Artigo de método

Ensaios foliares destacados para simplificar estudos de expressão gênica em batata durante a infestação por mastigação de insetos Manduca sexta

DOI:

10.3791/59153

⸱

15 de maio de 2019

 ,  ,  , 
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Lab, United States Department of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service (ARS), 2Genetic Improvement for Fruits and Vegetables Lab, USDA-ARS

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método apresentado cria tecido vegetal danificado herbívoro natural através da aplicação de larvas de Manduca sexta a folhas destacadas de batata. O tecido vegetal é analisado para a expressão de seis homólogos do fator de transcrição envolvidos em respostas adiantadas ao herbivory do inseto.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A natureza multitrófica dos estudos de expressão gênica de insetos herbívoros exige um grande número de repetições biológicas, criando a necessidade de protocolos herbívoros mais simples e simplificados. As perturbações dos insetos mastigatórios são geralmente estudadas em sistemas de plantas inteiras. Embora toda essa estratégia de organismo seja popular, não é necessário que observações semelhantes possam ser replicadas em uma única folha destacada. A suposição é que os elementos básicos exigidos para a transdução de sinal estão atuais dentro da folha própria. No caso de eventos precoces na transdução de sinal, as células precisam apenas receber o sinal da perturbação e transmitir esse sinal para as células vizinhas que são ensaiadas para a expressão gênica.

O método proposto simplesmente muda o tempo do destacamento. Em experimentos de plantas inteiras, as larvas são confinadas a uma única folha que é eventualmente separada da planta e ensaiada para a expressão gênica. Se a ordem da excisão é invertida, do último em estudos inteiros da planta, a primeiramente no estudo destacado, o experimento de alimentação é simplificado.

Solanum tuberosum var. Kennebec é propagado por transferência nodal em um meio de cultura simples do tecido e transferido ao solo para um crescimento mais adicional se desejado. As folhas são excisadas da planta-mãe e relocalizadas para placas de Petri onde o ensaio de alimentação é conduzido com os estágios larvares de M. sexta. O tecido foliar danificado é analisado para a expressão de eventos relativamente precoces na transdução de sinal. A análise da expressão gênica identificou fatores de transcrição Cys2-His2 (C2H2) específicos da infestação, confirmando o sucesso do uso de folhas destacadas em estudos de resposta precoce. O método é mais fácil de executar do que as infestações inteiras da planta e usa menos espaço.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herbívoros define em movimento uma série de eventos moleculares durante os quais uma planta pode identificar o ataque e montar uma resposta adequada para a sua sobrevivência. Uma planta recebe duas pistas básicas de insetos mastigadores; um dos danos físicos ao tecido e o outro a partir de substâncias específicas de insetos. Os padrões moleculares associados a danos (DAMPs) são liberados em resposta a danos criados por bocais larvares e desencadeiam uma resposta de ferida bem definida que resulta em um aumento no ácido jasmonico hormonal e na transcrição dos genes de defesa1. Um dos Damps mais conhecidos é systemin, um polipeptídeo que é formad....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Observação: o protocolo a seguir foi projetado para uma pessoa configurar, fazer observações e coletar amostras. Várias execuções da mesma configuração podem ser combinadas para aumentar a replicação biológica. Quaisquer repetições adicionais do experimento devem ser configuradas ao mesmo tempo do dia para eliminar possíveis influências diurnas na expressão gênica. O protocolo é projetado para criar 3 folhas ' infestadas ' para 5 pontos de tempo de colheita separados. As folhas de controle correspondentes para cada ponto de tempo criam um total de 30 amostras. O experimento pode ser realizado com uma variedade de tamanhos foliares e estágios larvares, mas recomenda-se....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O consumo foliar define o sucesso do protocolo. As larvas saudáveis, encenadas exatamente devem começar a alimentar imediatamente depois que a colocação na superfície da folha e a alimentação devem continuar em uma maneira razoavelmente consistente durante todo o tempo da infestação. No vídeo 1, a larva no topo começa a mastigar imediatamente após a colocação e mantém uma taxa consistente durante a alimentação. Isto é especialmente importante se ensaio eventos precoces da.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso de metodologias herbívórias de plantas inteiras existentes é desnecessário para atingir o objetivo deste estudo em particular (ou seja, um conjunto de genes candidatos para sua resposta à infestação). O benefício óbvio do refinamento desanexado da folha é encurtar o tempo que toma para executar ensaios herbivoria. A natureza pesado de plantas inteiras com gaiolas do grampo é eliminada e os ensaios são executados mais logo, desde que as plantas tão novas quanto 2 semanas podem ser usadas para colher folhas. Igualmen.......

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer a Bob Farrar e Alexis Park por fornecer insetos usados neste estudo e por sua expertise em estadiamento larval. Agradecimentos adicionais a Michael Blackburn e Saikat Ghosh para a revisão crítica do manuscrito.

Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é unicamente para fins de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura dos EUA.

USDA é um provedor de oportunidades iguais e empregador.

....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
substituto de ágarG3251PhytoTechnology Laboratories
um vaso de contenção Gelzan (prato de 6,12 ou 24 poços)Fisher Scientific 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51Muitas outras empresas vendem esses produtos
ovos de manduca Carolina Biological Supply Company14388030-50 ovos
manduca ovos Great Lakes HornwormNA50, 100, 250 ou 500 ovos
larvas de manducaCarolina Biological Supply Companypedem pedidos específicos de ínstar larvallarva
de instar manducaLakes chamampara pedidos de ínstar larval específicos pedidos de instarde ínstar
, 1,7 ml Thomas Scientific1158R22estes foram testados em N2 líquido e não explodirão
Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w / VitaminsPhytoTechnology LaboratoriesM519usado para fazer
mistura de ágar nutrienteO produto PhytoTechnology LaboratoriesM5825é Murashige & Skoog Basal Medium com vitaminas, sacarose e
discos de filtro de papelFisher Scientific 09-805ACírculos Whatman-compre para caber em placa de Petri
, placa de Petri, 60X15 mm ou 100X15 mmFisher Scientific FB0875713A ou FB0875712tamanho de compra apropriado para
tubérculos de batata de tamanho de folha qualquertamanho B (não orgânico)sugere Maine Farmer' s Potes de câmbio
, 10" Griffin Greenhouse Supplies, Inc.41PT1000CN2
conservante / biocidaPlant Cell TechnologyNAproduto é PPM (Plant Preservative Mixture)
batatas-semente para fonte de explantequalquertamanho B (não orgânico)sugerem Maine Farmer ' s Troca
de fertilizante de liberação lenta (14-14-14)qualquerNAOsmocote é uma marca popular
pinça de toque suaveBioQuip4750
mistura de soloGriffin Greenhouse Supplies, Inc.O produto 65-51121Sunshine LC1 mix
 PhytoTechnology LaboratoriesC2100Recipiente tipo Magenta, PTL-100 recipiente de
cultura estéril Fisher Scientific ICN2672206produto é MP Biomedicals Plantcon
O produto da é qualquer Great quaisquer tubos de microcentrífuga a do meio de propagação Gelzan é o recipiente de cultura estéril

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H. W., Klessig, D. F. DAMPs, MAMPs, and NAMPS in plant innate immunity. BMC Plant Biology. 16, 1-10 (2016).
  2. Pearce, G., Strydom, D., Johnson, S., Ryan, C. A. A polypeptide from tomato leaves induces wound-inducible proteinase inhibitor proteins. Science.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Infesta o de BatataPropaga o NodalCultura de TecidosEnsaio de Alimenta o em Placa de PetriEstadiamento LarvalIsolamento de RNAFatores de Transcri o C2H2

Artigos relacionados