Aqui nós apresentamos um protocolo para a construção de uma câmara de cultura celular projetada para expor as células de vários tipos de estimulação elétrica e sua utilização no tratamento de células-tronco mesenquimais para realçar a diferenciação osteogênica.
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Artigo de método
Construção e utilização de uma câmara de estimulação elétrica para reforçar a diferenciação osteogênica em células estromais/tronco mesenquimais em Vitro
Neste artigo
Resumo
Resumo
Células tronco mesenquimais/estromal (MSCs) têm sido amplamente utilizadas para promover a consolidação óssea em abordagens de engenharia de tecidos. Estimulação elétrica (EStim) tem demonstrada aumentar a diferenciação osteogênica de MSC in vitro e promover a consolidação óssea em situações clínicas. Aqui descrevemos a construção de uma câmara de cultura de células de EStim... e sua utilização no tratamento de rato osso-medula-derivado MSC para realçar a diferenciação osteogênica. Descobrimos que tratar MSCs com EStim durante 7 dias resulta em um aumento significativo na diferenciação osteogênica, e importante, este efeito pro-osteogênica persiste muito tempo depois (7 dias) EStim é descontinuado. Esta abordagem de pretreating MSCs com EStim para realçar a diferenciação osteogênica poderia ser usada para otimizar os resultados do tratamento de engenharia de tecido ósseo e, assim, ajudá-los a alcançar o seu potencial terapêutico completo. Além desta aplicação, esta câmara de cultura de células de EStim e protocolo também podem ser usados para investigar outros comportamentos de célula EStim-sensíveis, tais como a migração, proliferação, apoptose e acessório do andaime.
Introdução
Um aumento no trauma e/ou defeitos ósseos induzida por doença estão sendo tratados usando diferentes combinações de terapia celular e tecnologias de medicina regenerativa. MSCs são a célula de escolha em tais tratamentos, devido à sua relativamente alta atividade osteogênica, isolamento e expansão de eficiência e segurança1. Para maximizar sua atividade osteogênica e, assim, otimizar sua eficácia terapêutica, foram introduzidos vários métodos para manipular MSCs antes da sua utilização nestes tratamentos (como comentado por Mauney et al.2). Um tal método é EStim, que foi mostrado para aumentar a diferenciação osteogênica....
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Protocolo
1. construção da câmara de cultura de células de estimulação elétrica
- Para construir a câmara EStim, coletar duas tampas das placas de cultura padrão 6-poços de célula; fio de 99,99% de platina, 60 cm de comprimento com um diâmetro de 0,5 a 1 mm; fio de cobre revestido de prata, 70 cm de comprimento com um diâmetro de 0,6 mm; alicate de corte; kit de ferro de soldar; um tubo de cola supercondutor; conector de bloco de terminais de um fio, seis pequenos 2,2 V diodos emissores de luz (opcional); um tubo de adesivo de silicone não corrosivo do revestimento (opcional); um rolo de fita de isolamento eléctrico preto; padrão, flexível, isolado cobre fio elétrico (0....
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Resultados
Para avaliar o efeito de 100 mV/mm de EStim na diferenciação osteogênica do MSCs, células tratadas com EStim para 3, 7 e 14 dias ou folhas (controle) foram analisados no dia 14 de cultivo avaliando alterações morfológicas e deposição de cálcio (Figura 2 ). Isto foi feito por imagem de células usando microscopia de campo claro (alterações de morfologia) ou pela fixação de células em solução de paraformaldeído 4%, manchando-os com solução de vermelho de alizari.......
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Discussão
Aqui descrevemos a construção de uma câmara e um método para o tratamento de células-tronco mesenquimais com EStim que resulta em maior diferenciação osteogênica.
A configuração de EStim apresentada não requer equipamentos especial/conhecimento e pode ser realizada em um laboratório de biologia/bioquímica de células-tronco padrão por pesquisadores Júnior. No entanto, quando compilando e usando a câmara EStim, especial deve ter cuidado em algumas etapas críticas. Ao manusear os eléctrodos de pl.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado em parte por uma concessão de start-up AO Foundation (S-14-03 H) e a Fundação Friedrichsheim (Stiftung Friedrichsheim) com sede em Frankfurt am Main, Alemanha.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Fabricação de Estim | |||
| Conector de banana/adaptador de Jack | Poppstars | 1008554 | 2 partes |
| Alicate de corte | Knipex | 78 03 125 | |
| Fonte de alimentação DC (0-30V/0-3A) | B& K Precision | Modelo 9130B | Qualquer modelo simular pode ser usado |
| Fios flexíveis isolados (0,14 mm2) | Conrad Electronic International | 604794, 604093 | 2 peças |
| Borracha de silicone não corrosiva | Dow Corning | 3140 RTV | *pode ser comprada por muitas lojas |
| Fio de platina (999,5/1000; 1mm ø) | Junker Edelmetalle | 00D-3010 | 0,6 m necessário para 1 câmara Estim |
| Solução de etanol a 70% | qualquer | Esterilização da câmara Estim | |
| Fio de cobre revestido de prata (0,6 mm ø) | Conrad Electronic International | 409334 - 62 | ≈ 70 cm necessários para 1 dispositivo Estim |
| Conjunto de ferro de solda | Conrad Electronic International | 1611410 - 62 | Qualquer modelo simular pode ser usado |
| TPP Tampa de placa de 6 poços | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | 2 tampas para câmara Estim |
| 2.2V LEDs circulares com fio | Conrad Electronic International | 599525 - 62 | 6 peças |
| UHU Super cola | UHU GmbH & Co. KG | n/a | * pode ser comprado por muitas lojas |
| MSC< / forte> | |||
| β-Glicerofosfato sal dissódico hidrato | Sigma-Aldrich | G9422 | cultura de células osteogênicas |
| DMEM, baixa glicose, suplemento GlutaMAX, piruvato | Thermo-Fischer Scientific | 21885025 | cultura de células |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | Thermo-Fischer Cultura | de | células |
| Dexametasona | Sigma-Aldrich | D4902 | cultura de células osteogênicas |
| Soro bovino fetal | Thermo-Fischer Cultura | de células 10500064 | |
| 50 ml Tubo de falcão | Sarstedt | 62.547.004 | cultura de células |
| ácido L-ascórbico | Sigma-Aldrich | A4544 | cultura |
| Penicilina/estreptomicina | Thermo-Fischer Scientific | 15140122 | cultura de células |
| células-tronco mesenquimais de rato Sprague-Dawley (SD), origem da medula óssea | Cyagen | RASMX-01001 | cultura de células |
| Solução de descolamento de células | Thermo-Fischer Scientific | A1110501 | cultura de células, descolamento de células |
| TC Flask, T75 | Sarstedt | 833911302 | cultura de células |
| Placas TPP de 6 poços | Sigma-Aldrich | Z707759-126EA | cultura de células |
| Corante azul de tripano, solução a 0,4% | Bio-Rad | 1450021 | contagem de células |
Referências
- Oryan, A., Kamali, A., Moshiri, A., Baghaban Eslaminejad, M. Role of Mesenchymal Stem Cells in Bone Regenerative Medicine: What Is the Evidence? Cells, Tissues, Organs. 204 (2), 59-83 (2017).
- Mauney, J. R., Volloch, V., Kaplan, D. L.
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Reimpressões e permissões
