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Artigo de método

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

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⸱

DOI:

10.3791/59114

⸱

2 de março de 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati

Neste artigo

Resumo

Este protocolo permite a visualização da expressão gênica em embrionárias Astyanax cavefish. Esta abordagem foi desenvolvida com o objetivo de maximizar o sinal de expressão do gene, minimizando a coloração de fundo específico.

Resumo

Nos últimos anos, foi lançado um genoma de projecto para o cego mexicano cavefish (Astyanax mexicanus), revelando as identidades de sequência para milhares de genes. Pesquisas anteriores neste sistema modelo emergente capitalizou investigações abrangentes de todo o genoma que identificaram numerosos loci de traço quantitativos (QTL) associado com vários fenótipos associados a caverna. No entanto, a capacidade de conectar os genes de interesse para a base hereditária para mudança fenotípica permanece um desafio significativo. Uma técnica que pode facilitar a compreensão mais profunda do papel do desenvolvimento na evolução troglomorphic é toda a montagem hibridação in situ. Esta técnica pode ser implementada para diretamente comparar a expressão gênica entre as formas e superfície-habitações na caverna, nomear candidato genes subjacentes QTL estabelecida, identificar os genes de interesse em estudos de sequenciamento de nova geração ou desenvolver outros abordagens de descoberta. Neste relatório, nós apresentamos um protocolo simples, apoiado por uma lista de verificação flexível, que pode ser amplamente adaptada para o uso bem além do sistema de estudo apresentado. Espera-se que este protocolo pode servir como um grande recurso para a comunidade de Astyanax e além.

Introdução

Hibridação in situ é um método comum para coloração de tecidos fixos para visualizar de padrões de expressão de gene1. Esta técnica tem sido realizada há anos em outros tradicionais2 e não-tradicionais3 sistemas de modelo, para uma variedade de estudos biológicos. No entanto, várias etapas e os reagentes são necessários para executar com êxito este procedimento. Para os investigadores que nunca tenham realizado esta técnica, iniciar o processo pode ser intimidante, devido as muitas etapas envolvidas. Além disso, a natureza longa deste procedimento presta-se a erros técnicos, que podem ser um desafio para solucionar problemas.

O objetivo geral deste artigo é apresentar um método simples e direto que irá processar esta técnica de hibridização acessível a um vasto público. Para reduzir a introdução de erros, nós apresentamos uma abordagem direta que produz coloração de expressão do gene de alta qualidade e minimiza o sinal de fundo específico. Este procedimento é semelhante a outras abordagens desenvolvidas em sistemas modelo tradicional, como Danio rerio4. Aqui, pretendemos facilitar a aplicação cuidadosa de cada etapa usando uma lista de verificação para download (arquivo suplementar 1), para promover a aplicação cuidadosa do protocolo. A justificativa para fazer isto é para facilitar a organização através dos muitos passos envolvidos neste procedimento. Este artigo é apropriado para pesquisadores interessados em realizar toda a montagem hibridização in situ no desenvolvimento de embriões, mas ainda não ter realizado o procedimento. A vantagem da abordagem escolhida por pesquisadores de Astyanax é que tem sido testada e comprovada em cavefish e morfos de peixe de superfície, facilitando a análise comparativa da expressão. O método apresentado pode ser usado por pesquisadores em estudos sobre Astyanax e outros sistemas.

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Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da University of Cincinnati (protocolo #10-01-01-21).

1. fixação

  1. Isolar o número desejado de Astyanax mexicanus embriões de um tanque de reprodução e corrigir ~ 50 embriões de cada vez. Se os embriões são grandes e antigos, pode ser necessário fixar 25 ao mesmo tempo para garantir a fixação do mesmo.
  2. Dependendo da idade do embrião, utilize o método aprovado IACUC de anestesia. Para os mais antigos embriões com um funcionamento do sistema nervoso, sacrifica embriões através de overdose de anestésico. Nesse sentido, coloca embriões em uma solução de ~ 1% metanosulfonato (tamponada de pH 7,4) para minimizar a dor e desconforto para o organismo.
  3. Uma vez que os embriões não respondem ao toque, sistema de água contendo tricaina e adicionar ~ 1 mL de 1x tampão fosfato salino (PBS, pH 7,4).
  4. Remover a solução de PBS e adicionar 1 mL de paraformaldeído 4% (PFA). Fixar os embriões durante a noite a 4 ° C.
    Atenção: PFA é perigosa (ou seja, é inflamável e é uma pele e irritantes do pulmão), manuseie com cuidado.

2. desidratação

  1. Para desidratar os embriões, retire a fixador solução e enxágue com 1 mL de PBS. Coloque os frascos contendo embriões em um ângulo (entre 30° e 45°), num agitador de plataforma durante o enxágue. Continue a lavar os embriões duas vezes, 5 min por lavagem.
  2. Se os embriões ainda têm um córion, coloque todos os 50 embriões em uma 100 x 25 mm placa de Petri e cuidadosamente, isolá-los dos chorions usando dois conjuntos de pinças de relojoeiro (por exemplo, #5 pinças) sob um microscópio.
    Nota: Durante as etapas descritas abaixo e para o restante do protocolo, cuidadosamente retire todo o líquido do passo anterior usando limpa, pipetas de Pasteur de vidro antes de adicionar a seguinte solução
  3. Desidrata-se os embriões em uma série de lavagens cada vez mais concentradas de metanol (MeOH) descrito abaixo. As diluições são baseadas em um volume total de 1 mL com 500 µ l de solução em cada frasco de vidro de 4 mL. Execute todas as etapas de desidratação em temperatura ambiente (RT) agitador de plataforma.
    1. Remova cuidadosamente a solução de PBS. Adicione uma solução de MeOH de 25% (250 µ l de MeOH) + 750 µ l de PBS. Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.
    2. Remova cuidadosamente a solução de MeOH 25%. Adicione uma solução de 50% MeOH (500 µ l de MeOH) + 500 µ l de PBS. Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.
    3. Remova cuidadosamente a solução de MeOH 50%. Adicione uma solução de MeOH 75% (750 µ l de MeOH) + 250 µ l de PBS. Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 minutos.
    4. Remova cuidadosamente a solução de MeOH 75%. Adicione uma solução de MeOH 100% (1 mL de MeOH). Agite suavemente num agitador de plataforma 5 min. Repita este passo 3 vezes.
  4. Neste ponto, armazene embriões desidratados, conforme necessário, em seus frascos de vidro a-20 ° C (longo prazo). Alternativamente, vá direto ao dia 1 do protocolo.

3. dia 1: reidratação

  1. Obter embriões desidratados do congelador-20 ° C (ou proceder directamente da etapa 2.5).
  2. Classificar os embriões com uma pipeta Pasteur. Um pode classificar com base no Morfotipo (i.e., caverna e/ou superfície), e o número de genes avaliados em cada experimento. Há normalmente não mais que 12 embriões por frasco uma vez classificados. Para manter a organização, use fita colorida laboratório para designar os frascos e pipetas para cada gene. Os embriões vão ficar no mesmo frasco em todo o protocolo inteiro.
    Nota: Lugar a ponta da pipeta Pasteur em 100% EtOH para esterilizar entre usa.
  3. Defina um tremendo banho de água a 70 ° C, para ser usado em uma etapa posterior. Cuidadosamente, retire o MeOH em frascos de embriões classificados e substituir com 500 µ l de novo 100% MeOH. Lavagem brevemente (~ 1 min) agitador de plataforma.
  4. Reidratar embriões em uma concentração crescente de 1X PBS com Tween 20 (PBT, veja abaixo), agitador de plataforma. As diluições são baseadas em um volume de diluição final de 1 mL com 500 µ l em cada frasco.
    1. Adicione uma solução PBT de 25% (250 µ l de PBT, 750 µ l de MeOH). Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.
    2. Remova cuidadosamente a solução PBT de 25%. Adicione uma solução PBT de 50% (500 µ l de PBT, 500 µ l de MeOH). Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.
    3. Remova cuidadosamente a solução PBT de 50%. Adicione uma solução PBT de 75% (750 µ l de PBT, 250 µ l de MeOH). Agite suavemente num agitador de plataforma por 5 min.
    4. Remova cuidadosamente a solução PBT de 75%. Adicione uma solução PBT de 100% (1 mL de PBT). Agite suavemente num agitador de plataforma 5 min. Repita este passo 3 vezes.

4. dia 1: Digestão e fixação

  1. Prepare uma solução de K (PK) de proteinase adicionando 1 µ l de PK (20 mg/mL) a 2 mL de PBT.
  2. Em antecipação de etapas subsequentes, obter alíquotas congeladas de buffers de hibridação (Hyb - e Hyb +; ver suplementar arquivo 2 e 3 de arquivo suplementar) e PFA de armazenamento-20 ° C.
    1. Permitir que o PFA descongelar no RT
    2. Colocar alíquotas de Hyb - e Hyb + num banho rotativo-70 ° C. Coloque todos os reagentes e os frascos dentro de um pequeno "junta" com um fundo de malha, no interior do aparelho de banho de água flutuante. Isso permite que a simples adição e remoção de tubos e frascos do banho-maria a 70 ° C rotativa.
  3. Delicadamente, adicione solução de PK para o conj de embriões, garantindo a todos os tecidos são completamente cobertos com solução. Digerir embriões para ~ 12 min em solução de trabalho PK o agitador de plataforma.
    Nota: O comprimento da digestão pode ser variado pelo investigador para garantir melhores resultados.
  4. Delicadamente, retirar a solução PK e brevemente inundar o frasco com PBT para diluir qualquer restante PK
  5. Retirar a solução PBT e substituir com 500 µ l de PBT de novo. Permitir que a solução enxaguar o agitador de plataforma por 5 min.
  6. Trasfegar PBT e substituir com 500 µ l de descongelado 4% PFA. Permitir que os embriões incubar por 20 min o agitador de plataforma no RT
  7. Retirar os 4% PFA e brevemente inundar o frasco com PBT para diluir qualquer restante PFA. Trasfegar o PBT e substitua com 500 µ l de PBT fresco. Permitir que os embriões enxaguar durante 5 min o agitador de plataforma. Repita esta etapa 4 vezes mais.

5. dia 1: Prehybridization

  1. Lugar de 500 µ l de pré-aquecido Hyb-solução dentro do frasco. Cuidadosamente coloque o frasco na 70 ° C água banho (dentro de gaxetas) sem tremer, por 5 min.
  2. Trasfegar a Hyb-solução e inundar o frasco com 500 µ l de solução Hyb + previamente aquecida. Coloque o frasco volta em banho de água a 70 ° C com agitação (40 rpm). Incubar durante qualquer 4 h, ou uma noite.
    Nota: Uma incubação de 4h renderá um protocolo in-situ completo que irá durar por 4 dias no total. Aqui, esta etapa é apresentada como uma incubação durante a noite, que renderá um protocolo durou 5 dias no total.

6. dia 2: hibridização

  1. Coloque uma parte alíquota do Hyb + do congelador-20 ° C para o tremendo banho de água quente por 5 min.
  2. Trasfegar o Hyb + do frasco e substituir com 500 µ l de pré-aquecido Hyb +. Para esta solução, cuidadosamente adicione 2 µ l de sonda RNA a cada frasco. Agite suavemente o frasco para assegurar uma distribuição uniforme da sonda.
  3. Incube a solução Hyb + (com sonda adicionada) em banho de água quente a 70 ° C durante a noite, agitando a 40 rpm.
    Nota: Um pode re-utilizar solução Hyb + (com sonda). Para isso, ter Hyb + com sonda da primeira execução do congelador-20 ° C e coloque num banho de água quente durante 5 min. Replace Hyb + desde o dia 1 protocolo com Hyb + com sonda e permitir a incubação durante a noite no banho de água quente.

7. dia 3: Preparação de solução

  1. Prepare tubos microcentrifuga rotulados Hyb + com a sonda de RNA "gene de interesse". Prepare a série de diluições que serão usadas durante o dia 3.
    1. Usando 6 tubos separados, preparar a seguinte série de diluições do Hyb - e citrato de sódio salino (CCD, 0 a 100%) em um volume de 1 mL e lugá-los na 70 ° C a tremer água de banho: 1 = 100% de tubo Hyb-(1 mL de Hyb-): tubo 2 = 25% 2 x SSC (250 µ l de 2 x SSC, 750 µ l de Hyb-); Tubo 3 = 50% 2 x SSC (500 µ l de 2 x SSC, 500 µ l do Hyb-); Tubo 4 = 75% 2 x SSC (750 µ l de 2 x SSC, 250 µ l de Hyb-); Tubo de CCD de 2 x 5 = 100% (1 mL de 2 x SSC); Tubo de 6 = 100% x 0.2 SSC (2 mL de 0,2 x SSC).
      Nota: Ser vigilante da concentração do SSC, como muda de 2x para 0.2 x.
    2. Usando 4 separar os tubos, preparar a seguinte série de diluições de PBT e CCD em um volume de 1 mL e coloque no RT: tubo 1 = 25% PBT (250 µ l de PBT, 750 µ l de 0.2 x SSC); Tubo 2 = 50% PBT (500 µ l de PBT, 500 µ l de 0,2 x SSC); Tubo 3 = 75% PBT (750 µ l de PBT, 250 µ l de 0,2 x SSC); Tubo de PBT 4 = 100% (1mL de PBT).
    3. Prepare um tubo com 2 mL de tampão de ácido maleico, contendo solução de trabalho de Tween 20 (MABT).
    4. Prepare dois tubos cónico de 15 mL de solução de bloqueio. Em cada tubo, adicionar 0,2 g de reagente de bloqueio para 10 mL de MABT (ver 4 de arquivo suplementar). Coloque os dois tubos um misturador de oscilador (ou agitador de plataforma) até completamente dissolvido em solução (até 3 h).

8. dia 3: Remoção de sonda

  1. Trasfegar Hyb + (com sonda) solução com uma pipeta Pasteur de vidro e coloque-o em uma estéril, rotulado microcentrifuga tubo. Manter este tubo no congelador-20 ° C para uso futuro (se sonda-rotulagem é bem sucedida).
  2. Cuidadosamente, adicione 500 µ l das SSC quentes/Hyb-diluições (indicado abaixo). Incube em cada uma das seguintes soluções por 10 min em banho de água agitando a 70 ° C.
    1. Incubar em sequência com 100% Hyb-(1ml de Hyb-), 25% 2 x SSC (250 µ l de 2 x SSC, 750 µ l de Hyb-), 50% 2 x SSC (500 µ l de 2 x SSC, 500 µ l do Hyb-), 75% 2 x SSC (750 µ l de 2 x SSC, 250 µ l de Hyb-), 100% 2 x SSC (1ml de 2 x SSC) , 100% 0.2 x SSC (2 mL de 0.2 x SSC).
  3. Após a última etapa, incubar em cada uma das seguintes soluções para 10 min cada. Todos a incubação do seguintes ocorrem em RT o agitador de plataforma: 25% PBT (250 µ l de PBT, 750 µ l de 0.2 x SSC), 50% PBT (500 µ l de PBT, 500 µ l de 0.2 x SSC), 75% PBT (750 µ l de PBT, 250 µ l de 0.2 x SSC) , 100% PBT (1 mL de PBT).
  4. Após uma incubação de 10 min, retire o 100% PBT e adicione 500 µ l de MABT em cada frasco. Repita duas vezes por 5 min.

9. dia 3: bloqueio

  1. Remova MABT de cada frasco e inundação com pré-misturado solução bloqueio de um dos tubos (preparados na etapa 7.1.4). Coloque o frasco em um misturador de oscilador para ~ 4 h no RT
  2. Adicionar 2 µ l de DIG-AP-Fab fragmentos no segundo frasco de 10 mL de solução (preparada na etapa 7.1.4) e brevemente o vórtice de bloqueio.
  3. Encha cada frasco quase completamente com bloqueio (~ 5 mL) de solução e coloque no misturador de oscilador durante a noite no frigorífico a 4 ° C.

10. dia 4: MABT lavagens

  1. Preparar um frasco estoque de 10% de soro de cabra normal (NGS) em MABT (adicionar 100 µ l de NGS para 900 µ l de MABT).
  2. Retirar a solução de bloqueio em cada frasco e adicione 500 µ l de mistura NGS/MABT em cada frasco. Permitir que os embriões incubar durante 25 min no RT o agitador de plataforma.
  3. Substituir a mistura NGS/MABT com 500 µ l de 100% MABT. Incube durante 30 min à RT o agitador de plataforma. Execute este enxaguamento 11 vezes mais ao longo do dia cada 30 min.
  4. Encha o frasco com 100% MABT e coloque em um misturador de oscilador durante a noite em uma câmara de geladeira ou frigorífico a 4 ° C.

11. dia 5: Visualização da ponta de prova

  1. Prepare-se uma alíquota de 50 mL de tampão de fosfatase alcalina (AP) (ver 5 de arquivo suplementar). Combinar o seguinte em um tubo cônico de 50 mL, embrulhado em papel de alumínio para limitar a exposição à luz: 5 mL de 1 M Tris (pH 9,5), 5 mL de 50mm MgCl2, 5ml de 1% Tween 20, 5ml de 1 M NaCl, 30 mL de ddH2O.
  2. Remover MABT e substitua por 1 mL de tampão de AP (tubo envolvido em papel alumínio). Deixe lavar por 5 min. Fazer isso duas vezes para assegurar a remoção completa dos MABT.
  3. Retire o tampão do AP e substituir com 1 mL de tampão de AP com 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate 3.5 μL (BCIP) e 4.5 μL de nitro-azul de tetrazólio (NBT). Substitua com AP recentemente preparada amortecedor/NBT/BCIP uma vez a cada hora até a reação é completa. Acompanhar de perto, verificando a cada 15 minutos, para permitir que a reação de coloração ser feita até o nível desejado de coloração foi alcançado. Se o precipitado começa a se formar, substitua a solução mais cedo.
  4. Pare a reação de coloração enxaguando os embriões no buffer de AP 100% fresco (sem NBT/BCIP) por 5 min. Continue lavagens em PBT até que sejam alcançados os níveis ideais de sinal (com quantidades mínimas de coloração de fundo). Continue enxaguando espécimes com crescentes diluições de PBT no Buffer de AP da seguinte forma: 25% PBT (250 μL de PBT, 750 μL de tampão, AP), enxaguar por 5 min; 50% PBT (500 μL de PBT, 500 μL de tampão, AP), enxaguar por 5 min; 75% PBT (750 μL de PBT, 250 μL de tampão, AP), enxaguar por 5 min.
  5. Enxágue os embriões em ~ 5 mL de 100% PBT no oscilador misturador até desejada de coloração de fundo mínimo é alcançado. Alternar com PBT fresco várias vezes. Isto pode demorar até vários dias.
  6. Quando é uma lavagem completos, lavagem de embriões em 500 µ l de PBS estéril num agitador de plataforma. Execute este enxaguar duas vezes por 5 min. Depois lava-PBS, fixar os espécimes em 500 μL de 4% PFA por 1h no RT num agitador de plataforma. Alternativamente, consertar a noite em 1 mL de 4% PFA na geladeira a 4 ° C.
  7. Substitua o fixador fresco, PBS estéril. Executar este enxágue pelo menos duas vezes por 5 min. do lugar os embriões em ~ 4 mL de PBS estéril de 100% e armazenar a longo prazo a 4 ° C.

12. imaging

  1. Compõem uma placa de imagem em uma placa de Petri usando 3% de agarose e tampão TAE.
    Nota: As quantidades dependem de quantas placas são necessárias. As placas podem ser reutilizadas várias vezes. É recomendável que um molde retangular raso é colocado na caixa de Petri, enquanto o gel está esfriando a fim de criar uma depressão por conter os embriões na placa.
  2. Coloque os embriões na chapa na PBS.
    Nota: Recomenda-se delicadamente despeje embriões na placa em vez de pipetagem-los porque verificou-se que eles vão ficar com o interior de pipetas de plástico.
  3. Microscopia de luz de uso para visualizar cada embrião. Use uma ponta de prova contundente para manobrar os embriões para a posição desejada.
  4. Tirar uma imagem quando o embrião está na posição desejada. Observe que é importante ter imagens de embriões dentro de algumas semanas de coloração concluído para evitar a degradação do potencial da mancha.

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Resultados

Neste relatório, nós fornecemos uma abordagem simples e direta para executar a rotulagem de espécimes de Astyanax embrionárias para análise de expressão do gene de alta qualidade. Esta técnica pode ser realizada em quatro ou cinco dias, e cada etapa principal do procedimento é representada em um fluxograma com codificação de cores (Figura 1). Depois de concluído, manchada de embriões devem abrigar um rótulo cromático roxo escuro em tecidos que expres...

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Discussão

Devido à vulnerabilidade do RNA, a degradação, um dos passos mais importantes no protocolo refere-se a síntese estéril da sonda RNA. No entanto, se uma sonda com cuidado é gerada e fornece bons resultados, ele pode ser reutilizado em reações de coloração subsequentes. Um segundo passo crucial é a produção cuidadosa de todos os reagentes utilizados em todo o protocolo. Uma vez que este protocolo envolve vários dias e muitos pequenos passos, é essencial que todos os reagentes são com precisão produzidos e armazenados de fo...

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Os autores desejam agradecer membros do laboratório Gross para comentários úteis sobre este manuscrito. Gostaríamos de reconhecer quatro estudantes do ensino médio que utilizaram este protocolo durante os estágios de verão em 2017 e 2018, incluindo David Nwankwo, Michael Warden, Aki Li e Christine Cao. HL foi apoiado por uma bolsa UC biologia tronco durante o verão de 2017. Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional da ciência (DEB-1457630 de JBG) e institutos nacionais de dentária e Craniofacial Research (NIH; DE025033 de JBG).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pipeta serológica de 10 mLVWR89130-888
Unidade de filtração de 1000 mLVWR89220-698
Pipeta serológica cónica de 15 mLVWR-Greiner82050-278
Pipeta serológica de 25 mLVWR89130-890
de filtração de 250 mLVWR89220-694
Pipeta serológica de 5 mLVWR89130-886
50 mL cônicoVWR-Falcon21008-940
500 mL Unidade de filtraçãoVWR89220-696
Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos de FabSigma-Roche11093274910
BCIPSigma-AldrichB8503-1G1 g
Solução de bloqueioSigma-Roche11 096 176 00150 g
Ácido CítricoFisher ScientificA104-500500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Tubos Sigma-Roche11175025910
EppendorfVWR20170-577
EtanolFisher-Decon04-355-2231 Gal
FormamidaThermo Fisher Scientific17899100 mL
Frascos de vidro dramVWR66011-0411 Dr
Pipetas de VidroFisher Scientific13-678-8A
HClThermal-ScientificPharmco-AAPER284000ACS500 mL
HeparinaSigmaH3393-25KU
Cloreto de Magnésio-cristalinoFisher ScientificM33-500500 g
Ácido maleicoSigmaM0375-100g100g
MetanolFisher ScientificA452-44L
Água de grau molecular (sem RNase)VWR7732-18-5500 mL
NaClFisher ScientificS271-33 kg
de pellets de NaOHFisher ScientificS318-500500 g
NBT Substrato em póThermoFisher Scientific340351 g
de soro de cabra normalFisher-Invitrogen31873
VWR82007-202
ParaformaldeídoSigma158127-500g500 g
PBS 10xFisher ScientificBP399-2020L
Proteinase K (200mg/10ml)Qiagen19133Pipetas de plástico de 10 mL
VWR-Samco14670-147
RNAseSigmaR2020-250mL250 mL
Banho-maria agitado 12 LVWR10128-12612 L
Agitador analógico padrãoVWR89032-092
TrisSigma Millipore-OmniPur9210-500GM500 g
tRNA LeveduraFisher-Invitrogen1540101125 mg
Tween 20SigmaP9416-50mL50 mL
Vortex-Genie 2Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc50-728-002
Cloreto de Lítio (LiCl)Sigma-Aldrich203637-10G10 g
Unidade Misturador de nutorações

Referências

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