Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

Resumo

Descrevemos um modelo de imunização in vivo, hepatite translacional em camundongos BALB/c que pode ser utilizado para estudar a patogênese da hepatite autoimune induzida por drogas, incluindo diferenças sexuais observadas nesta doença. Descreveremos como este modelo demonstra análises reprodutíveis utilizando técnicas experimentais in vivo e in vitro.

Resumo

A hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é o processo de hipersensibilidade induzida por medicamentos hepáticos mais comum observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatite autoimune. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres. Os mecanismos subjacentes dessas diferenças sexuais na prevalência não são claros devido à escassez de modelos animais que imitam doenças humanas. Mesmo assim, acredita-se que os mecanismos subjacentes estejam amplamente associados a haplotipos de antígenos leucócitos humanos e hormônios sexuais. Em contraste, usando um modelo de rato DIH, descobrimos que as células CD4+ T iniciadas il-4 contra um epítope de citocromo P450 2E1 induz o fluxo de neutrófilos, macrófagos e células de mastro nos fígados de camundongos BALB/c fêmeas. Usando este modelo, também mostramos que as células T induzidas pelo IL-33+regulamente conferem proteção contra DIH em camundongos femininos e masculinos. Este modelo DIH é induzido pela imunização de camundongos com um epítope de CYP2E1 que foi alterado covalentemente com um metabólito de droga que tem sido associado com DIH. Este epítope é reconhecido por pacientes com DIH. Nosso método induz hepatites robustas e reprodutíveis e autoanticorpos que podem ser utilizados para estudar a patogênese do DIH. Enquanto estudos in vivo podem causar dor e angústia indevidas em camundongos quando feitos de forma inadequada, a vantagem de um modelo in vivo é a capacidade de avaliar a patogênese da doença em um grande número de camundongos. Além disso, os efeitos biológicos das proteínas hepáticas alteradas podem ser estudados por meio de procedimentos invasivos. A adição de estudos in vitro ao projeto experimental permite repetição rápida e análise mecanicista a nível celular. Assim, demonstraremos nosso protocolo de modelo e como ele pode ser utilizado para estudar mecanismos in vivo e in vitro de DIH.

Introdução

O objetivo deste método é descrever um modelo de camundongo de hepatite autoimune induzida por drogas que se desenvolve in vivo e demonstrar como ela pode ser utilizada para investigar a base molecular, imunológica e genética desta doença. O objetivo de longo prazo de nossos estudos é descobrir mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de inflamação hepática crônica e lesão, estudando DIH em pacientes suscetíveis. A doença hepática e a cirrose constituem a sexta causa de morte mais comum em adultos entre 25 e 64 anos. DILI idiossincrática, às vezes referida como hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é a terceira causa mais comum de insuficiência hepática agu....

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pela comissão de cuidados e uso de animais.

1. Trifluoroacetilação de proteínas citosocidas hepáticas S-100 ou um epítope CYP2E1

NOTA: Primeiro, prepare o trifluoroacetilado S100 (TFA-S100) e o epítope CYP2E1 trifluoroatilado (TFA-JHDN5). Como as proteínas S100 síndicas são necessárias para imunizações, e os camundongos BALB/c são necessários para produzir o imunogênio. A preparação produz uma grande quantidade de imunogênio; então, antecipar a realização desta porção cerca de quatro vezes por ano. Um método idêntico será usado para fazer o TFA-JHDN5. O epítope CYP2E1 (JHDN5),....

Resultados

O calendário de vacinação utilizado para induzir o DIH apresentado na Figura 1 representa as duas imunizações necessárias na base do pescoço (dia 0) e a base da cauda (dia 7). A Figura 2 mostra dados representativos de proliferação obtidos no dia 14 utilizando CFSE em resposta ao CYP2E1, JHDN5, o epítope CYP2E1 e o metabólito trifluoroacetil (TFA) dos anestésicos. A Figura 3 mostra a estratégia de gating e a análise representativa d.......

Discussão

A força deste protocolo repousa em sua reprodutibilidade; por isso, é fundamental aderir às etapas sugeridas. A formulação do imunogênio pode ser uma barreira para alguns; no entanto, reproduzimos nosso modelo usando o epítope descrito em nosso documento, que remove a necessidade de isolar a fração S100 do fígado. É provável que epítopos adicionais ou proteínas possam ser alterados e induzir hepatite após as imunizações; no entanto, descrevemos essas proteínas que usamos com resultados confiáveis. Várias proteínas foram .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
0,1% 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico ácido (TNBS)	ThermoFisher	28997
AKP Kit de Substrato	BioRad	172-1063
Camundongos BALB/c	Jackson
CellTrace™ Kit de Proliferação Celular CFSE	ThermoFisher	C34554
CFA H37Ra	Becton Dickinson (Difco Bacto)	231131
Reagente bloqueador FcR	Milteyi	130-092-575
Suplemento geral	ThermoFisher	HPRG770
HepaRG™ células criopreservadas	ThermoFisher	HPR GC10
Vivo/Morto Fixável Kit de manchas Aqua Dead Cell	ThermoFisher	L34965
NaHC03	Millipore Sigma	S5761
Percoll®	Millipore Sigma	P1644-1L
Lista de Toxinas Convulsas	Biologicals	180
Tamponamento de Fosfato Salino pH 7.4	Vários
Pierce™ Mini Comprimidos de Inibidor de Protease, Livre de EDTA	ThermoFisher	88666
Hidróxido de Potássio	JT Baker	3140-01
S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA)	Millipore Sigma	177474
Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml)	ThermoFisher	66810
UltraPure™ Solução SDS, 10%	ThermoFisher	24730020
Williams Media E, sem vermelho de fenol	ThermoFisher	A1217601

de diálise