Aqui, apresentamos um protocolo para realizar um ensaio de cromatina transposase-acessível sequenciando (ATAC-seq) em linfócitos humanos registrados CD4 +. O protocolo foi modificado para minimizar contaminando leituras de DNA mitocondriais de 50% para 3%, através da introdução de um novo buffer de Lise.
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Artigo de método
ATAC-seq ensaio com DNA mitocondrial baixa contaminação de primária humana CD4 linfócitos T
Neste artigo
Resumo
Resumo
ATAC-seq tornou-se uma metodologia amplamente utilizada no estudo da epigenética, devido à sua abordagem rápida e simples de mapear todo o genoma de cromatina acessível. Neste trabalho apresentamos um protocolo melhorado de ATAC-seq que reduz contaminando leituras de DNA mitocondriais. Enquanto o anterior ATAC-seq protocolos têm lutado com uma média de 50%, contaminando o DNA mitocondrial lê, a Lise otimizado introduzido neste protocolo reduz contaminação de DNA mitocondrial de uma média de 3%. Este protocolo ATAC-seq melhorado permite a quase 50% de redução do custo de sequenciamento. Vamos demonstrar como essas bibliotecas de ATAC-seq de alta qualidade podem ser preparadas de linfócitos CD4 + ativados, fornecendo instruções passo a passo do isolamento de linfócitos CD4 + de sangue total através da análise de dados. Este protocolo ATAC-seq melhorado foi validado em uma ampla gama de tipos de células e será de uso imediato para pesquisadores estudando acessibilidade de cromatina.
Introdução
O ensaio para transposase-acessível da cromatina sequenciamento (ATAC-seq) rapidamente se tornou o principal método para interrogar a arquitetura da cromatina. ATAC-seq pode identificar regiões da cromatina acessível através do processo de tagmentation, a fragmentação e marcação de DNA pela mesma enzima, para produzir as bibliotecas com o qual sequenciamento pode determinar a acessibilidade de cromatina através de um genoma inteiro. Este processo de tagmentation é mediado pelo transposase Tn5 hiperativo, o que só corta regiões abertas da cromatina devido nucleosomic estérico. Como corta, o transposase Tn5 insere também adaptadores de sequenciamento que permitem a cons....
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Protocolo
Este protocolo melhorado fornece instruções passo a passo para a realização de ATAC-seq de linfócitos CD4 +, de matérias-primas de sangue total por meio de análise de dados (Figura 1).
1. isolamento de células de CD4 + T do sangue inteiro
Nota: A matéria-prima para este protocolo é de 15 mL de sangue total fresco coletado usando procedimentos padrão, permitindo que a origem da matéria-prima a ser selecionado com base nos requisitos de pesquisa. Escala do protocolo conforme necessário. Pré-aquecer salina tamponada fosfato (PBS) + soro fetal bezerro de 2% (FCS) à tempera....
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Resultados
De 15 mL de sangue total fresco, este protocolo gera uma média de 1 milhão de células de CD4 + T. Estes podem ser congelados para mais tarde processar ou usados imediatamente. Viabilidade das células T CD4 +, frescas ou descongeladas, foi consistentemente > 95%. Este método de isolamento de célula CD4 + T permite flexibilidade no tempo de material e a coleção de origem. Este protocolo ATAC-seq melhorado produz uma biblioteca final de mais de 1 ng / µ l para o sequenciamento. Controle d.......
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Discussão
O protocolo modificado de ATAC-seq apresentado neste artigo fornece resultados reprodutíveis com contaminação mínima de DNA mitocondrial. O protocolo tem sido usado para com êxito caracterizam a arquitetura da cromatina de humano primário PBMCs10, humanos monócitos, células dendríticas de rato (não publicadas), e11linhas de células de melanoma culta. Nós antecipamos essa lise melhorada condição tem o potencial de trabalho para outros tipos de células também. Prevê-se também.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos Atsede Siba para suporte técnico. C.S.C é suportado pelo NIH grant 1R61DA047032.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x PBS, Gibco Estéril | 10010023 | Pode usar outros produtos comparáveis. | |
| 5810/5810 R Balde Oscilante Centrífuga Refrigerada com Baldes de Tubo de 50 mL, 15 mL e 1,5 mL | Eppendorf | 22625501 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| 96 Placa de Fundo Redonda de Poço | Thermo Scientific | 163320 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| Sistema de estação de fita Agilent 4200 | Agilent | G2991AA | Sugerido para avaliação de qualidade. |
| Cryotubes | Thermo Scientific | 374081 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| DMSO | Sigma | D8418 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Invitrogen Life Technologies | 11131D | Componente Crítico |
| Dynabeads Kit de Células T CD4 Humanas Intocadas | Invitrogen Life Technologies | 11346D | Componente Crítico |
| Dynamagnet | Invitrogen Life Technologies | 12321D | Componente Crítico |
| FCS | Gemini Bio Products | 100-500 | Pode usar outros comparáveis Produtos. |
| Kit de DNA de alta sensibilidade | Agilent | 50674626 | Sugerido para avaliação de qualidade. |
| Cloreto de magnésio, hexahidratado, grau de biologia molecular | Sigma | M2393 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| Kit de purificação de PCR MinElute (tampão PB, tampão PE, tampão de eluição) | Qiagen | 28004 | Componente crítico |
| Mr. Frosty | Thermo Scientific | 5100-0001 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| NaCl, Grau de Biologia Molecular | Sigma | S3014 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix | New England BioLabs | M0541 | Componente Crítico |
| Nextera DNA Library Preparation Kit (2x TD Buffer, Tn5 Enzyme) | Illumina | FC1211030 | Critical Component |
| Nuclease Free Sterile dH20 | Gibco | 10977015 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| Polissorbato 20 (Tween20) | Sigma | P9416 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | A25780 | Componente Crítico |
| Precisão Banho de Água | Thermo Scientific | TSGP02 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| Kit de purificação de PCR QIAquick | Qiagen | 28104 | Componente crítico |
| Qubit dsDNA HS Kit de ensaio | Invitrogen Life Technologies | Q32851 | Sugerido para avaliação de qualidade. |
| Qubit FlouroMeter | Invitrogen Life Technologies | Q33226 | Sugerido para avaliação de qualidade. |
| Roseta Sep Densidade Humana CD4+ Medium | Stem Cell Technologies | 15705 | Componente Crítico |
| Roseta Sep Enriquecimento Humano CD4+ Coquetel | Tecnologias de Células-Tronco | 15022 | Componente Crítico |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875093 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| Reservatório Estéril | Thermo Scientific | 8096-11 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| Termociclador T100 com tampa aquecida | BioRad | 1861096 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
| Tris-HCL | Sigma | T5941 | Pode usar outros produtos comparáveis. |
Referências
- Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J.
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Reimpressões e permissões
