Double-stranded do RNA produzido durante a replicação de vírus de RNA pode ser reconhecido por receptores de reconhecimento padrão para induzir uma resposta imune inata. Para vírus de RNA de sentido negativo, a interação entre o baixo nível de dsRNA e PRRs permanece obscura. Nós desenvolvemos um método de microscopia confocal para visualizar dsRNA arenavírus e PRR em células individuais.
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Artigo de método
Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo
Neste artigo
Resumo
Resumo
(Ds) do RNA double-stranded é produzido como um intermediário replicative durante a infecção de vírus de RNA. Reconhecimento do dsRNA por receptores de reconhecimento de padrão anfitrião (PRRs) tais como o ácido retinoico (RIG-eu) como receptores (RLRs) RIG-eu e o melanoma proteína associada a diferenciação 5 (MDA-5) leva para a indução da resposta imune inata. A formação e a distribuição intracelular de dsRNA positivo-infecção por vírus de RNA de sentido tem sido bem caracterizada por microscopia. Muitos vírus de RNA de sentido negativo, incluindo alguns arenaviruses, desencadear a resposta imune inata durante a infecção. No entanto, vírus de RNA de sentido negativo foram pensados para produzir baixos níveis de dsRNA, que impede o estudo da imagem do reconhecimento do PRR do dsRNA viral. Além disso, experimentos de infecção com alta patogenicidade arenaviruses devem ser realizados em instalações de alta contenção biossegurança nível (BSL-4). A interação entre viral RNA e PRRs para alta patogenicidade vírus RNA é desconhecida devido os desafios técnicos adicionais que os investigadores precisam enfrentar nas instalações da BSL-4. Recentemente, um anticorpo monoclonal (Mab) (clone 9 5) originalmente usado para detecção de pan-enterovírus foi encontrado para detectar especificamente dsRNA com uma maior sensibilidade do que os tradicionais anticorpos anti-dsRNA J2 ou K1. Neste documento, utilizando o 9 5 anticorpo, descrevemos um protocolo de microscopia confocal que tem sido usado com sucesso para visualizar dsRNA, proteína viral e PRR simultaneamente em células individuais, infectados por arenavírus. O protocolo é também adequado para estudos de dsRNA e distribuição do PRR em células patogênicas arenavírus infectado em instalações de BSL4 de imagem.
Introdução
O passo inicial da indução da resposta imune inata é acolhimento reconhecimento de double-stranded do RNA (ds) por receptores de reconhecimento padrão (PRRs) tais como o ácido retinoico (RIG-eu) como receptores (RLRs) RIG-eu e o melanoma associada a diferenciação proteína 5 (MDA-5)1. Para vírus de RNA de sentido positivo, dsRNA pode geralmente ser prontamente detectado usando o J2 ou K1 anti-dsRNA antibodies monoclonal (Mab)2. Interação entre dsRNA e PRRs em vírus de RNA positivo-vertente, como picornavírus, tem sido caracterizada utilizando microscopia confocal3. No entanto, para vírus de RNA sen....
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Protocolo
1. preparação de células A549 e infecção JUNV
- Semente de 2 x 105 pulmão humano A549 células epiteliais em poli-D-lisina (PDL) revestido as lamelas de vidro em placas boas 12 24 horas antes da infecção.
- Preparar alíquotas de 150 mL de JUNV13 em uma multiplicação de infecção (MOI) de 1,0 placa formando unidade por célula diluída em mídia de médio (DMEM) modificado Eagle de Dulbecco suplementada com 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina e estreptomicina (P/S ).
- Remova a mídia de cultura de células. Adicionar o inóculo de vírus em cada lamela contendo bem e incubar durante 1,5 h a 37 ° C. Agite as....
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Resultados
Este protocolo foi aplicado para estudar a distribuição e o colocalization entre os RLRs (RIG-I e MDA-5) e dsRNA em células infectadas por JUNV. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2, a acumulação de dsRNA aumenta ao longo do tempo como progride de infecção viral. Concentrado de MDA-5 (Figura 1) e equipamento-(Figura 2) sinais foram encontrados colocalized com as estrutur.......
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Discussão
Para vírus de RNA de sentido positivo e vírus dsDNA, dsRNA é facilmente detectado com o anticorpo utilizado de anti-dsRNA J2. No entanto, vírus de RNA de sentido negativo acredita-se que produzem o dsRNA em uma baixa ou abaixo do nível de detecção, usando o mesmo anticorpo2. Assim, muitos aspectos da interação viral do RNA e PRR são em grande parte obscuro para vírus de RNA de sentido negativo. Buscou-se mancha para dsRNA na infecção por arenavírus usando o anticorpo J2 mas os sinais de fluorescên.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer o UTMB imagem núcleo instalações e Maxim Ivannikov para assistência de microscópio.
Este trabalho foi apoiado pelo serviço de saúde pública conceder RO1AI093445 e RO1AI129198 para SP, premiado UTMB compromisso fundo P84373 de CH e T32 AI007526 para EM.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit de rotulagem de anticorpos APEX Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A10475 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A4503 | |
| DAPI | Cell Signaling | 4083 | Diluição 1:1.000 |
| Burro-anti coelho Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A-11058 | Diluição 1:2.000; Lote #: 1454437 |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Corning | 10-013-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| Lâminas de microscópio de vidro | Fisher | 12-550-15 | |
| Camundongo anti cabra Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | Diluição 1:2000; Lote #: 1874804 |
| Células epiteliais pulmonares humanas A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Metanol | Fisher | A412 | Armazenado a -20 ° C |
| Mouse MAb anti-JUNV NP | BEI | NA05-AG12 | Conjugado a Alexa-647 na diluição de 1:1.000 |
| Mouse MAb pan-Enterovírus 9D5 Reagente | Millipore Sigma | 3361 | pronto para uso; diluído para 1:2; Lote #: 3067445 |
| PBS suplementado com Ca e Mg | Corning | 21-030-CV | |
| PDL Lamínulas revestidas | Neuvitro | H-12-1.5-pdl | |
| ProLong Gold antifade | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit MAb MDA-5 | Abcam | ab126630 | 1:250 diluição; Lote #: GR97758-7 |
| cepa Candid#1 recombiante de JUNV | Lab gerado | Lab gerado Conforme | descrito anteriormente na referência 13. |
| MAb de camundongo RIG-I conjugado com Alexa-594 | Santa Cruz | sc-376845 | diluição 1:1000; Lote #: AO218 |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
Referências
- Jensen, S., Thomsen, A. R. Sensing of RNA viruses: a review of innate immune receptors involved in recognizing RNA virus invasion. Journal of Virology. 86, 2900-2910 (2012).
- Weber, F., Wagner, V., Rasmussen, S. B., Hartmann, R., Paludan, S. R.
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Reimpressões e permissões
