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Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar as células dendríticas de murino baços célula magnética classificando e subsequente transferência adotiva em ratos ingênuos. O modelo de células dendríticas ativadas de elevado-sal foi escolhido para explicar os procedimentos passo a passo de transferência adotiva e citometria de fluxo.

Abstract

Excesso de ingestão sal contribui para a inflamação e desempenha um papel vital no desenvolvimento da hipertensão. Encontramos anteriormente que apresentadoras de células dendríticas (DCs) podem sentido elevado de sódio extracelular, levando a formação de isolevuglandin (IsoLG) e a ativação da oxidase NADPH-proteína adutos. Estes IsoLG-proteína adutos reagem com autoproteínas e promover um estado de doença auto-imune e hipertensão. Temos desenvolvido e otimizado o estado-da-arte métodos para estudar a função DC na hipertensão. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento, em vitro tratamento com elevada de sódio e transferência adotiva de murino CD11c esplênica⁺ células em camundongos destinatários para estudar o seu papel na hipertensão.

Introduction

Excesso de sal dietético é um importante factor de risco para hipertensão. ^{1 , 2} the American Heart Association recomenda um máximo de 2.300 miligramas (mg) da ingestão de sódio (Na⁺) por dia, no entanto; menos de 10% da população dos EUA observa esta recomendação. ^{3 , 4} modestas reduções na ingestão de at⁺ baixar a pressão sanguínea e reduzem os anual de novos casos de doença coronariana e acidente vascular cerebral nos Estados Unidos em 20%. ⁵ um grande problema com o consumo de sal em excesso é que 50% da população de hipertensos apresenta sensibilidade ao sal, definida como um aumento de 10 mmHg na pressão de sangue após carregamento at⁺ ou uma queda semelhante na pressão arterial após at⁺ restrição e diurese. ⁶ sal-sensibilidade também ocorre em 25% dos indivíduos normotensos e é um preditor independente de eventos cardiovasculares e morte. ^{7 , 8} mecanismos de detecção sal na hipertensão, envolvendo o rim têm sido bem estudados; no entanto, estudos recentes sugerem que células do sistema imunológico podem sentir nd⁺. ^{9 , 10}

Recentes sugerem que as alterações em extra renal at⁺ manipulação podem causar acúmulo de at⁺ no interstício e promover inflamação. ^{11 , 12} nosso laboratório e outros têm mostrado que as células do sistema imune inato e adaptativo contribuem para a exacerbação da hipertensão. ^{9 , 13 , 14 , 15} vários estímulos de hipertensos, incluindo angiotensina II e norepinefrina causa sal macrófagos, monócitos e linfócitos T para infiltrar o rim e a vasculatura e promover retenção Na⁺ , vasoconstrição, pressão arterial elevação e envolvimento visceral. ^{9 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} em estudos anteriores, verificou-se que o DCs acumulam isolevuglandin (IsoLG)-proteína adutos em resposta aos vários estímulos de hipertensos, incluindo angiotensina II e DOCA-sal hipertensão. ¹⁴ IsoLGs são altamente reativos produtos de peroxidação lipídica que rapidamente e covalentemente aduto de lisinas sobre proteínas e sua acumulação é associada com a ativação de DC. ¹⁴ recentemente estabelecemos que elevado at⁺ é um potente estímulo para IsoLG-proteína aduto formação em murino DCs.⁹ entrada de at⁺ em DCs é mediada através de transportadores sensíveis amilorida. At⁺ é então trocado por cálcio (Ca^{2 +}) através da /nome da CA^{2 +} trocador de at⁺. CA^{2 +} ativa a proteína quinase C (PKC), que ativa a oxidase de NADPH, levando ao aumento superóxido (O₂^{· –}) e IsoLG-proteína aduto de formação. ⁹ transferência adotiva de sal-expostos a DCs hipertensão de números primos em resposta a uma dose de sub pressor da angiotensina II. ⁹

Identificação de CD11c + DCs dos tecidos tem sido anteriormente limitada a imunohistoquímica e RT-PCR e isolamento de DCs tem sido limitado a célula Classificar por citometria de fluxo. Embora a classificação de célula do citometria de fluxo é um método poderoso para o isolamento de células do sistema imunológico, é caro, demorado e leva a um baixo rendimento de células viáveis. Portanto, otimizamos um protocolo passo a passo para a digestão do tecido, estimulação in vitro e transferência adotiva de CD11c⁺ DCs para estudar a hipertensão.

Protocol

Da Universidade de Vanderbilt institucional Cuidado Animal e Comitê de uso aprovado os procedimentos aqui descritos. Os ratos são alojados e cuidados de acordo com o guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (imprensa nacional de academias. Revista 2010). 1. isolamento de baços de ratos Preparar RPMI 1640: 10% FBS, 0,10 mM HEPES, piruvato de sódio 1 mM, 50 µM β-Mercaptoetanol e 1% penicilina/estreptomicina. Eutanásia em 10 – 12 semana-velhos camundongos C57bl/6 do sexo masculino por inalação de CO2 . Pulverize o peito e os lados do rato com etanol a 70%. No lado esquerdo, abra cuidadosamente a pele e cavidade peritoneal para expor o baço. Usando o pequeno fórceps, cautelosamente, mova o intestino e no fígado para o lado esquerdo do mouse e usando a tesoura bem suavemente excisar o baço.Nota: Esta etapa deve ser feita com muita atenção, como danos ao trato gastrointestinal podem induzir a contaminação. Coloque cada baço extirpado em tubo cônico de rotulada de 15 mL contendo 3 mL de meio RPMI 1640. 2. geração de suspensões de célula única de baços Nota: O baço pode ser dissociado em uma suspensão de célula única, combinando a dissociação mecânica além de digestão enzimática. Preparar a solução de digestão do baço, adicionando colagenase D (1 mg/mL; 0,29 U/mg liofilizado) e DNase (0,1 mg/mL) para preparei meio RPMI 1640 (consulte a etapa 1.1) Use fórceps para transferir o baço em um tubo de C (tubo de dissociação) contendo 3 mL de solução de digestão do baço. Execute a dissociação mecânica usando um homogenizador semi-automático de acordo com as instruções do fabricante. Coloque o tubo C sobre o homogenizador semi-automatizadas, garantindo que o tubo C é firmemente colocado no braço rotativo. Uma vez que é colocado no tubo C, pressione o botão iniciar sobre o homogenizador semi-automático para executar o protocolo de baço 04.01 por 60 s.Nota: Dissociação mecânica também pode ser realizada colocando um filtro de μm 40 em cima de um tubo cónico de 50 mL e moagem suavemente o baço através do filtro. Após a moagem o baço, por meio de Lave o filtro de 40 µm com 10 mL de mídia RPMI. Após dissociação mecânica, desconectar o tubo a partir do homogenizador e realizar a digestão enzimática. Incube as amostras por 15 min a 37 ° C sob rotação contínua (20 rpm). Pipetar para um tubo cónico de 50 mL, após a filtragem através de um filtro de 40 µm e traslado a solução. Lave o filtro de 40 µm com 10 mL de PBS de Dulbecco (dPBS). Centrifugar as células a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante completamente e lave a pelota por resuspending em 10 mL de dPBS. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. 3. isolamento de CD11c+ DCs da suspensão de célula única esplênica Ressuspender as células em 5 mL de dPBS e contar o número de células usando um hemocytometer e trypan azul exclusão. Pelotas as células por centrifugação a 300 x g, durante 10 minutos a 4 ° C. Aspire o sobrenadante completamente e resuspenda o pellet em 400 µ l de debuffer magnètica ativado celular-classificação (MACs). Adicione 100 µ l de microbeads CD11c (ver Tabela de materiais) por 1 x 108 células. Levar a suspensão de célula e incubar durante 10 minutos na geladeira a 4 ° C. Adicione 10 mL de tampão de MACs para lavar as células. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Aspirar o sobrenadante completamente e ressuspender em 500 µ l de tampão de MACs. 4. magnética separação de CD11c+ DCs Nota: Separação magnética é feita manualmente com um separador magnético (ver Tabela de materiais) equipado com colunas LS. Separação magnética também pode ser feita automaticamente com um separador magnético automatizado. (ver Tabela de materiais). Coloque a coluna LS no campo magnético do separador de MACs e um tubo cônico de 15 mL em cada coluna para coletar o escoamento. Lave a coluna de LS com 3 mL de tampão. Coloque a suspensão de célula para cada coluna de LS e coletar o escoamento contendo células sem rótulo. Lave a coluna de LS com 3 mL de tampão de MACs, coletando as células sem rótulo que passam. Lave a coluna é 2 vezes mais. Remova a coluna é o separador magnético. Adicionar 5 mL de tampão de MACs para cada coluna e expulsar imediatamente as pilhas etiquetadas magneticamente mergulhando firmemente a coluna de LS em um tubo cónico limpo 15 mL.Nota: É importante realizar um duplo isolamento de células CD11c para obter uma suspensão de células de alta pureza. Portanto, repita os passos 3.1 através de 4.5. e Figura 4 de referência dos padrões de pureza. Este passo melhora a pureza de CD11c+ células de 90 a 95%. Determinar CD11c+ DC número sobre um hemocytometer usando trypan azul exclusão. Dilua a amostra de célula a uma diluição de 1:1 em solução de azul de Tripan 0,4%.Nota: células não viáveis serão manchadas de azuis, enquanto células viáveis permanece imaculadas. Para fazer isso, cuidadosamente preencher um hemocytometer com 10 µ l da diluição da amostra a célula e incubar durante 1 minuto. Contar as células em 4 quadrados de 1 x 1 mm2 na câmara que foi carregada para determinar o número de células viáveis. 5. no tratamento de Sal Vitro alta de CD11c+ DCs Preparar o meio de cultura de DC, adicionando 10% FBS, 0,1 mM HEPES, piruvato de sódio 1 mM, 50 µM β-Mercaptoetanol e 1% penicilina/estreptomicina para 500 mL 1640 RPMI. Prepare-se 10 x DC meios de cultura celular de sal elevado (400 mM) pesando 1,17 g de NaCl e colocando-o em um tubo de Falcão estéril 50 mL. Adicione 50 mL de estéril meios de cultura de células de DC (preparado na etapa 5.1) para o tubo falcon de 50ml e vortex, até que o NaCl em solução. Filtre imediatamente alta sal DC cultura mídia usando vácuo filtragem com filtros de 0.2 μm em uma capa de cultura de células. Centrifugar cada suspensão de células dos baços a 300 x g durante 10 minutos a 4º c. Resuspenda o pellet cada célula em meios de cultura DC em uma concentração de 1 x 106 células/mL. Adicionar 900 μL (aproximadamente 1 x 106 células) de suspensão de DC em um fundo plano 24-bem placa Falcon. Adicione 100 µ l de sal de alta DC meios de cultura a cada poço para uma concentração final de sódio de 190 mM. Rotular a placa e lugar em um 37 ° C úmida incubadora de CO2 por 48 h. 6. adotiva transferência de sal alta tratada CD11c+ DCs Após estimulação in vitro por 48 h, remover a placa da 37 ° C úmida incubadora de CO2 . Pipetar a celular cultura mídia acima e para baixo para Ressuspender o CD11c+ DCs. pipeta todos o CD11c+ DC rotulado de suspensão para um correspondente tubo 1,6 mL. Repita esta etapa para cada indivíduo bem chapeado. Centrifugar cada CD11c+ DC suspensão a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Aspire o sobrenadante. Ressuspender o DC com 100 µ l de dPBS estéril. Suspensão de desenhar DC em uma seringa de 1 mL, equipada com agulha 27G ½ polegada. Coloque os ingênuo 10 semanas C57bl/6 ratos masculinos abaixo dos 2% isoflurano para alcançar um plano cirúrgico estável. Verifique o nível da anestesia com a falta de reflexo de pedal. Uma vez atingido um avião cirúrgico estável, lentamente e com cuidado, introduza a agulha no espaço retrô-orbital em um ângulo de aproximadamente 30°.Nota: O bisel da agulha 27G deve estar apontando para baixo, longe do olho, para evitar danos oculares. Devagar e suavemente injetar o CD11c+ DC suspensão (aproximadamente 1 x 106 células). Uma vez concluída a injeção, remova cuidadosamente a agulha pelo espaço retrô-orbital sendo consciente para não danificar o olho.Nota: Após a injeção, deve haver pouco ou nenhum sangramento. Transferência adotiva de CD11c+ DCs também pode ser realizada usando um método I.V. de injeção (por exemplo, veia da cauda). Os ratos controle recebem CD11c+ DCs que foram cultivadas em meios de sal normais. Retire os ratos o cone do nariz e monitorá-los por aproximadamente 30 min, durante a recuperação da anestesia. 7. preparação de dia 14 baixa dose da angiotensina II (140 ng/kg/min) Prepare o buffer de angiotensina II, adicionando 500 μL de 5 M NaCl e 300 µ l de ácido acético. Quantum Satis (QS) até 30 mL de deionizada H20. Dissolva a angiotensina II de 5 mg/mL de solução tampão de angiotensina II. Dilua a solução-mãe da angiotensina II com tampão adicional para atingir uma concentração final que permita que o minipump osmótica entregará angiotensina II em uma taxa de 140 ng/kg/min de acordo com o peso corporal de cada rato.Nota: Essencial da angiotensina II (mg) = (peso (g) de rato x 0,2 mg / dia x 14 dias) / 1.000Preparado da angiotensina II (mg) = (essencial da angiotensina II x 260 µ l) / bomba taxa (0.25 μL/hr)Angiotensina II estoque Volume (μL) = preparada angiotensina II / estoque concentração (5 mg/mL) x 1,000Diluir o volume (μL) = 270 – volume de ações da angiotensina II Adicionar o volume de ações da angiotensina II para o diluído (tampão de angiotensina II) com base nos volumes calculados na etapa 7.2. Sob uma capa de cultura de células estéreis, abra minipump osmótica. Adicionar solução de diluídos da angiotensina II e expulsar todo o ar da seringa e agulha. Insira a agulha fornecida na parte inferior do minipump osmótica e lentamente injete solução de angiotensina II enquanto lentamente e com cuidado retracção da agulha da bexiga. Insira a osmótica minipump cabeça a bexiga osmótica totalmente, prestando atenção para não entrar ar na bexiga. 8. a implantação de 14 dia baixa dose da angiotensina II Minipumps osmótica Dez dias após transferência adotiva de CD11c+ DCs, lugar de ratos em uma câmara de isoflurano para iniciar a anestesia e em seguida, mova os ratos ao cone de nariz continuamente receber 2% de isoflurano para atingir e manter um plano cirúrgico apropriado. Retire a pele ao longo do lado dorsal do pescoço com tosquiadeiras para preparar o local cirúrgico. Limpe a área depilada com etanol 70%, seguido por betadine 7,5%, antes do início da cirurgia. Crie uma pequena incisão (cerca de 1,5 cm) na pele. Inserir a incisão para criar uma bolsa subcutânea para colocação do minipump osmótica hemostatos. Inserir o minipump para a bolsa subcutânea. Perto da pele ferida com 2-3 grampos cirúrgicos e aplicar outra aplicação de betadine de 7,5% para a ferida e grampos para prevenir a infecção. Monitore os ratos durante 30 a 60 minutos durante a recuperação da anestesia antes de retorná-los para suas gaiolas.Nota: Os ratos precisam ser monitorados até 3-4 dias após a implantação do minipump osmótica. 9. isolamento de baços de destinatários ratos para fluxo Cytometric Analysis Após 14 dias da infusão de baixa dose da angiotensina II, isolar baços de ratos recebendo sal alta in vitro trataram DCs por transferência adotiva. Siga os passos precisos listados acima (etapas 1 e 2). 10. superfície de coloração Transferir splenocytes que são resuspended em 1X PBS em poliestireno tubo FACS e centrifugar 350 x g por 8 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante após a centrifugação. Lave duas vezes com 1 mL de tampão de MACs e centrifugação (350 x g, 8 min, 4 ° C). Divida os splenocytes igualmente em tubos de poliestireno diferentes FACS com base no número de painéis de fluxo cytometric desejado. Para executar a coloracao de viabilidade celular Live/mortos, lave as células com 1X PBS e centrífuga (350 x g, 8 min, 4 ° C). Resuspenda em 1 mL de 1X PBS e adicione 1 µ l de uma viabilidade celular-mancha (veja a tabela de materiais). Incube por 15 min a 4 ° C (geladeira ou no gelo) coberto com papel de alumínio para proteger da luz. Durante a incubação da mancha de viabilidade celular, prepare o coquetel de anticorpos para superfície da célula em um volume adequado de Buffer de MACS. Lavar as células com 1 mL de tampão de MACS, centrifugador (350 x g, 8 min, 4 ° C) e ressuspender cada célula com 100 µ l do anticorpo cocktail. Incube protegido da luz por 30 min a 4 ° C.Nota: Cada anticorpo de citometria de fluxo é único, e é altamente útil e recomendável para determinar a quantidade ideal de anticorpos necessários através da realização de uma curva de titulação de dose para cada anticorpo específico. Lavar as células duas vezes com 1 mL de tampão de MACS e Resuspenda os splenocytes em uma quantidade adequada de Buffer de MACS para análise de fluxo cytometric.

Representative Results

A Figura 1 representa um esquema dos passos descritos acima. Baços murino isolados são classificados para CD11c+ DCs por célula magnético classificação e banhado em mídia sal normal (NS; 150 mmol de NaCl) ou alta mídia sal (HS; 190 mmol de NaCl), por 48 h. CD11c+ DCs enviaram então são transferidos por retrô-orbital injeção de destinatário ratos ingênuos. Dez dias depois, os ratos são implantados com minipumps osmótica p…

Discussion

No actual protocolo, otimizamos os procedimentos para isolar CD11c⁺ DCs de baços de ratos e enviaram transferi-los para animais ingênuo para estudar o papel da DCs na hipertensão induzida por sal. Este protocolo pode ser adaptado para isolar e enviaram transferir outros subconjuntos de células imunes, incluindo macrófagos, monócitos e células do sistema imunológico adaptativas incluindo linfócitos T e B. Otimizamos o processo de digestão esplênica para alcançar a sobrevivência celular adequada e e…

Materials

APC/Cy7 anti-mouse CD11c	Biolegend	117324
autoMACS Running Buffer 	Miltenyi Biotec	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure 	Miltenyi Biotec	130-108-338
Collagenase D	Roche	11088866001
DNase I	Roche	10104159001
DPBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
FcR Blocking Reagent	Miltenyi Biotec	 130-092-575
FITC anti-mouse CD45	Biolegend	103108
GentleMACS C tube	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS dissociator device	Miltenyi Biotec	130-093-235	Use protocol: Spleen 04.01
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Invitrogen	L34964
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
QuadroMACs Seperator 	Miltenyi Biotec	130-090-976
RPMI 1640 medium 	Gibco	11835-030