Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Summary

Este protocolo descreve procedimentos experimentais para caracterizar todo o genoma de alterações nos níveis de modificações borne-translational do histone (PTM) ocorrendo em relação a superexpressão de proteínas associadas com a ALS e a doença de Parkinson em Modelos de Saccharomyces cerevisiae . Após a separação de SDS-PAGE, níveis PTM histona individuais são detectados anticorpos específicos de modificação através da mancha ocidental.

Abstract

Doenças neurodegenerativas, como esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Parkinson (PD), causam a perda de centenas de milhares de vidas anualmente. Opções de tratamento eficazes, capazes de impedir a progressão da doença são escassos. Apesar dos esforços de sequenciamento extensa em grandes populações de pacientes, a maioria dos casos de ALS e PD permanecem inexplicável por mutações genéticas sozinhos. Epigenetics mecanismos, tais como a modificação pós-traducional de proteínas histonas, podem estar envolvidos na progressão e etiologia de doenças neurodegenerativas e levam a novos alvos para intervenção farmacêutica. Mamíferos modelos in vivo e in vitro da ALS e PD são caros e muitas vezes exigem prolongados e laboriosos de protocolos experimentais. Aqui, podemos delinear uma abordagem prática, rápida e econômica para determinar todo o genoma de alterações nos níveis de modificação de histona utilizando Saccharomyces cerevisiae como um sistema modelo. Este protocolo permite investigações abrangentes sobre alterações epigenéticas, ligadas ao proteinopathies neurodegenerativas que corroborar conclusões anteriores em sistemas diferentes do modelo ao mesmo tempo expandindo significativamente nosso conhecimento sobre o Epigenoma de doenças neurodegenerativas.

Introduction

Doenças neurodegenerativas são doenças devastadoras, com pouca ou nenhuma opção de tratamento disponível. Entre estes, a esclerose lateral amiotrófica (ela) e a doença de Parkinson (PD) são particularmente terrível. Aproximadamente 90% dos casos de ALS e PD são considerados esporádicos, ocorrendo sem histórico familiar da doença, enquanto os restantes casos funcionar nas famílias e geralmente estão ligados a um gene específico mutação^1,2. Curiosamente, ambos destas doenças estão associados com a proteína mislocalization e agregação de^3,4,

Protocol

1. transformar S. cerevisiae com construções de proteína associada proteinopathy neurodegenerativas

1. Crescer tipo selvagem (WT) 303 fermento no fermento extrato peptona dextrose (YPD) caldo de carne durante a noite com agitação (200 rpm) a 30 ° C.
2. Após 12−16 h do crescimento, diluir o fermento para uma densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀) de 0.25 com YPD. Como 10 mL de cultura de levedura líquida serão necessários para cada transformação, preparar 50 mL de cultura de levedura líquida para cinco transformações correspondentes a FUS, TDP-43, um-synuclein e construções de vetor único (ccdB), bem como uma transformação de controlo nega....

Results

Para ilustrar este método, nós vai aproveitar resultados recentemente publicados³⁰. WT FUS humana e TDP-43 eram overexpressed por 5h, enquanto WT α-synuclein foi overexpressed para 8 h. Uma construção de ccdB foi usada como um controle negativo do vetor. A Figura 2 mostra a supressão do crescimento em culturas de sólidos e líquidas. Levedura foi colhida conforme descrito e mancha ocidental com anticorpos específicos modificação foi rea.......

Discussion

O protocolo descrito aqui fornece uma maneira simples, conveniente e econômica de categorização de alterações de todo o genoma do histone PTM correlacionadas com proteinopathies neurodegenerativas. Embora existam outros modelos de ALS e PD, como in vitro murino e linhas de células humanas modelos de³², S. cerevisiae permanece atraente por causa de sua facilidade de uso. Por exemplo, modelos de fermento não requer o uso de um capuz estéril, nem eles exigem o intensivo treinamento .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
-Seu suplemento de OD	Clontech	630415
10x Running Buffer			Mix: 141,65 g de glicina (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g de base Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g de dodecil sulfato de sódio (Sigma-Aldrich L3771) e 1 L de água deionizada, pH 8,8.
12% de géis de poliacrilamida	BIO-RAD	456-1041
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Anti-acetil-histona H3 (Lys14) Anticorpo primário	MilliporeSigma	07-353 (Lote nº 2762291)	Diluição: 1/1000
Anti-acetil-histona H4 (Lys 16) Anticorpo primário	Abcam	ab109463 (Lote nº. GR187780)	Diluição: 1/2000
Anti-acetil-histona H4 (Lys12) Anticorpo primário	Abcam	ab46983 (Lote nº. GR71882)	Diluição: 1/5000
Anti-dimetil-histona H3 (Lys36) Anticorpo primário	Abcam	ab9049 (Lote nº. GR266894, GR3236147)	Diluição: 1/1000
Anticorpo Primário Anti-Histona H3	Abcam	ab24834 (Lote nº. GR236539, GR174196, GR3194335)	Controle de Carga Nuclear; Diluição: 1/2000
Anti-fosfo-histona H2B (Thr129) Anticorpo primário	Abcam	ab188292 (Lote nº. GR211874)	Diluição: 1/1000
Anti-fosfo-histona H3 (Ser10) Anticorpo primário	Abcam	ab5176 (Lote nº. GR264582, GR192662, GR3217296)	Diluição: 1/1000
Biofotômetro D30	Eppendorf	6133000010
Placa de Cultura de Células (100 x 20 mm)	Eppendorf	30702118
Placa de Cultura de Células, 96 poços	Eppendorf	30730011
Centrífuga 5804/5804 R/5810/5810 R	Eppendorf	22625501
Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW	LI-COR	926-32212 (Nº do lote C60301-05, C61116-02, C80108-05)	Diluição: 1/5000
Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD	LI-COR	926-68073 (Nº do lote C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07)	Diluição: 1/2500
Etanol	Sigma-Aldrich	E7023
Papel extra grosso (papel de filtro)	BIO-RAD	1703968
Galactose	Sigma-Aldrich	G0750	Prepare a solução estoque a 20% p/v.
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270	Prepare a solução estoque a 20% p/v.
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Preparar a solução a 50 % p/v.
Membranas de transferência Immobilon-FL	MilliporeSigma	IPFL00010
Acetato de lítio di-hidratado (LiAc)	Sigma-Aldrich	L4158	Prepare uma solução 1 M.
Mistura de corante			: 1,2 g de dodecil sulfato de sódio, 6 mg de azul de bromofenol (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 mL de glicerol, 1,2 mL 0,5M Trizma base pH 6,8, 0,93 g de DL-Ditiotreitol (Sigma-Aldrich D0632) e 2,1 mL de água deionizada.
Metanol	ThermoFisher	A412-4
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell	BIO-RAD	1658004
Pipeta multicanal	Eppendorf	2231300045
NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x	New England Bio Labs	102855-152
Nhe I Restriction Enzyme	New England Bio Labs	101228-710
Qiagen	129114		de Água Livre de Nuclease
	LI-COR Biosciences	2800-03
OmniTray Cell Culture Tratada com Tampa Estéril, PS (86 x 128 mm)	ThermoFisher	165218
pAG303GAL-a-sinucleína-GFP	Presente de A. Gitler
pAG303GAL-ccdB	Addgene	14133
pAG303Gal-FUS	Addgene	29614
pAG303GAL-TDP-43	Presente de A. Gitler
Poli (etilenoglicol) (PEG)	Sigma-Aldrich	P4338	Prepare uma solução a 50% p / v.
Mancha Ponceau S	Sigma-Aldrich	P3504	Mix: 0,5 g 0,1% p/p Corante Ponceau S, 5 mL 1% v/v ácido acético (Sigma-Aldrich 320099) e 500 mL de água deionizada.
Fonte de alimentação básica PowerPac	BIO-RAD	164-5050
Rafinose pentahidratada	Sigma-Aldrich	R7630	Prepare a solução de estoque a 10% p/v.
DNA de esperma de salmão	Agilent Tech	201190
SD-His placas			Mistura: 20 g de ágar (Sigma-Aldrich A1296), 0,77 g de suplemento de OD de his, 6,7 g de levedura à base de nitrogênio sem aminoácidos (ThermoFisher 291920) e 900 mL de água deionizada.
Mistura de placas			: 20 g de ágar, 0,77 g de suplemento de OD de His, 6,7 g de levedura à base de nitrogênio sem aminoácidos, 100 mL de solução de galactose e 900 mL de água deionizada.
		de carregamento de dodecil sulfato de sódio	Armazenar a -20 oC. 6X, Mistura: 1,2 g de dodecil sulfato de sódio, 6 mg de azul de bromofenol, 0,93 g de DL-Ditiotreitol, 2,1 mL de água deionizada, 4,7 mL de glicerol e 1,2 mL de base de 0,5 M Trizma, pH 6,8.
Hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich	221465	Prepare a solução 0,2 M.
Sacarose	Sigma-Aldrich	84097	Prepare 20% p / v solução estoque.
TBS + 0,1% Tween 20 (TBST)			Mix: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) e 900 mL de água deionizada.
TBS Blocking Buffer	LI-COR	927-5000
Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell	BIO-RAD	170-3940
Transfer Buffer			Mix: 22,5 g de glicina, 4,84 g de base de Tizma, 400 mL de metanol, 1 g de dodecil sulfato de sódio e 1,6 L de água deionizada.
Solução salina tamponada com Tris (TBS)			10X, 7,6 pH, Solução: Misture 24 g de base Trizma e 88 g de cloreto de sódio (Sigma-Aldrich S7653). Encha até 1 L com água deionizada.
WT 303 S. cerevisiae levedura	Presente de J. Shorter
Extrato de levedura Peptona Dextrose (YPD)	Sigma-Aldrich	Y1375