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Artigo de método

Ensaios foliares destacados para simplificar estudos de expressão gênica em batata durante a infestação por mastigação de insetos Manduca sexta

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DOI:

10.3791/59153

⸱

15 de maio de 2019

 ,  ,  , 
1Invasive Insect Biocontrol and Behavior Lab, United States Department of Agriculture (USDA), Agricultural Research Service (ARS), 2Genetic Improvement for Fruits and Vegetables Lab, USDA-ARS

Neste artigo

Resumo

O método apresentado cria tecido vegetal danificado herbívoro natural através da aplicação de larvas de Manduca sexta a folhas destacadas de batata. O tecido vegetal é analisado para a expressão de seis homólogos do fator de transcrição envolvidos em respostas adiantadas ao herbivory do inseto.

Resumo

A natureza multitrófica dos estudos de expressão gênica de insetos herbívoros exige um grande número de repetições biológicas, criando a necessidade de protocolos herbívoros mais simples e simplificados. As perturbações dos insetos mastigatórios são geralmente estudadas em sistemas de plantas inteiras. Embora toda essa estratégia de organismo seja popular, não é necessário que observações semelhantes possam ser replicadas em uma única folha destacada. A suposição é que os elementos básicos exigidos para a transdução de sinal estão atuais dentro da folha própria. No caso de eventos precoces na transdução de sinal, as células precisam apenas receber o sinal da perturbação e transmitir esse sinal para as células vizinhas que são ensaiadas para a expressão gênica.

O método proposto simplesmente muda o tempo do destacamento. Em experimentos de plantas inteiras, as larvas são confinadas a uma única folha que é eventualmente separada da planta e ensaiada para a expressão gênica. Se a ordem da excisão é invertida, do último em estudos inteiros da planta, a primeiramente no estudo destacado, o experimento de alimentação é simplificado.

Solanum tuberosum var. Kennebec é propagado por transferência nodal em um meio de cultura simples do tecido e transferido ao solo para um crescimento mais adicional se desejado. As folhas são excisadas da planta-mãe e relocalizadas para placas de Petri onde o ensaio de alimentação é conduzido com os estágios larvares de M. sexta. O tecido foliar danificado é analisado para a expressão de eventos relativamente precoces na transdução de sinal. A análise da expressão gênica identificou fatores de transcrição Cys2-His2 (C2H2) específicos da infestação, confirmando o sucesso do uso de folhas destacadas em estudos de resposta precoce. O método é mais fácil de executar do que as infestações inteiras da planta e usa menos espaço.

Introdução

Herbívoros define em movimento uma série de eventos moleculares durante os quais uma planta pode identificar o ataque e montar uma resposta adequada para a sua sobrevivência. Uma planta recebe duas pistas básicas de insetos mastigadores; um dos danos físicos ao tecido e o outro a partir de substâncias específicas de insetos. Os padrões moleculares associados a danos (DAMPs) são liberados em resposta a danos criados por bocais larvares e desencadeiam uma resposta de ferida bem definida que resulta em um aumento no ácido jasmonico hormonal e na transcrição dos genes de defesa1. Um dos Damps mais conhecidos é systemin, um polipeptídeo que é formado pela clivagem da proteína prosystemin maior depois que uma folha é ferida2,3. A resposta da ferida do ácido jasmônico é modulada mais por testes padrões moleculars-associados HERBIVORE (hamps), que podem ser derivados da saliva da lagarta, dos índices do intestino (regurgitant) e das fezes (Frass)4. Os insetos usam essas substâncias para impulsionar ou evadir a resposta de defesa5. Os fatores de transcrição então retransmitem a mensagem dos sinais hormonais na resposta de defesa via regulação dos genes de defesa a jusante6,7,8.

Alguns estudos de interação planta-inseto utilizados em configurações laboratoriais são do tipo simulado, com o objetivo de aproximar o método natural de alimentação pelo inseto. A herbívoria simulada é geralmente realizada através da criação de danos artificiais em tecidos vegetais com várias ferramentas que imitam o mecanismo específico de bocais de insetos suficientes para causar a liberação de DAMPs e desencadear a produção de genes de defesa. Outros componentes específicos do inseto, como secreções orais ou regurgitantes, são freqüentemente adicionados para replicar a contribuição de hamps9,10,11. A criação de um tamanho específico e tipo de ferida e a aplicação de quantidades precisas de HAMPs é uma vantagem para estes tipos de estudos e pode oferecer resultados mais reprodutíveis. Estudos herbívoros naturais, onde o dano ao tecido vegetal é realizado pela aplicação de insetos adquiridos em campo ou de laboratório, são muitas vezes mais desafiadores porque as quantidades de tamanho da ferida e do HAMP são governadas pelo comportamento de insetos e adicionam variabilidade ao Dados. Os métodos naturais versus simulados e suas vantagens e desvantagens são bem debatidos na literatura12,13,14.

Para estudar eventos de sinalização precoce, como fatores de transcrição, uma determinada porcentagem da folha deve ser consumida em um período de tempo relativamente curto, de modo que as larvas devem começar a mastigar imediatamente e manter o consumo até que a folha seja congelada para análise. M. sexta é um alimentador voraz em várias plantas solanáceas durante muitos de seus estágios larval, fazendo o ideal para transmitir dano máximo em uma quantidade relativamente curta de tempo15. Isso é conveniente ao estudar eventos de sinalização precoce, pois a resposta da planta ocorre quase que imediatamente após um inseto contata a superfície foliar16,17. O método comumente usado da gaiola do grampo da contenção prova desajeitado, porque as gaiolas múltiplas exigiriam ajustes contínuos durante todo a experimentação para permitir a remoção ou a adição de larvas. As folhas devem igualmente ser grandes bastante e forte bastante suportar os insetos múltiplos que alimentam ao mesmo tempo. Estes tipos de plantas de batata exigem uma grande quantidade de espaço para observar a alimentação. As larvas frequentemente se realocarão para a parte inferior da superfície foliar, o que também torna as observações de alimentação bastante difíceis. Usar plantas inteiras para executar estes experimentos é claramente complicado.

O estudo atual usa folhas destacadas isoladas em placas de Petri um pouco do que plantas inteiras para simplificar e simplificar a aproximação inteira da planta a estudar o herbivory. A aplicação do protocolo neste estudo limita-se à observação de um grupo de C2H2 fatores de transcrição induzidos precocemente em folhas de batata após lesão herbívora por larvas de M. sexta .

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Protocolo

Observação: o protocolo a seguir foi projetado para uma pessoa configurar, fazer observações e coletar amostras. Várias execuções da mesma configuração podem ser combinadas para aumentar a replicação biológica. Quaisquer repetições adicionais do experimento devem ser configuradas ao mesmo tempo do dia para eliminar possíveis influências diurnas na expressão gênica. O protocolo é projetado para criar 3 folhas ' infestadas ' para 5 pontos de tempo de colheita separados. As folhas de controle correspondentes para cada ponto de tempo criam um total de 30 amostras. O experimento pode ser realizado com uma variedade de tamanhos foliares e estágios larvares, mas recomenda-se que o tamanho das folhas, o estágio larval e o tempo de infestação sejam consistentes ao longo do procedimento.

1. preparação das plantas de batata

Nota: todas as etapas que necessitam de técnica estéril devem ser realizadas em uma capa de cultura tecidual18,19.

  1. Prepare mudas de Kennebec de fonte explante.
    1. Prepare o meio de propagação.
      1. Adicionar 4,43 g de Murashige e Skoog (MS) com vitaminas em pó, 20 g de sacarose e 2 g de substituto de agar a 1 L de osmose reversa (RO)-água purificada num balão de 2 L com uma barra de centrifugação. Transfira o balão para uma placa de agitação e misture. Ajuste o pH para 5,8 usando NaOH enquanto continua a mexer.
        Nota: o agar não se dissolverá até esterilizado.
      2. Adicionar 1 mL de conservante/biocida e autoclave no ciclo líquido durante 20 min (121 ° c, 101,3 kPa). Remova o meio da autoclave imediatamente depois que o ciclo é terminado e esfrie-o a 50 ° c. Transfira 100 mL de meio de propagação estéril e arrefecido para vasos de cultura estéreis (por exemplo, magenta ou Plantcon) usando técnica estéril em uma capa de cultura tecidual.
    2. Prepare o material explante.
      1. Obtenha a fonte do explante como batatas de semente de Kennebec e remova todos os traços do solo lavando com torneira H2O. Retire os rebentos e corte em pedaços de 2 cm com um bisturi estéril.
      2. Esterilizar pedaços de broto por imersão para 15 s em 70% etanol, seguido por 13 min em 1:1 lixívia (1 parte RO-água: 1 parte concentrada germicidal/Bleach grau comercial). Enxague 5 vezes em H2O estéril.
      3. Transfira o material explante para vasos de cultura de tecidos estéreis com meio de propagação em uma capa de cultura tecidual usando técnica estéril. Transfira embarcações a uma câmara da cultura do tecido de planta e cresça para 2 \ u20123 semanas ou até o formulário das plântulas em 24 ° c, luz de 16 h (140 μmol · m-2· s-1)/8 h Photoperiod escuro.
  2. Prepare plantas nodal-propagadas da batata da cultura do tecido.
    1. Prepare o meio de transferência nodal.
      Nota: isso fará 10 vasos de cultura de tecidos que podem ser usados no mesmo dia ou podem ser feitos antes do tempo e armazenados a 4 ° c até transferência nodal.
      1. Adicionar 36,43 g de mistura de ágar nutriente a 1 L de água purificada em RO num balão de 2 L com uma barra de centrifugação. Transfira o balão para uma placa de agitação e misture. Ajuste o pH para 5,8 usando KOH enquanto continua a mexer.
        Nota: o agar não se dissolverá até esterilizado.
      2. Autoclave no ciclo líquido por 20 min (121 ° c, 101,3 kPa). Remova o meio da autoclave imediatamente depois que o ciclo é terminado e esfrie-o a 50 ° c. Transfira 100 mL de meio de transferência nodal de refrigeração estéril para vasos de cultura estéreis (veja a tabela de materiais) usando uma técnica estéril em uma capa de cultura tecidual.
    2. Prepare estacas nodais.
      1. Obter as plântulas de Kennebec cultivadas a partir de material explante (produzido no passo 1.1.2). As plântulas devem ter pelo menos 3 a 4 nós (pontos de ramificação). Retire as folhas usando tesouras estéreis ou bisturi. Corte ramos perto da haste principal, deixando cerca de 2 mm de tecido de ramo.
      2. Remova seções nodais do tronco cortando aproximadamente 2 mm acima e abaixo de cada ponto ou nó de ramificação. Organize estacas nodais em uma embarcação estéril da cultura do tecido que contem o meio de transferência nodal (produzido na etapa 1.2.1.2) na mesma orientação que na embarcação precedente (filial que aponta acima).
      3. Transfira embarcações com estacas nodal a uma câmara da cultura do tecido de planta e cresça para 2 \ u20123 semanas em 24 ° c, luz de 16 h (140 μmol · m-2· s-1)/8 h fotoperíodo escuro.
        Nota: cada corte nodal crescerá em um novo plantlet. O número de estacas em cada embarcação determina o tamanho da folha. Menos estacas transferidas por embarcação resultará em folhas maiores. Três plantas por navio terá 15 mm x 20 mm folhas em 2 \ u20123 semanas.
  3. Opcional Prepare plantas de batata de Kennebec cultivadas no solo.
    Nota: para produzir folhas maiores, as plântulas de batata propagadas nodal podem ser transferidas para o solo.
    1. Transfira plântulas da batata crescidos no meio de transferência nodal ao solo puxando delicadamente a planta do meio até que todo o tecido da raiz esteja liberado do ágar.
    2. Transfira para o solo logo acima do 1º nó das raízes e embale levemente o solo ao redor do transplante. Molhe delicadamente para assegurar o contato do solo com o sistema da raiz.
    3. Coloque em uma câmara de crescimento com 16 h de luz (140 μmol · m-2· s-1)/8 h fotoperíodo escuro e 25/20 ° c temperatura dia/noite.
      Nota: as plantas estão prontas quando as duas folhas totalmente expandidas atingiram o tamanho apropriado para o ensaio.
  4. Opcional Prepare plantas de batata cultivadas com tubérculos.
    Nota: as plantas de batata cultivadas a partir de tubérculos são maiores e mais robustas e podem ser úteis se a criação de larvas em plantas ou se a alimentação larval durante a noite é desejada.
    1. Coloque um tubérculo de batata 6 em profundidade em um 10 em pote contendo mistura de solo suplementado com 10 mL de fertilizante de liberação lenta peletizada.
    2. Coloque em uma câmara de crescimento com 16 h de luz (140 μmol · m-2· s-1)/8 h fotoperíodo escuro e 25/20 ° c temperatura dia/noite. As plantas estão prontas aproximadamente 30 \ u201240 dias do tubérculo que plantam.
      Nota: não use plantas que começaram a florescer.

2. preparação de insetos para alimentação

  1. Obter o estágio larval desejado de M. sexta.
    Nota: larvas para este estudo foram criadas em dieta artificial através do 5º instar20 e encenadas por um indivíduo experiente do insectário em casa. As larvas também podem ser criadas parcialmente ou completamente no tecido vegetal. As larvas não comem imediatamente antes de um Molt e são mais prováveis comer logo após o Molt, assim que a encenação apropriada é21importante.
  2. Transfira larvas para um recipiente de contenção apropriado (por exemplo, 6-, 12-, prato de cultura de tecido de 24 poços), dependendo do tamanho da larva. Deve haver uma larva por poço no prato.
    Nota: as larvas podem exibir comportamento territorial ou canibalístico sem uma fonte de alimento e podem ficar feridas se abrigadas juntas.
  3. Opcional Larvas de fome para até 2 h, pois isso pode melhorar a alimentação larval.
    Nota: as larvas devem estar em um recipiente de contenção armazenado na câmara de crescimento durante este tempo.

3. configuração de componentes para o experimento de infestação

Observação: consulte o resumo esquemático na Figura 1.

  1. Faça modelos de posicionamento para cada ponto de tempo de colheita.
    Nota: é útil configurar 5 bandejas diferentes para cada ponto de tempo de colheita. Isto mantem amostras organizadas e permite que os pratos sejam movidos ao redor mais eficientemente como um jogo sem mudar seu arranjo. Se os cálculos de porcentagem de dano forem realizados, isso é essencial, pois as imagens antes e depois da infestação devem ser capturadas com a mesma distância focal.
    1. Obtenha 5 bandejas resistentes capazes de prender um jogo de seis pratos de Petri apropriadamente feitos medida e alinham com o livro branco.
      Nota: o tamanho do prato de Petri é baseado no tamanho da folha escolhido para o ensaio de alimentação. A folha deve caber facilmente no prato sem tocar os lados. Por exemplo, um prato de 60 mm x 15 mm é adequado para folhas de até 50 mm de comprimento ou largura.
    2. Trace um conjunto de seis círculos usando o prato de Petri apropriadamente dimensionado no papel em cada bandeja. Rotule um conjunto de círculos ' controle ' A, B e C e os outros ' infestados ' A, B e C. Também rotule cada modelo de posicionamento com o tempo de colheita apropriado.
  2. Opcional Configurar uma câmera para ' antes da infestação ' e ' após a infestação ' captura de imagem.
    1. Fixe uma câmera em um suporte na distância focal apropriada para captura de imagem de todos os pratos de Petri no modelo de posicionamento.
  3. Rotule os tubos de ponto de tempo de colheita.
    1. Rotule um conjunto de 30, 1,7 mL de tubos de microcentrífuga correspondentes a cada círculo no modelo de posicionamento. Rotule os tubos para identificar adequadamente a perturbação (controle/infestada), a letra de replicação da planta (a, B ou C) e o ponto de tempo de colheita (número de minutos após o período de infestação).
  4. Prepare os pratos de Petri escolhidos na etapa 3.1.1.
    1. Coloque um disco de papel de filtro estéril em cada um dos 30 pratos de Petri do passo 3.1.1. Adicione água estéril para umedecer os discos; Não permitir que o excesso de água para a piscina no prato. Coloque cada prato em cada um dos seis círculos em cada modelo de posicionamento.
    2. Posicione três plantas de batata ao lado de cada modelo de colocação. Assegure-se de que as plantas estejam toda a mesma idade e tamanho relativo.

4. realizando a infestação

Nota: um modelo de ponto/colocação de tempo de colheita é configurado de cada vez.

  1. Retire as duas folhas de cada planta com uma tesoura estéril e coloque uma folha no prato de Petri de controle e uma na placa de Petri infestada para cada planta (A, B e C). Realize este processo o mais rápido possível.
  2. Opcional Transfira o modelo de posicionamento para o suporte da câmera para capturar uma imagem "antes da infestação".
  3. Transfira as larvas para cada prato infestado usando o fórceps macio do toque o mais rapidamente possível. Ajuste o temporizador para o tempo desejado da "infestação".
    Nota: o período de tempo em que as larvas estão consumindo o tecido foliar é o "tempo de infestação". Isso é algo que pode ser determinado empiricamente usando algumas folhas/larvas de teste antes do início da infestação real. O ' tempo de infestação ' escolhido deve ser consistente para todas as folhas infestadas.
    Nota: as larvas devem ser tratadas com cuidado por pinça de toque suave. 2º a 4º instar pode ser agarrado suavemente pelo seu chifre ou midsection.
  4. Observe a alimentação para certificar-se de todas as larvas estão comendo. As larvas devem ser adicionadas/removidas com base no comportamento alimentar. Mantenha as tampas nos pratos de Petri tanto quanto possível.
    Nota: larvas múltiplas podem ser usadas por folha.
  5. Retire as larvas das folhas no final do tempo de infestação. Inicie o temporizador para o tempo de colheita.
  6. Opcional Transfira o modelo de posicionamento para o suporte da câmera para capturar a imagem "após a infestação".
    Nota: todas as seis folhas no modelo de colocação são colhidas no tempo de colheita específico.

5. colheita de folhas

  1. Transfira cada folha para o tubo rotulado correspondente no final de cada ponto de tempo de colheita e congelar imediatamente, soltando o tubo no líquido N2. Armazene o tecido vegetal colhido a-80 ° c até o isolamento do RNA.
  2. Repita as etapas 4 \ u 20125.1 para cada ponto de tempo de colheita.

6. processamento de tecido foliar para análise da expressão gênica

  1. Moer o tecido da folha congelada para um pó com um micropilão.
  2. Isole o RNA e o processo totais para a expressão de gene como descrito previamente22.

7. (opcional) estimativa de danos foliares

  1. Estimar visualmente por cento do dano foliar ou calcular a área foliar nas imagens antes e depois da infestação.
  2. Medir a área foliar com ferramentas de software (por exemplo, Phenophyte)23.
  3. A partir das medições da área foliar, calcule a percentagem de danos
    % Damage = [(área foliar antes – área foliar depois)/área da folha antes] x 100.

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Resultados

O consumo foliar define o sucesso do protocolo. As larvas saudáveis, encenadas exatamente devem começar a alimentar imediatamente depois que a colocação na superfície da folha e a alimentação devem continuar em uma maneira razoavelmente consistente durante todo o tempo da infestação. No vídeo 1, a larva no topo começa a mastigar imediatamente após a colocação e mantém uma taxa consistente durante a alimentação. Isto é especialmente importante se ensaio eventos precoces da...

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Discussão

O uso de metodologias herbívórias de plantas inteiras existentes é desnecessário para atingir o objetivo deste estudo em particular (ou seja, um conjunto de genes candidatos para sua resposta à infestação). O benefício óbvio do refinamento desanexado da folha é encurtar o tempo que toma para executar ensaios herbivoria. A natureza pesado de plantas inteiras com gaiolas do grampo é eliminada e os ensaios são executados mais logo, desde que as plantas tão novas quanto 2 semanas podem ser usadas para colher folhas. Igualmen...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Bob Farrar e Alexis Park por fornecer insetos usados neste estudo e por sua expertise em estadiamento larval. Agradecimentos adicionais a Michael Blackburn e Saikat Ghosh para a revisão crítica do manuscrito.

Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é unicamente para fins de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso pelo departamento de agricultura dos EUA.

USDA é um provedor de oportunidades iguais e empregador.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
substituto de ágarG3251PhytoTechnology Laboratories
um vaso de contenção Gelzan (prato de 6,12 ou 24 poços)Fisher Scientific 08-772-49, 08-772-50, 08-72-51Muitas outras empresas vendem esses produtos
ovos de manduca Carolina Biological Supply Company14388030-50 ovos
manduca ovos Great Lakes HornwormNA50, 100, 250 ou 500 ovos
larvas de manducaCarolina Biological Supply Companypedem pedidos específicos de ínstar larvallarva
de instar manducaLakes chamampara pedidos de ínstar larval específicos pedidos de instarde ínstar
, 1,7 ml Thomas Scientific1158R22estes foram testados em N2 líquido e não explodirão
Murashige & Skoog (MS) Basal Medium w / VitaminsPhytoTechnology LaboratoriesM519usado para fazer
mistura de ágar nutrienteO produto PhytoTechnology LaboratoriesM5825é Murashige & Skoog Basal Medium com vitaminas, sacarose e
discos de filtro de papelFisher Scientific 09-805ACírculos Whatman-compre para caber em placa de Petri
, placa de Petri, 60X15 mm ou 100X15 mmFisher Scientific FB0875713A ou FB0875712tamanho de compra apropriado para
tubérculos de batata de tamanho de folha qualquertamanho B (não orgânico)sugere Maine Farmer' s Potes de câmbio
, 10" Griffin Greenhouse Supplies, Inc.41PT1000CN2
conservante / biocidaPlant Cell TechnologyNAproduto é PPM (Plant Preservative Mixture)
batatas-semente para fonte de explantequalquertamanho B (não orgânico)sugerem Maine Farmer ' s Troca
de fertilizante de liberação lenta (14-14-14)qualquerNAOsmocote é uma marca popular
pinça de toque suaveBioQuip4750
mistura de soloGriffin Greenhouse Supplies, Inc.O produto 65-51121Sunshine LC1 mix
 PhytoTechnology LaboratoriesC2100Recipiente tipo Magenta, PTL-100 recipiente de
cultura estéril Fisher Scientific ICN2672206produto é MP Biomedicals Plantcon
O produto da é qualquer Great quaisquer tubos de microcentrífuga a do meio de propagação Gelzan é o recipiente de cultura estéril

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