Imagem latente confocal de RNA Double-Stranded e receptores de reconhecimento padrão na infecção pelo vírus de RNA de sentido negativo

O passo inicial da indução da resposta imune inata é acolhimento reconhecimento de double-stranded do RNA (ds) por receptores de reconhecimento padrão (PRRs) tais como o ácido retinoico (RIG-eu) como receptores (RLRs) RIG-eu e o melanoma associada a diferenciação proteína 5 (MDA-5)¹. Para vírus de RNA de sentido positivo, dsRNA pode geralmente ser prontamente detectado usando o J2 ou K1 anti-dsRNA antibodies monoclonal (Mab)². Interação entre dsRNA e PRRs em vírus de RNA positivo-vertente, como picornavírus, tem sido caracterizada utilizando microscopia confocal³. No entanto, para vírus de RNA sentido negativo, visualização e caracterização do PRR e dsRNA interação tem sido dificultado pela ausência de anticorpos sensíveis ao dsRNA. Hibridação in situ fluorescente (FISH) de RNA foi aplicada para a visualização de viral RNA e PRRs⁴. No entanto, a metodologia de peixe requer o conhecimento do destino sequência de RNA e pode não ser compatível com PRR co coloração. Recentemente, a 5 de 9 Mab, que foi originalmente desenvolvido para o diagnóstico da infecção por enterovírus-pan, foi encontrado para ser mais sensível do que o Mab J2 e pode facilmente detectar dsRNA no sentido negativo de^5,de infecção de vírus de RNA⁶. Assim, o Mab 9 5 é um romance e uma ferramenta útil para estudar a replicação viral e a interação entre o PRR e o RNA viral para vírus de RNA sentido negativo.

Arenaviruses é uma família de vírus de RNA de single-stranded, negativo-sentido, que inclui vários agentes patogénicos humanos, tais como vírus de Lassa (LASV), vírus Junín (JUNV) e vírus Machupo (MACV), que causam doenças graves de febre hemorrágica em seres humanos⁷. Dados clínicos de casos graves e fatais de febre hemorrágica Argentina causada por arenavírus do novo mundo JUNV apresentam níveis anormalmente altos de soro IFN-α^8,9. Mostramos que o arenaviruses NW patogénicos (JUNV e MACV), mas não a patogenicidade velho mundo arenavírus, LASV, induzem um tipo eu resposta de interferon (IFN) em humanos células dendríticas derivadas de monócitos¹⁰. Além disso, RIG-I é um dos sensores mediando tipo I resposta IFN em células infectadas JUNV¹¹. Também achamos que o receptor de R (PKR) proteína quinase, que é tradicionalmente conhecido por reconhecimento de dsRNA, é ativado em patogenicidade NW arenavírus infecção¹². Para entender melhor o mecanismo de resposta IFN vírus específicos durante a infecção arenavírus, visamos desenvolver um protocolo para visualizar a interação entre dsRNA viral e os PRRs citoplasmáticas.

Experimentos de infecção com patogenicidade JUNV, MACV e LASV precisam ser executada em Biossegurança nível 4 instalações (BSL-4). Assim, além do nível baixo presumivelmente de dsRNA formado na infecção por arenavírus, cumprindo as exigências de biossegurança é outro desafio técnica ao realizar estudos de imagiologia para estes vírus de alta patogenicidade. Utilizando o 9 5 anticorpo e Candid1 # estirpe utilizada na vacina de JUNV, um protocolo baseado em microscopia confocal é descrito neste relatório, que tem sido usada com sucesso para visualizar dsRNA, proteína viral e PRR simultaneamente em células infectadas por arenavírus em BSL2 laboratórios. O protocolo é também adequado para visualização da distribuição intracelular de dsRNA e PRR durante infecção patogénica arenavírus em instalações de BSL4.

1. preparação de células A549 e infecção JUNV

1. Semente de 2 x 10⁵ pulmão humano A549 células epiteliais em poli-D-lisina (PDL) revestido as lamelas de vidro em placas boas 12 24 horas antes da infecção.
2. Preparar alíquotas de 150 mL de JUNV¹³ em uma multiplicação de infecção (MOI) de 1,0 placa formando unidade por célula diluída em mídia de médio (DMEM) modificado Eagle de Dulbecco suplementada com 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina e estreptomicina (P/S ).
3. Remova a mídia de cultura de células. Adicionar o inóculo de vírus em cada lamela contendo bem e incubar durante 1,5 h a 37 ° C. Agite as placas cada 15 min.
4. Remover o inóculo de vírus, adicionar 1 mL de DMEM suplementado com 5% FBS e 1% P/S. Incubar a placa a 37 ° C para o ponto de tempo desejado.

2. fixação e imunocoloração

1. Aspire os meios de comunicação. Enxague as células, adicionando 1 mL de solução salina tamponada fosfato (PBS) suplementada com cálcio e magnésio para cada poço.
2. Remova a PBS. Adicione 1 mL de metanol (MeOH) pre-refrigerado a-20 ° C e incubar a-20 º C ou em gelo seco por 15 min.
3. Remova MeOH.
4. Adicione 1 mL de PBS a cada poço e amostras de lavagens em 4 ° C, com um balanço suave 5 min. repetir a lavagem total de 4 vezes.
5. Lave as células fixas em lamelas em 1 mL de 0,2% t-octylphenoxypolyethoxyethanol por 5 min a 4 ° C, com balanço suave.
6. Adicione 1 mL de PBS a cada poço. Lave as amostras a 4 ° C por 5 min com balanço suave. Repita a etapa de lavagem para total de 4 vezes.
7. Para detectar dsRNA e MDA5, Incube as amostras em 200 mL de anticorpos primários diluído em 3% albumina de soro bovino (BSA). Diluir o anticorpo anti-dsRNA 9 5 a uma diluição de 1:2 e diluir o anticorpo anti-MDA-5 em 1: 250. Incube com suave balançar a 4 ° C durante a noite.
8. Remova os anticorpos primários e lave cada uma com 1 mL de PBS por 5 min com suave balançar no RT. repetir esta lavagem quatro vezes mais.
9. Adicionar 200 mL de anticorpos secundários (1:2, diluição 000) diluído em 3% BSA e incubar a RT por 1h.
10. Remover anticorpos secundários e lave cada uma com 1 mL de PBS por 5 min com suave balançar no RT. repetir esta lavagem quatro vezes mais.
11. Para detectar a cadeia JUNV (NP) e RIG-, adicionar 200 mL de anticorpos conjugados diluído em 3% BSA. Diluir o NP conjugado anti-JUNV (AG-12) em 1:1,000 e incubar as amostras por 2 h em RT com balanço suave. Diluir o anti-RIG-I anticorpo conjugado no 1: 500 e incubar a 4 ° C durante a noite com balanço suave.
12. Remover anticorpos conjugados e lave cada uma com 1 mL de PBS por 5 min com suave balançar no RT. repetir esta lavagem quatro vezes mais.
13. Counterstain as lamelas com DAPI (1:1, 000) por 3 min com balanço suave no RT
14. Lave as lamelas 3 vezes, cada vez por 5 min em 1 mL de 0.5% t-octylphenoxypolyethoxyethanol com balanço suave no RT
15. Lave duas vezes em 1 mL de PBS durante 5 min cada vez com um balanço suave no RT
16. Lave uma vez em 1 mL de DDQ₂O por 1 min em RT, balançando suavemente.
17. Lamelas de montagem em lâminas de vidro usando a mídia de montagem. Deixe a cura durante a noite.
18. Selar os slides com as unhas pintadas e secar por 1h.
19. Imagem em microscópio confocal com o x 60 / 1,42 lente de imersão de óleo de abertura numérica usando as mesmas emissões de laser para cada amostra.
20. Ao analisar os dados, se necessário, fazer ajustes de brilho e contraste, usando o mesmo ajuste linear para todas as amostras.

Este protocolo foi aplicado para estudar a distribuição e o colocalization entre os RLRs (RIG-I e MDA-5) e dsRNA em células infectadas por JUNV. Como mostrado na Figura 1 e Figura 2, a acumulação de dsRNA aumenta ao longo do tempo como progride de infecção viral. Concentrado de MDA-5 (Figura 1) e equipamento-(Figura 2) sinais foram encontrados colocalized com as estruturas punctate do NP e dsRNA.

Figura 1: evolução temporal do dsRNA e formação JUNV NP e a distribuição do MDA-5. JUNV-infectados e simulação-infectados A549 células foram fixo, manchadas e criação da imagem de acordo com o protocolo em 24, 36 e 48 horas pós infecção (HPI). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: evolução temporal do dsRNA e formação JUNV NP e a distribuição de RIG-I. JUNV-infectados e simulação-infectados A549 células foram fixo, manchadas e criação da imagem de acordo com o protocolo em 24, 36 e 48 HPI. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.