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Adsorção de esporos, como um sistema de exibição Nonrecombinant por enzimas e antígenos

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DOI:

10.3791/59102

⸱

19 de março de 2019

 ,  , 
1Department of Biology, Federico II University, 2Department of Molecular Medicine and Medical Biotechnology, University of Naples "Federico II"

Neste artigo

Resumo

Este protocolo incide sobre o uso de esporos bacterianos como uma ferramenta de "ao vivo" nanobiotechnological para adsorver moléculas heterólogos com várias atividades biológicas. Também são mostrados os métodos para medir a eficiência da adsorção.

Resumo

O esporo bacteriano é uma célula metabolicamente quiescente, formada por uma série de camadas protetoras cercando uma citoplasma desidratada. Essa estrutura peculiar faz com que o esporo extremamente estável e resistente e tem sugeriu o uso do esporo como uma plataforma para exibir moléculas heterólogos. Até agora, uma variedade de enzimas e antígenos tenham sido exibidos em esporos de Bacillus subtilis e de algumas outras espécies, inicialmente por uma abordagem recombinante e, em seguida, por um simples e eficiente método de nonrecombinant. O sistema de exibição nonrecombinant baseia-se a adsorção direta de heterólogos moléculas sobre a superfície do esporo, evitando a construção de cepas recombinantes e a liberação de bactérias geneticamente modificadas no ambiente. Adsorvida moléculas são estabilizadas e protegidas pela interação com esporos, que limita a degradação rápida dos antígenos e a perda da atividade da enzima em condições desfavoráveis. Uma vez utilizado, esporo-adsorvido enzimas podem ser facilmente coletadas com uma redução mínima de atividade e reutilizadas para rodadas adicionais de reação. Neste trabalho é mostrado como adsorver moléculas modelo para purificado esporos de b. subtilis, como avaliar a eficiência de adsorção e como coletar esporos usados para reciclá-los para novas reações.

Introdução

Sistemas de visualização visam apresentar moléculas biologicamente ativas na superfície de microorganismos e encontrando aplicações em uma variedade de campos, de industrial de biotecnologia médica e ambiental. Além do fago1,2 e células de vários Gram - positivo e espécie3,4,5,6,7, esporos bacterianos foram também proposto como sistemas de exposição por duas abordagens8,9.

Devido à sua estrutura peculiar, ou seja uma citoplasma desidratada rodeada por uma série de camadas protetoras10, o esporo oferece várias vantagens em fago - e baseada em célula exibir sistemas8,9. Uma primeira vantagem vem da extrema robustez e estabilidade de esporos em condições que seriam deletérios para todas as outras células10,11. Enzimas e antígenos de esporo é exibido são estáveis, após prolongado armazenamento em temperatura ambiente12 e protegida da degradação em pH baixo e altas temperaturas13. Uma segunda vantagem dos esporos é a segurança de muitas espécies formadoras de esporos. B. subtilis, b. clausii, b. coagulanse várias outras espécies são utilizados mundialmente como probióticos e tem sido no mercado para uso humano ou animal por décadas14,15. Este registro de segurança excepcional é um requisito geral óbvio para um sistema de exibição de superfície e é de particular relevância quando o sistema se destina para uso humano ou animal16. Um terceiro, vantagem importante de um sistema de vídeo baseados em esporo é que não tem limitações para o tamanho da molécula que tem que ser exposto. Em sistemas baseados no fago, uma grande proteína heteróloga pode afetar a estrutura do capsídeo, enquanto em sistemas baseados em células, podem afetar a estrutura da membrana ou podem limite/afectar a membrana translocação passo17. As camadas protetoras em torno do germe são compostas de mais de 70 diferentes proteínas10 e são flexíveis o suficiente para aceitar grandes proteínas estrangeiras sem qualquer defeito estrutural evidente ou comprometimento funcional8. Além disso, com ambos os sistemas de vídeo baseados em esporos, a translocação da membrana da proteína heteróloga não é necessário8,9. Na verdade, proteínas heterólogos são produzidas no citoplasma da célula-mãe e montadas o Spore que está se formando no mesmo citoplasma ou adsorvido no esporo maduro8,9.

Exposição de esporos obteve-se, inicialmente, através do desenvolvimento de um sistema genético para a superfície do esporo18de engenheiro. Este sistema genético baseou-se na eu) a construção de uma fusão do gene entre o gene que codifica para uma proteína de casaco de esporos (usada como um porta-aviões) e o gene que codifica para a proteína a ser exibido - a presença dos sinais do endógeno transcriptional e translacionais Gene controlará a expressão da fusão e ii) integração do gene quimérico no cromossomo b. subtilis conceder estabilidade genética. Uma variedade de enzimas e antígenos tem sido exibido por esta abordagem recombinante, usando várias proteínas de superfície de esporos como portadores e visando diversas aplicações potenciais, que variam de vacina da mucosa a biocatalisador, biosensor, biorremediação, ou bioanalíticos ferramenta8,13.

Mais recentemente, uma abordagem diferente da exposição de esporos tem sido desenvolvidos19. Este segundo sistema é nonrecombinant e baseia-se na adsorção de moléculas sobre a superfície do esporo9espontânea e extremamente apertada. Antígenos19,20 e enzimas13,21 tenham sido exibidos de forma eficiente e revelaram que este método é significativamente mais eficiente do que a recombinação. Essa abordagem nonrecombinant permite a exibição das proteínas em forma nativa20 e também pode ser usada com autoclavados, esporos de morte19. O mecanismo molecular de adsorção tem não foi totalmente esclarecido ainda. A carga negativa e a hidrofobicidade dos esporos foram propostas como propriedades relevantes para a adsorção de13,19,22. Recentemente, demonstrou-se que uma proteína de modelo, a proteína de autofluorescent vermelho (mRFP) do coral Discosoma, quando adsorvido para o spore, foi capaz de se infiltrar através das camadas superficiais, localizando-se no revestimento interno23. Se provou verdadeiro para outras proteínas, a localização interna das proteínas heterólogos pode explicar sua estabilidade aumentada quando adsorvido a esporos23.

Em um estudo recente, duas enzimas catalisando duas etapas sucessivas da via de degradação de xilana independentemente foram exibidas em esporos de b. subtilis em, quando incubados juntos, foram capazes de realizar as duas etapas de degradação21. Esporos recolhidos após a reação foram ainda ativo e capaz de continuar a degradação de xilana mediante a adição de substrato fresco21. Mesmo que a segunda reação21, observou-se uma perda de cerca de 15% do produto final, a reusabilidade das enzimas adsorvidas para reações simples, bem como várias etapas, é uma vantagem adicional importante do sistema de exposição de esporos.

Pan et al24 relatou uma abordagem adicional para exibir heterólogos proteínas sobre a superfície do esporo: proteínas heterólogos (uma proteína de palha e uma beta-galactosidase um) produzidas na célula mãe durante esporulação eram espontaneamente envolto no casaco formando esporos, sem a necessidade de uma operadora. Este sistema de exibição adicionais esporo é uma combinação das duas abordagens descritas até agora. De fato, é recombinante desde as proteínas heterólogos foram projetadas para ser expressa em células-mãe durante esporulação, enquanto seu assembly dentro do casaco foi espontânea e, portanto, nonrecombinant24. No entanto, a eficiência da exposição desta abordagem adicional permanece para ser testadas e comparadas com as outras duas abordagens usando as mesmas proteínas heterólogos.

O presente protocolo exclui os processos de produção de esporos e purificação, que tem sido extensivamente em outros lugares descritos24. Inclui a reação de adsorção, a avaliação da eficiência de adsorção por microscopia-mancha do ponto e fluorescência, e a reciclagem de enzimas adsorvidas por reação adicional rodadas.

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Protocolo

1. reação de adsorção

  1. Incubar a 2, 5 e 10 µ g de mRFP com 2 x 109 de b. subtilis spores purificados do selvagem-tipo em 200 µ l de binding buffer, citrato de sódio 50 mM, pH 4.0 (16,7 mM citrato de sódio di-hidratado, ácido cítrico de 33,3 mM) por 1h a 25 ° C, num balanço agitador (Figura 1) .
  2. Centrifugar as misturas de vinculação (13.000 x g durante 10 minutos) para fractionate Pelotas (P2, P5 e P10) e sobrenadantes (S2, S5 e S10). Armazene os sobrenadantes para a avaliação indirecta da eficiência de adsorção descrita no passo 3.2.
  3. Lave as pelotas 2 x com 200 µ l de binding buffer e ressuspender em 100 µ l de ligação do buffer e usá-lo para a próxima análise.
    Nota: A reação de ligação ocorre preferencialmente em um valor de pH mais baixo do que o ponto isoelétrico da proteína; Normalmente, 1,5 M fosfato salino (PBS), pH 4.0, ou citrato de sódio 50 mM, pH 4.0, são usados.

2. direta avaliação da eficiência de adsorção

  1. Extração de proteínas de superfície e análise ocidental do borrão
    1. Pegue 50 µ l de ressuspensão dos esporos mRFP-adsorvido (P2, P5 e P10 da etapa 1.3) e adicionar 50 µ l de 2x do sulfato dodecyl de sódio (SDS)-ditiotreitol (DTT) (0.1 M Tris-HCl, pH 6,8; 2% SDS; 0,1 M DTT) para solubilizar proteínas de superfície do esporo.
    2. Use o mRFP livre, purificada e extratos das mesmas quantidades de esporos que não são adsorvidos à proteína como controles positivos e negativos, respectivamente.
    3. Depois de 45 min. de incubação a 65 ° C, centrifugar (13.000 x g durante 10 minutos) as misturas e analisar 10 µ l das proteínas extraídas (sobrenadante) pelo borrão ocidental com o anticorpo monoclonal, anticorpo antiseu reconhecendo a sua marca presente no N-terminal da mRFP ( Figura 2A).
  2. Observações de microscopia fluorescente
    Nota: Usando proteínas fluorescentes heterólogos ou realizando uma análise de imunofluorescência, é possível localizar e quantificar as moléculas adsorvidas por microscopia de fluorescência.
    1. Tome 5 µ l de ressuspensão dos esporos adsorvida da etapa 1.3 e adicione 95 µ l de 1X PBS, pH 4.0, para obter ~ 1 x 106 esporos / µ l.
    2. Lugar 5 µ l de suspensão de um slide de microscópio, cubra-o com uma lamela previamente tratada com poli-l-lisina por 30 s e observá-lo sob um microscópio de fluorescência.
    3. Para cada campo, salve a imagem de microscopia de contraste de fase e a imagem de microscopia de fluorescência (Figura 2B).
      Nota: Como alternativa, os esporos fluorescentes podem ser analisados pelo cytofluorimetry. Ressuspender um total de 106 esporos adsorvido ou não-adsorvido com a proteína heteróloga em 1 mL de 1X PBS, pH 4.0 e analisar a suspensão usando um citômetro de fluxo (Figura 2C).
  3. Análise de dados usando o ImageJ
    1. Abra as imagens de microscopia de fluorescência com software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) e verifique se todas as imagens estão no formato 8-bit (imagem | Tipo | 8-bit).
    2. Ajustar o contraste, se necessário (imagem | Ajustar | Brilho contraste) e verifique se que a escala da imagem é PIXEL (imagem | Definir escala).
    3. No menu Analyze, selecione definir medidas. Certifique-se de ter áreae Densidade integrada Quer dizer cinza valor selecionado.
    4. Desenhar uma linha ao redor os esporos de interesse usando qualquer uma das ferramentas de desenho/seleção (ou seja, círculo, polígono, ou forma livre) (Figura 3).
    5. Selecione a medida do menu Analyze (ou bater cmd + M). Aparece uma caixa de pop-up com uma pilha de valores para este primeiro esporos (Figura 3).
    6. Repita esses dois passos para pelo menos 50 outros esporos no campo de visão escolhido para ser medido.
    7. Selecione várias regiões sem qualquer esporos (que não têm nenhuma fluorescência) e repita a medição; Este será o fundo.
      Nota: O tamanho não é importante. Esses valores de fluorescência de fundo correspondente serão usados para subtrair manualmente o plano de fundo.
    8. Selecione todos os dados na janela de resultados e copiar os resultados para uma planilha.
    9. Calcular a média da área dos esporos selecionados e dos valores de fluorescência de fundo e Densidade integrada e usá-los para obter a fluorescência corrigida total-por-célula (CTCF) usando a fórmula: CTCF = médio integrado Densidade - (área média x média fluorescência de fundo).
      Nota: Como alternativa, se todos os esporos aparecem bem separados, é possível analisar todos os esporos do campo de imagem usando a função Analisar partículas, seguindo as instruções do ImageJ. Para evitar que o software lê uma fluorescência específica ou agregados de esporos, a dimensão das partículas deve ser definido no pixelˆ2 = 50-200 (Figura 4).

3. indireta avaliação da eficiência de adsorção

  1. Prepare diluições em série para a proteína purificada.
    1. Prepare um primeiro tubo de 1,5 mL, contendo 250 µ l de mRFP purificada em uma concentração final de 0,5 ng / µ l, usando o buffer de vinculação. Este volume é suficiente para carregar duas pistas.
    2. Realize seis serial diluições de 250 µ l (volume final) cada, usando o buffer de vinculação.
  2. Prepare duas diluições em série para as amostras de sobrenadante contendo a fração de mRFP desvinculado da reação de adsorção (S2, S5 e S10 da etapa 1.2).
    1. Coloque 100 µ l de cada sobrenadante em um tubo de 1,5 mL e adicionar 100 µ l de tampão de ligação. Realize seis serial diluições de 200 µ l (volume final) cada, usando o buffer de vinculação.
  3. Corte um nitrocelulose membrana (0,45 µm de corte), 9 x 10 cm em tamanho, para cobrir a área de 5 (número de amostras) x 6 pontos (número de diluições). A membrana não deve estender-se além da borda da gaxeta do aparato de dot blot.
  4. Coloque a membrana prewet no aparelho dot blot. Remova quaisquer bolhas de ar presas entre a membrana e a gaxeta. Cobrir a parcela não utilizada do aparato com filme fita ou parafina para evitar ar movendo-se através desses poços.
  5. Monte o aparelho de borrão de ponto conforme descrito pelo fabricante.
  6. Se um vácuo é usado durante a montagem, reidratar a membrana com 100 µ l de 1X PBS por alvéolo para garantir a ligação uniforme do antígeno e evitar auréolas ou um sinal fraco da deteção.
  7. Remova cuidadosamente o buffer dos poços por vácuo. Assim que a solução-tampão drena de todos os poços, parar a bomba de vácuo e desconectá-lo.
  8. Carrega o padrão nas duas pistas mais externos e as amostras no meio (Figura 5). Encha os poços apropriados com 100 µ l de cada diluição. O mesmo volume utilizado para cada poço deve garantir uma filtragem homogênea de todos os poços da amostra.
  9. Ligue a bomba de vácuo por 2 min, pare com isso e em seguida, permitir que a amostra filtrar através da membrana por fluxo de gravidade.
  10. Lave todos os poços com 100 µ l de 1X PBS e deixe a bomba de vácuo, executada por outro 5 min após o tampão de lavagem foi completamente drenada do aparelho.
  11. Com o vácuo na, desaperte os parafusos e abra cuidadosamente o aparelho de borrão do ponto.
  12. Desligar o aspirador, tirar a membrana e processá-lo seguindo um protocolo de borrão ocidental.
  13. Realizar uma análise densitométricos do filtro, utilizando software apropriado, como o ImageJ.
    1. Medir a densidade integrada de cada ponto, delineando-os com um círculo de mesma área e usando o comando Analyze/medida .
    2. Fazer uma correção de fundo da imagem, desenhando um círculo em uma área vazia e medição da sua densidade, integrada ou usando o comando de Processo/subtrair fundo .
    3. Correlacionar a densidade integrada dos pontos padrão com a quantidade de proteína carregada e obter uma linha de calibração (R2 valores para a calibração de curvas deve acabar 0,95).
    4. Utilização da curva de calibração para extrapolar a concentração de mRFP de cada ponto da amostra.
    5. Calcule a concentração da mRFP restante nas fracções não acopladas.
      Nota: Para garantir o fechamento correto do aparato de borrão de ponto e, portanto, sujeito a membrana para uma pressão uniforme, aperte os parafusos, seguindo um esquema diagonalmente cruzado e, em seguida, abra a bomba de vácuo para apertar os parafusos mais fortemente.

4. coleção de esporos e reutilizar

  1. Para a reciclagem de esporo adsorvido, execute duas reações de adsorção de 2,0 x 109 purificado de esporos com 10 µ g de purificado GH10-XA xilanase ou 10 µ g de β purificado de GH3-XT-xylosidase, conforme descrito nas etapas 1.1-1.3 (Figura 6A).
  2. Recolher os pellets contendo os esporos de enzima-adsorvido, resuspenda-los em 50 µ l de buffer ideal para o ensaio de reação enzimática (50 mM de tampão de fosfato de sódio em pH 6,5; 2,48689 g/L, Na2HPO4, 4,88991 g/L NaH2PO4), e misturá-los juntos para obter uma mistura de 100 µ l de esporos fixando GH10-XA ou GH3-XT.
  3. Adicione o substrato (5 mg/mL 4-O-methyl-d-glucuronod-xylan [MGX]) e deixe as reacções enzimáticas ocorrem para 16 h a 65 ° C.
  4. Centrifugue a mistura de reação (por 15 min a 13.000 x g) e armazenar o sobrenadante contendo o produto da reação enzimática.
  5. Resuspenda o pellet em 100 µ l de tampão de fosfato de sódio fresco 50 milímetros em pH 6,5 na presença de um novo substrato (MGX) (Figura 6B).
    Nota: Para adsorver mais de uma enzima, é possível absorver os dois juntos ou um de forma independente. A última possibilidade facilita a análise quantitativa da eficiência da adsorção e da atividade de cada enzima, permitindo um balanço estequiométrico de cada enzima necessária para as reações.

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Resultados

Adsorção de sucesso pode ser avaliada pela mancha ocidental. Após a reação, a mistura é fracionada por centrifugação e lavada, e a fração de pelota (Figura 1) é usada para extrair as proteínas de superfície. O extrato é fracionado por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (página), electrotransferred a uma membrana de polivinilideno (PVDF) de flúor e reagiu contra anticorpos primários e secundários. A presença de proteínas do tamanho esperado, apenas na p...

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Discussão

Este protocolo de adsorção de esporos é muito simples e direto. A reação é estritamente dependente do pH do buffer de reação e a eficiência da adsorção é ideal em valores de pH ácido (pH 5.0 ou inferior). Em condições de pH neutro, a eficiência da adsorção é baixa, e em valores de pH alcalino, a adsorção pode não ocorrer. Adsorção ideal é obtida usando um volume de 200 µ l em tubos de 1,5 mL (ou mantendo uma relação semelhante) num agitador de balanço.

Adsorção é muito apertada, e lavagens com...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela "Finanziamento di Ricerca di Ateneo" de L. Baccigalupi, título do projeto "SP-LAY: esporos de bactérias como plataforma ao vivo para exibição de proteínas".

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de poli-L-lisina a 0,1%SigmaP8920
0,45 µ m Membrana de Nitrocelulose para BlottingSartoriusM_Blotting_Membranes
100&vezes; objetivo UPlanF1 Equipamento
Olympus Bacillus subtilis  cepa NCIB3610Bacillus Genetic Stock Center3A1
BD ACCURI C6 PLUSBDcitômetro
BX51fluorescenteOlympus
ClarityBiorad1705060
câmera digital DP70 umequipamentoOlympus
Anticorpo secundário de adsorção cruzada IgG (H+L) de cabra anti-coelho, FITCThermo fisherF-2754
Cabra Anti-Coelho IgG H& L (HRP) Abcamab6721
Monoclonal Anti-poli-histidina− Anticorpo peroxidaseSigmaA7058-1VLusado para detectar proteínas adsorvidas apresentando uma marca de 6xhistidina no terminal C ou N.
SecureSlip  lamínula de vidroSigmaS1815-1PAK
Superwhite Lâminas de Microscópio Não CarregadasVWR75836-190
U-CA Trocador de Ampliação EquipamentoOlympus
de microscópio de fluxo Microscópio de microscópio de microscópio

Referências

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