Medição altamente sensível da permeabilidade glomerular em camundongos com isotiocianato de fluoresceina-polisacarose 70

Summary

Aqui, nós apresentamos um protocolo para testar a permeabilidade glomerular nos ratos usando um Tracer altamente sensível, nonradioativo. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina.

Abstract

A perda de albumina na urina (albuminúria) preafirma o desfecho cardiovascular. Em condições fisiológicas, pequenas quantidades de albumina são filtradas pelo glomérulo e reabsorvidas no sistema tubular até o limite de absorção ser atingido. Os aumentos adiantados na filtração patológica da albumina podem, assim, ser faltado analisando o Albuminuria. Portanto, o uso de traçadores para testar a permseletividade glomerular parece vantajoso. O isotiocianato do Tracer fluorescently etiquetado do fluoresceína (FITC)-polysacarose (isto é, FITC-Ficoll), pode ser usado para estudar o permselectivity glomerular. As moléculas FITC-polisacarose são livremente filtradas pelo glomérulo, mas não reabsorvidas no sistema tubular. Em camundongos e ratos, FITC-polysacarose tem sido investigado em modelos de permeabilidade glomerular usando procedimentos tecnicamente complexos (i.e., medições radioativas, cromatografia líquida de alta eficiência [HPLC], filtração de gel). Nós modificamos e facilitamos um protocolo Tracer-baseado do FITC-polysacarose para testar aumentos adiantados e pequenos na permeabilidade glomerular a FITC-polysacarose 70 (tamanho da albumina) nos ratos. Este método permite análises repetitivas da urina com volumes pequenos da urina (5 μL). Este protocolo contém informações sobre como o Tracer FITC-polysacarose 70 é aplicado por via intravenosa e a urina é coletada através de um cateter urinário simples. A urina é analisada através de um leitor de placas de fluorescência e normalizada para um marcador de concentração de urina (creatinina), evitando assim procedimentos tecnicamente complexos.

Introduction

Defeitos funcionais ou estruturais dentro da barreira de filtração glomerular aumentam a permeabilidade glomerular à albumina, resultando na detecção de albumina na urina (albuminúria). A albuminúria preafirma o desfecho cardiovascular e é um importante marcador para lesão glomerular¹. Mesmo os baixos níveis de albuminúria, encontrando-se dentro da escala normal, são associados com um risco cardiovascular aumentado¹.

condições fisiológicas, a albumina é filtrada através do glomérulo e é quase completamente reabsorvida no sistema tubular^2,3.<....

Protocol

As investigações foram conduzidas de acordo com as diretrizes delineadas no guia de cuidados e uso de animais de laboratório (institutos nacionais de saúde da publicação n º 85-23, revisado em 1996). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com as aprovações institucionais relevantes (governo estadual Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referência 84-02.04.2012. A397).

1. preparação de instrumentos, soluções e equipamentos

1. Reconstituir FITC-polysacarose 70 com 0,9% de cloreto de sódio estéril (NaCl) a uma concentração final de 10 mg/mL (i.e., 100 mg em 10 mL de NaCl).
2. D....

Results

Conforme representado na Figura 2, o método para testar a permeabilidade glomerular em camundongos é construído em três fases. A primeira fase é denominada fase de preparação, na qual se colocam um cateter urinário e um cateter venoso central. A segunda fase é chamada de fase de equilíbrio, iniciando com uma injeção intravenosa de bóculo de FITC-polysacarose 70 e seguida pela infusão contínua de FITC-polysacarose 70 por 60 min. A última fase é chamada de fase.......

Discussion

O método apresentado permite ao investigador testar a permeabilidade glomerular em camundongos de uma maneira muito sensível usando um traçador. Com este método, os aumentos a curto prazo na permeabilidade glomerular podem ser diagnosticados usando somente pequenas quantidades de urina. As etapas mais críticas para dominar com sucesso esta técnica são 1) desenvolver a perícia manual na cirurgia do rato, especial no canulação de uma veia central, 2) coloc o cateter urinário sem prejudicar a mucosa, e 3) perícia manual em .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Motic SMZ168 BL	Motic	microscópio SMZ168BL	para cirurgia de camundongos
KL1500LCD	Pulch e Lorenz microscopia	150500	luz para cirurgia de camundongos
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	tesoura fina
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	para corte de pescoço
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	para cirurgia
Prä parierklemme	Aesculap	BJ008R	para cirurgia
Seraflex	Serag Wiessner	IC108000	fio de seda
Cetamina 10%	Medistar		anestesia
Rompun (xilazina) 2%	anestesia Bayer
Tubo de polietileno de furo fino ID 0,28 mm OD 0,61 mm	Portex	800/100/100	Cateter
Tubo de polietileno de furo fino ID 0,58 mm OD 0,96 mm	Cateter Portex	800/100/200
Aparelho Harvard 11 Plus	Aparelho Harvard	70-2209	bomba de seringa
BD Insyte Autoguard	BD	381823	cateter urinário
Detector multimodo DTX 880	Beckman Coulter		leitor de placas
384 poços microtitulação	Nunc	262260	384 placas de 384 poços
Kit de Ensaio de Creatinina	Sigma-Aldrich	MAK080	para medir a concentração de creatinina
placa de 96 poços	Nunc	260836	para ensaio de creatinina
Polissuccrose marcada com FITC 70	TBD Consultoria	FP70	FITC-ficoll
Angiotensina II	Sigma-Aldrich	A9525	usado para testar a permeabilidade glomerular
BP-98A	Softron		para medição da pressão arterial
OTS 40.3040	Medite	01-4005-00	placa de aquecimento para cirurgia de camundongos
Instillagel 6mL	Farco-Pharma GmbH		para cateter urinário
Exacta	Aesculap	GT415	shaver