Efeito de anticorpo Anti-c-fms Osteoclast formação e proliferação de Osteoclast Precursor In Vitro

Resumo

Este protocolo inclui a dissecação de murino de ossos longos e isolamento de medula óssea, para gerar os macrófagos da medula óssea e produzir osteoclastos usando macrófago da colônia fator (M-CSF) e do receptor ativador de ligante fator nuclear Kappa-B (RANKL) ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a sua detenção por anticorpo anti-c-fms, receptor de M-CSF.

Resumo

Remodelação óssea é um processo complexo e que envolve períodos de deposição e reabsorção. Reabsorção óssea é um processo pelo qual osso é dividido pelos osteoclastos em resposta a diferentes estímulos. Precursores de osteoclast diferenciarem-se em osteoclastos Relaxometria em resposta à colônia de macrófago fator (M-CSF) e do receptor ativador de ligante fator nuclear Kappa-B (RANKL). Sob condições patológicas, o perfil de citocinas é diferente e envolve uma mistura de citocinas inflamatórias. Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é dentre as citocinas mais importantes, como pode ser encontrada em grandes quantidades em áreas envolvidas com osteólise inflamatória. O propósito do presente protocolo é fornecer um método pelo qual murino de medula óssea é isolada para gerar osteoclastos através de indução com M-CSF e RANKL ou TNF-α, que posteriormente será inibido, aumentando as doses de anticorpo anti-c-fms, o receptor para o M-CSF. Esta experiência destaca o valor terapêutico do anticorpo anti-c-fms em doenças de reabsorção óssea inflamatória.

Introdução

Os osteoclastos são células altamente especializadas, e eles diferenciar de células-tronco hematopoiéticas através da fusão de vários precursores do osteoclast. Eles são essenciais para a remodelação óssea saudável e contribuem para a reabsorção óssea patológica associada a doenças inflamatórias osteolíticas, tais como artrite reumatoide e doença periodontal¹.

Função Osteoclastogenesis e osteoclasto são mediadas por dois fatores-chave; macrófago colônia de fator (M-CSF) e do receptor ativador de ligante de fator nuclear kappa-B (RANKL). Tanto M-CSF e RANKL são importantes para osteoclast diferenciação². Outro fator que tem sido mostrado para induzir a formação de osteoclast de macrófagos da medula óssea in vitro é o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α)^3,4,5. TNF-α formação mediada osteoclast foi mostrada para ser crítico de osteólise em doenças como artrite reumatoide⁶, doença periodontal⁷e osteoporose pós-menopausa⁸destrutivo.

C-fms é o receptor de membrana do M-CSF e Medeia sua ação. O papel do c-fms é bem documentado na literatura, como foi demonstrado que a administração de um anticorpo contra c-fms (anticorpo anti-c-fms) completamente preso osteoclastogenesis em um modelo de artrite, bem como em TNF-α induzida por erosões ósseas, enquanto osteoclastogenesis distante da articulação inflamada foi ainda robusto⁹. Administração do anticorpo anti-c-fms inibiu a reabsorção de formação e osso osteoclast induzida pelo lipopolissacarídeo (LPS) em rato Calvárias¹⁰ , bem como em periodontite induzida por LPS modelo¹¹. Além disso, anticorpos anti-c-fms inibiam a reabsorção de raiz induzida por estresse mecânico durante de movimento ortodôntico do dente¹², bem como o movimento ortodôntico do dente e reabsorção óssea associada de movimento ortodôntico do dente¹³.

M-CSF foi relatado para ter outras funções que são essenciais para a resposta imune do hospedeiro. A ausência de M-CSF em camundongos op/op com pneumonia bacteriana conduzir ao aumento da carga bacteriana e disseminação bacteriana no fígado com necrose hepática¹⁴. Portanto, M-CSF é importante para a resposta imunológica na proteção de infecção.

Este estudo demonstra o efeito do anticorpo anti-c-fms em M-CSF e RANKL ou TNF-α induzida formação osteoclast in-vitro e M-CSF induzida proliferação de precursores do osteoclast. Este protocolo demonstra o isolamento de células de medula murino de ossos longos e as etapas para gerar os macrófagos da medula óssea (BMM) que são considerados as precursoras do osteoclasto e para induzir a diferenciação de BMM em osteoclastos Relaxometria por dois métodos; RANKL ou TNF-α. O protocolo também compara a prisão de osteoclastogenesis em ambos os métodos usando anticorpo anti-c-fms.

O processo pelo qual medula óssea é extraída e posteriormente usada para gerar precursores osteoclasto é confiável em produzir grandes quantidades de culturas osteoclast puro que podem ser usadas em múltiplas aplicações a jusante, tais como testes de drogas. O uso de RANKL ou TNF-α para induzir osteoclastogenesis neste protocolo distingue osteoclastogenesis como um processo fisiológico (RANKL) de osteoclastogenesis como um processo patológico (TNF-α), que por sua vez, fornece dois procedimentos alternativos para guiar a decisão das quais uma é superior em termos de reagentes a ser usada em aplicações a jusante. Este protocolo também fornece um método pelo qual podemos determinar uma concentração adequada de anticorpo anti-c-fms, que pode ser utilizada para estudos posteriores envolvidos na reabsorção óssea e doenças osteolíticas.

Protocolo

Todos os procedimentos de animal e cuidados com animais foram realizadas de acordo com os regulamentos e as regras da Universidade de Tohoku.

1. manipulação e dissecação do membro posterior murino

1. Antes de dissecação, encha um prato com aproximadamente 50 mL de α-MEM, dependendo do tamanho do recipiente e coloque-o no gelo. Isto servirá como um recipiente de coleta até a dissecação de todos os ossos é completa. Para isto e subsequentes experimentos, use α-MEM contendo 10% fetal de soro bovino (FBS), 100 UI/mL penicilina G e 100 estreptomicina μg/mL.
2. Eutanásia por inalação de uma overdose de 5% de isoflurano em C57Bl/6J rato.
3. Fixar o mouse em posição supina usando pinos perfurados as palmas das mãos e pés e spray completamente com etanol a 70%.
4. Faça uma incisão de pele usando uma tesoura cirúrgica estéril e pinças ao nível do quadril e estendê-lo até os pés, expondo os músculos.
5. Corte o tendão anexar o músculo quadríceps e o tendão anexar o tendão muscular ao osso. Descasca os músculos expondo as articulações do quadril e o joelho. Localizar estes tendões facilitará liberando ambos os músculos dos seus anexos sem deixar etiquetas de tecidos moles. Não corte no osso.
6. Coloque a tesoura entre a cabeça do fêmur e o espaço articular e desviá-la libertando o fêmur, mas manter o osso intacto. Isto irá permitir o desprendimento dos ossos sem o risco de expor a medula óssea.
7. Da mesma forma, corte os músculos anexar à tíbia. Corte a tíbia livre de sua fixação na articulação do tornozelo, mantendo o osso intacto para evitar contaminação.
8. Raspe qualquer tecido mole restante do fêmur e tíbia usando as lâminas da tesoura e kimwipe e coloque-o em um prato com α-MEM colocado no gelo.

2. murino membro posterior isolamento de medula óssea

1. Encha uma seringa de agulha 30G com α-MEM.
2. Desconecte-se da tíbia e fêmur longe da articulação do joelho.
3. Corte as extremidades do osso longo de ambos os lados com uma tesoura.
4. Segure o osso do eixo usando uma pinça, insira a agulha no espaço da medula do osso e liberar lentamente o conteúdo da medula em um prato de cultura de 6 cm. O osso vai aparecer branco, indicando a extração de todo o conteúdo da medula óssea. Repita para todos os ossos.
5. Tensão da medula óssea extrair usando um coador de célula de nylon μm 40 em um tubo de centrifuga conico de 50 mL e centrifugar x g por 5 min.
6. Desprezar o sobrenadante, lavar com 5 mL de α-MEM e centrifugar a 300 x g durante 5 min. repetir lavagem para um total de 2 vezes.
7. Resuspenda o pellet em 10 mL de α-MEM e realizar uma contagem de células usando um hemocytometer como segue:
   1. Fazer uma diluição de 1:1 da suspensão de células, adicionando 10 μL da suspensão de células de 10 μL de 0,4% trypan azul em um tubo de 1,5 mL e pipetar uma vez.
   2. Cubra a câmara de hemocytometer com uma tampa corrediça e transferir a suspensão do corante para o hemocytometer. É importante para não encher demais ou underfill da câmara e permitir a suspensão encher a câmara por ação capilar.
   3. Coloque o hemocytometer em um palco de microscópio. Com objetivo de x 10, concentre-se na Praça do centro. Conte todas as células vinculadas por 3 linhas. Para se certificar de que as células não são contadas duas vezes, conte os cantos superiores e direito de cada quadrado. Células mortas aparecerá azul escuro, estas são excluídas da contagem.
8. Dependendo da aplicação a jusante, propagar as células dentro de um vaso de cultura apropriado. Para esta experiência particular, siga seção 3.

3. geração de BMM

1. Semente de 1 x 10⁷ células/10 mL em um 10cm cultura prato e adicionar M-CSF 100 ng/mL. A concentração final de M-CSF é 100 ng/mL de meio de cultura. Incube a cultura a 37 ° C, 5% de CO₂ por 3 dias.
2. Depois de 3 dias, retire o meio de cultura, lavar as células vigorosamente com 10 mL de salina tamponada fosfato (PBS) duas vezes para remover as células não-aderentes, adicionar 5 mL de 0,02% de temperatura do trypsin-EDTA em PBS e incubar a 37 ° C, 5% de CO₂ por 5 min.
3. Separe as células pipetando minuciosa. Certifique-se que as células têm sido desanexadas, observando a cultura sob um microscópio (as células devem aparecer arredondados e flutuante na mídia). Se as células continuam a ser anexadas, repita a pipetagem minuciosamente para desanexá-los. Quando as células têm sido desanexadas, adicione 5 mL de α-MEM para inactivar a reação.
4. Coletar as células em um tubo cônico de 50 mL e centrifugar x g por 5 min. descartar o sobrenadante e lavar com 5 mL de α-MEM.
5. Centrifugar a 300 x g por 5 min e resuspenda o pellet em 10 mL de α-MEM.
6. Realize uma contagem de células, conforme descrita na etapa 2.7.1.
7. Semente de 1 x 10⁶ células/10 mL em um 10cm cultura prato e adicionar M-CSF 100 ng/mL. A concentração final de M-CSF é 100 ng/mL de meio de cultura. Incube a cultura a 37 ° C, 5% de CO₂ por 3 dias.

4. geração de osteoclastos de BMM como precursores de Osteoclast

1. Após 3 dias, colhem as células anexadas que representam BMM como precursores de osteoclasto, seguindo passos 3.2-3.7.
2. BMM semente em 5 x 10⁴ células/200 μL de α-MEM em um prato bem 96. Adicione RANKL para uma concentração final de 50 ng/mL ou TNF-α, para uma concentração final de 100 ng/mL. Adicione o M-CSF para uma concentração final de 100 ng/mL a cada poço.
3. Adicione o anticorpo anti-c-fms (concentração final de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) a cada poço.
4. Incube a 37 ° C, 5% de CO₂ por 4 dias. Mudar a mídia todos os dias por 4 dias.

5. mancha de fosfatase ácida tartarato-resistente (TRAP)

1. Após 4 dias de incubação, Aspire cuidadosamente o meio de cultura de cada poço. Lave bem uma vez com 200 μL de temperatura 1X PBS.
2. Adicionar 200 μL de formol a 10% a cada poço para fixação e incube por 1h à temperatura ambiente. Aspirar a formalina e lave cada poço 3 vezes com água desionizada.
3. Adicione 200 μL de 0,2% Triton X-100 em PBS a cada bem para permeabilização e incubar por 1h à temperatura ambiente. Aspirar o Triton X-100 e lave cada poço 3 vezes com água desionizada.
4. Adicione 200 μL de solução de mancha de armadilha para cada poço. Visualize a mancha sob o microscópio. Vai demorar de 10 a 30 min para a mancha desenvolver adequadamente.
5. Aspire a mancha e lave cada bem com água desionizada 3 vezes e secar ao ar. Manter à temperatura ambiente para usar em observação posterior.

6. proliferação ensaio

1. BMM semente como precursores de osteoclast em 5 x 10³ células/200 μL de α-MEM em um prato bem 96. Adicione o M-CSF para uma concentração final de 100 ng/mL a cada poço.
2. Adicione o anticorpo anti-c-fms (concentração final de 0, 1, 10, 100, 1.000 ng/mL) e incubar a 37 ° C, 5% de CO₂ por 3 dias sem mudança de média.
3. Após 3 dias, lavam-se as células com PBS 1x. Adicione 100 μL de α-MEM a cada poço.
4. Adicionar 10 μL de célula contando solução kit e incubar a 37 ° C, 5% de CO₂ por 2 h e determinar a absorbância de cada poço a 450 nm, utilizando um leitor de microplacas.

Resultados

O propósito do presente protocolo é avaliar o efeito do anticorpo anti-c-fms na formação osteoclast na presença de RANKL ou TNF-α e para determinar o efeito do M-CSF na proliferação de precursores do osteoclast. Neste protocolo, nós fornecemos um processo confiável, pelo qual grandes quantidades de culturas puras osteoclast são geradas. Nós também fornecemos uma maneira de testar a concentração adequada de anticorpo anti-c-fms para inibir a formação de osteoclast sob condições de cultura ...

Discussão

Neste estudo, investigamos o efeito do anticorpo anti-c-fms na formação induzida pelo RANKL osteoclasto, formação de TNF-α-induzida osteoclasto e proliferação de precursor de osteoclast M-CSF-induzida. Nós achamos que a quantidade efetiva de anticorpo anti-c-fms para a inibição da osteoclastogenesis entre formação induzida pelo RANKL osteoclasto, formação de osteoclast induzida por TNF-α e M-CSF-induzida proliferação de precursores osteoclast é diferente.

RANKL Medeia osteoclastogenesis na pre...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
		anti-c-Fms	AFS98, um anticorpo monoclonal, antimurino, c-Fms de rato (IgG2a)
TNF-&alfa;			TNF-&alfa murino recombinante; preparado em nosso laboratório. TNF-&alfa; fragmento de cDNA clonado por RT-PCR e clonado em um pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) para gerar uma proteína de fusão GST. GST-TNF-&alfa; foi expressa em células de células BL21 de Escherichia coli (Stratagene, La Jolla, CA). As células foram lisadas em condições não desnaturantes e GST-TNF-&alfa; foi purificado sobre uma coluna de glutationa-Sepharose. O GST foi clivado pela protease de pré-cisão (Amersham Biosciences) pelo fabricante' s direções e foi removido por uma coluna de glutationa-Sepharose.
RANKL	PEPROTECH	315-11	Ligante sRANK Murino Recombinante, Fonte: E. coli
M-CSF M-CSF			humano recombinante. 1/10 vol de CMG14– 12 sobrenadante de cultura de linha celular a 5x106  células em uma placa de cultura em suspensão de 10 cm.
α-MEM	Wako	com L-Glutamina e Soro
	Biowest	s1820-500	Soro Fetal Bovino Origem Francesa
Placa de cultura	Corning		100 mm x 20 mm placa
de 96 poços	Thermofischer Scientific		Nun clon Delta surface
Cell counting kit-8	Dojindo, Kumamoto, Japão
Leitor de microplacas	Sunrise REMOTE; Tekan Japan, Kawasaki, Japão
Cell strainer	Corning		40 μ m Tubo de
centrífuga	Corning		50 mL CentriStar tampa
Triton X-100	Wako		Polioxietileno (10) Éter octifenílico

Anticorpo Fetal Bovino vermelho de fenol de nylon