência de células (passo 3.3) para diferenciar entre sinais concretos derivado de células humanos e fundo inespecíficos.
  5. Para quantificar pilhas etiquetadas dentro do tecido pulmonar usam 'adicionar novos spots' na barra de ferramentas e selecione 'ignorar criação automática, editar manualmente' para a contagem de células manual.
    Nota:     como alternativa, use a célula automática contando ferramenta sob 'pontos'. No entanto, contagem manual permite diferenciar entre sinais inespecíficos e específicos, mais precisamente.
    1. Para comparar o acúmulo de células humanas em diferentes amostras, definir um cubo de pulmão com um volume específico usando a ferramenta de corte 3D (Editar > Recortar 3D) (aqui 813 μm x 813 μm x 1,000 μm).
    2. Para contar células acumuladas selecione o canal de 640 nm e definir uma escala de' raio' de 10 µm. Em seguida, clique em 'Editar', verifique a 'selecionar' no menu do ponteiro e marcar cada célula com um ponto através de shift-clique com o botão esquerdo do mouse. Encontre o número total de células contadas exibido nas estatísticas.
      Nota: É altamente recomendável contar vários cubos por lobo pulmonar (cinco aqui) para garantir a confiabilidade dos resultados e compensar para seleção de cientista-dependente do volume pulmonar contados (resultados de estratégia e representante de quantificação são retratados em Figura 2D).
  6. Capturar uma imagem usando a ferramenta 'instantâneo' e/ou levar um vídeo usando a ferramenta 'animação'. Salvar arquivos como arquivos de .ims de ajustado (arquivo > Exportar).
    Nota: Para fins de representação, mostrar ou ocultar o quadro marcando ou desmarcando o quadro na barra de ferramentas. Além disso, exibir imagens como projeção de intensidade máxima (MIP) (barra de ferramentas > volume > modo > verificar MIP) ou usar o modo' superfície' (barra de ferramentas > adicionar novas superfícies). O modo' superfície' tem de ser activado separadamente para cada canal destacar a arquitetura do tecido e/ou corpos celulares (imagens representativas são mostradas na Figura 2C).

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Resultados

O protocolo apresentado descreve um modelo experimental do mouse, que permite o monitoramento e quantificar o acúmulo de linfócitos humanos enviaram transferidos do T no pulmão através de microscopia de fluorescência de luz-folha. Figura 1 A fornece uma visão esquemática das etapas em vivo do programa experimental. Para garantir resultados confiáveis, é de substancial importância para garantir uma boa qualidade de isolados e fluorescente rotulado CD4 humano+ T cél...

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Discussão

A configuração experimental descrita aqui fornece a oportunidade de monitorar a capacidade de localização pulmonar de células humanas primárias do imunes sob condições inflamatórias em vivo e desse modo relevante complementa classicamente realizada quimiotaxia e adesão in vitro ensaios. Para tomar em características de órgão anatômico específico conta do pulmão, aspectos importantes da célula imune homing (incluindo distribuição de quimiotaxia e célula dentro do órgão-alvo), assim como a rele...

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Divulgações

Neurath M.F. serviu como um conselheiro para Pentax, Giuliani, MSD, Abbvie, Janssen, Takeda e Boehringer. Os restantes autores não divulgar qualquer conflito.

Agradecimentos

Os autores reconhecem com gratidão financiamento pelo DFG Collaborative Research Centers SFB 1181 e TRR 241. O Optical Imaging centro Erlangen (OICE) e, em particular Ralf Palmisano, Philipp Tripal e Tina Fraaß (projeto Z2 da DFG CRC 1181) são reconhecidos por suporte técnico especializado para geração de imagens microscópicas de fluorescência de luz-folha.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Agarose NEEO UltraCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemanha2267.4
AlexaFlour594 anticorpo anti-CD45 humanoBioLegend, San Diego, EUA304060
Cloreto de amônioCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AlemanhaK2981
Cânula 21 GBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EUA301300
Corante de proliferação celular eflour670eBioscience Inc., San Diego, EUA65-0840-85
CD4 MicroBeads, humanoMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemanha130-045-101
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemanha8043.1
Tubo de coleta de sangue de potássio-EDTA, 9 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemanha21066001
Ethly cinnamate (ECi)Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha112372-100G
Etanol ≥ 99.5% (EtOH)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemanha5054.3
FBS (soro fetal bovino) Good FortePAN-Biotech GmbH, Aidenbach, AlemanhaP40-47500
Filtro 100 µ m VWR International Germany GmbH, Darmstadt, Alemanha732-2758
Imaris Image Analysis Software 9.0.2Bitplane AG, Zurique, Suíçan.a.ImspectorPro
softwareAbberior Instruments GmbH, Gö ttingen, Alemanhan.a.Ketamin
 Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Alemanha3617KET-V
LaVision UltraMicroscope IILaVision BioTec GmbH, Bielefeld, Alemanhan.a.MACS
MultiStandMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemanha130-042-303
Cânula Multifly 20 GSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemanha851638035
agulha de 30 GB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Alemanha9161502
Câmara de contagem NeubauerneoLab Migge GmbH, Heidelberg, AlemanhaC-1003
Pattex GlueHenkel AG & Co, Dü sseldorf, AlemanhaPSK1C
LS columnMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemanha130-042-401
Meios de separação de linfócitos (densidade 1.077 g/mL)anprotecAC-AF-0018
PapaínaMerck1.071.440.025
PBS Dulbecco (solução salina tamponada com fosfato)Biochrom GmbH, Berlim, AlemanhaL182-10
PerCP/Cy5.5 anti-humano CD4BioLegend, San Diego, EUA317428
PerCP/Cy5.5 camundongo IgG2b, κ isotipo CtrlBioLegend, San Diego, EUA400337
PFA (paraformaldeído)Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Alemanha0335.1
Hidrogenocarbonato de potássioCarl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, AlemanhaP7481
Pipeta sorológica 10 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemanha86.1254.001 
Seringa 1 mLB. Braun Melsungen AG, Melsungen, Hessen, Alemanha9166017V
Seringa 5 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EUASeringa 260067
20 mLBecton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, EUA260069
1,5 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemanha72.706.400
Tubo 2 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemanha72.695.400 
Tubo 2 mL, marromSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemanha72.695.001
Tubo 15 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemanha62.554.502 
Tubo 50 mLSarstedt AG & Co., Nü mbrecht, Alemanha62.547.254 
QuadroMACS SeparadorMiltenyi Biotech GmbH, Bergisch-Gladbach, Alemanha130-090-976
Xylazin (Rompun 2%)Bayer Vital GmbH, Leverkusen, AlemanhaKPOBD32
Tubo

Referências

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