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Artigo de método

Indução de Hepatite Autoimune Induzida por Drogas em CAMUNDONGOS BALB/c para o Estudo de Seus Mecanismos Patogênicos

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DOI:

10.3791/59174

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29 de maio de 2020

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1Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine, Johns Hopkins University, 2Department of Pediatrics and Pathology, Johns Hopkins University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um modelo de imunização in vivo, hepatite translacional em camundongos BALB/c que pode ser utilizado para estudar a patogênese da hepatite autoimune induzida por drogas, incluindo diferenças sexuais observadas nesta doença. Descreveremos como este modelo demonstra análises reprodutíveis utilizando técnicas experimentais in vivo e in vitro.

Resumo

A hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é o processo de hipersensibilidade induzida por medicamentos hepáticos mais comum observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatite autoimune. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres. Os mecanismos subjacentes dessas diferenças sexuais na prevalência não são claros devido à escassez de modelos animais que imitam doenças humanas. Mesmo assim, acredita-se que os mecanismos subjacentes estejam amplamente associados a haplotipos de antígenos leucócitos humanos e hormônios sexuais. Em contraste, usando um modelo de rato DIH, descobrimos que as células CD4+ T iniciadas il-4 contra um epítope de citocromo P450 2E1 induz o fluxo de neutrófilos, macrófagos e células de mastro nos fígados de camundongos BALB/c fêmeas. Usando este modelo, também mostramos que as células T induzidas pelo IL-33+regulamente conferem proteção contra DIH em camundongos femininos e masculinos. Este modelo DIH é induzido pela imunização de camundongos com um epítope de CYP2E1 que foi alterado covalentemente com um metabólito de droga que tem sido associado com DIH. Este epítope é reconhecido por pacientes com DIH. Nosso método induz hepatites robustas e reprodutíveis e autoanticorpos que podem ser utilizados para estudar a patogênese do DIH. Enquanto estudos in vivo podem causar dor e angústia indevidas em camundongos quando feitos de forma inadequada, a vantagem de um modelo in vivo é a capacidade de avaliar a patogênese da doença em um grande número de camundongos. Além disso, os efeitos biológicos das proteínas hepáticas alteradas podem ser estudados por meio de procedimentos invasivos. A adição de estudos in vitro ao projeto experimental permite repetição rápida e análise mecanicista a nível celular. Assim, demonstraremos nosso protocolo de modelo e como ele pode ser utilizado para estudar mecanismos in vivo e in vitro de DIH.

Introdução

O objetivo deste método é descrever um modelo de camundongo de hepatite autoimune induzida por drogas que se desenvolve in vivo e demonstrar como ela pode ser utilizada para investigar a base molecular, imunológica e genética desta doença. O objetivo de longo prazo de nossos estudos é descobrir mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento de inflamação hepática crônica e lesão, estudando DIH em pacientes suscetíveis. A doença hepática e a cirrose constituem a sexta causa de morte mais comum em adultos entre 25 e 64 anos. DILI idiossincrática, às vezes referida como hepatite autoimune induzida por drogas (DIH) é a terceira causa mais comum de insuficiência hepática aguda nos Estados Unidos. DIH é o processo de hipersensibilidade hepática mais comum, observado em aproximadamente 9 a 12% dos pacientes com hepatiteautoimune 1. A maioria esmagadora dos pacientes com DIH são mulheres 2,3,4. Um tipo de DIH desenvolve-se em indivíduos suscetíveis após a administração de anestésicos voláteis halogenados, como isoflurano, sevoflurano, desflurano ou halotano. Esses anestésicos se ligam covalentemente a proteínas hepáticas com produtos reativos de seu metabolismo, criando assim novos autoantigens capazes de provocar respostas alérgicas ou autoimunes5.

O estudo de mecanismos patogênicos envolvidos no desenvolvimento de anestésicos e qualquer forma de DIH tem sido previamente dificultado pela falta de um modelo animal que imita de perto a indução da doença humana. Desenvolvemos um modelo experimental de murina de DIH com características semelhantes à DILI mediada imunológica em pacientes. A hepatite é induzida pela imunização com um dos dois autoantígenos que foram covalentemente modificados pelo metabólito de cloreto de trifluoroacetil (TFA) que é formado seguindo o metabolismo oxidativo do anestésico pelo citocromo enzimático P450 2E1 (CYP2E1)5. Um autoantígeno é a fração hepática cística cística hepótica S100, que é uma mistura de várias proteínas6, e o segundo autoantígeno é um epítope de CYP2E1 que é reconhecido por soro de pacientes com DILI7 anestésico imuno mediado. Ao usar camundongos BALB/c, que são relativamente resistentes à hepatite autoimune experimental, distinguemos nosso modelo do modelo de imunização induzido pelo S100 de hepatite autoimune em camundongos C57Bl/6J8.

Devido às suas diversas apresentações clínicas, o DIH é difícil de estudar em pacientes. Modelos experimentais translacionais oferecem a capacidade de avaliar a patogênese da doença in vivo e in vitro. Atualmente, não existem outros métodos alternativos para induzir DIH que examinem totalmente as respostas imunes in vivo ou in vitro adaptativas ou inatas sem o uso de animais. Além disso, como a trifluoroacetilação do S-100 ou do epítope CYP2E1 não parece produzir um imunogênio irritante, e estamos induzindo o DIH pela imunização com proteínas alteradas pelo TFA, esses animais não receberão éter, qualquer anestésico halogenado, barbiturado ou álcool antes da imunização ou outros procedimentos, considerando que esses agentes podem alterar os parâmetros que estamos estudando. Mesmo assim, diminuímos o uso do nosso mouse utilizando simulação de computador para confirmar as preferências vinculantes do nosso epítope CYP2E1descoberto 9 e espelhamos o DIH humano implicando sexo feminino, demonstrando que ratos BALB/c fêmeas desenvolvem um DIH10 mais severo.

Apesar das diversas apresentações de DIH em pacientes e desafios no estudo da doença clínica, a modificação pós-translacional de proteínas nativas por metabólitos reativas é um mecanismo-chave aceito na patogênese DIH que segue anestésicos halogenados11. Os investigadores também aceitam que o CYP2E1 é um grande autoantígeno neste processo12,13. O papel das células CD4+T regulamentadas (IL)-4-upregulated que reconhecem um CYP2E1 pós-translacionada e outras proteínas hepáticas é um iniciador aceito de DIH anestésico, atraindo neutrófilos, eosinófilos e células de mastro para o fígado14, e este mecanismo foi confirmado em muitas formas de DIH15,16. As células CD4+CD25+T (Tregs) induzidas a expressar o FoxP3 reduzem a gravidade do DIH, e deficiências relativas dessas células no baço pioram o DIH 10,7. Assim, a maioria dos avanços na compreensão do DIH têm sido possíveis utilizando modelos de camundongos in vivo para avaliar os mecanismos genéticos, metabólicos e imunológicos do DIH tanto in vivo quanto in vitro.

Como nós e outros investigadores descobrimos papéis para IL-4, neutrófilos e eosinófilos no início do DIH usando diferentes modelos de camundongos, acreditamos que esta observação suporta nossa alegação de que, independentemente do modelo DIH utilizado, hepatite e lesão são induzidas pelo IL-4. A força do nosso protocolo está na utilização da metodologia in vivo, tanto de camundongos masculinos quanto femininos, e na repetição da histologia, ensaios de proliferação de células T CD4+ e citocinas. A força do nosso uso de estudos in vitro é que eles reduzem o número de camundongos necessários, fornecendo a metodologia para isolar as interações celulares que impulsionam o DIH. Recomendamos o uso de camundongos masculinos e femininos, pois isso reduz a possibilidade de viés inconsciente na interpretação dos resultados e fortalece o potencial de tradução de nossos estudos, uma vez que a incidência, prevalência e gravidade do DIH é maior em mulheresde 17 anos. Recomendamos que os camundongos sejam obtidos de um único fornecedor; no entanto, se isso não for possível, obtenha controles de erva-mate ou camundongos do mesmo tipo de fornecedor que os camundongos geneticamente alterados.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pela comissão de cuidados e uso de animais.

1. Trifluoroacetilação de proteínas citosocidas hepáticas S-100 ou um epítope CYP2E1

NOTA: Primeiro, prepare o trifluoroacetilado S100 (TFA-S100) e o epítope CYP2E1 trifluoroatilado (TFA-JHDN5). Como as proteínas S100 síndicas são necessárias para imunizações, e os camundongos BALB/c são necessários para produzir o imunogênio. A preparação produz uma grande quantidade de imunogênio; então, antecipar a realização desta porção cerca de quatro vezes por ano. Um método idêntico será usado para fazer o TFA-JHDN5. O epítope CYP2E1 (JHDN5), GII/ FNN/ GPT/ WKD/ IRR/ FSL/ TTL, pode ser sequenciado ou adquirido.

  1. Isolamento da fração S100 do fígado.
    1. Após a sedação de 5 – 10 camundongos BALB/c com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4 - 6 mg/kg de xilazina, confirme a profundidade adequada da anestesia observando uma redução do tônus muscular e nenhuma resposta a estímulos dolorosos, como uma pitada de dedo do dedo (reflexo de retirada), além da perda de reflexos de retardo e da perda de reflexos palpebrais.
    2. Usando uma tesoura microcirúrgica, exponha o conteúdo intra-abdominal usando uma incisão midline e faça um pequeno corte na veia cava inferior para remover o sangue.
    3. Coloque um angiocateter de 24 bitolas na veia portal e perfunde o fígado 10 mL/min com 40 mL de salina tamponada de fosfato (PBS) pH 7.4 em um banho de água a 4 °C. Remova e pese os fígados agrupados e corte-os em pequenos pedaços (10 – 15 mm).
      NOTA: A eutanásia é induzida pela injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxação cervical e abertura da cavidade torácica para colapsar os pulmões. Este método proporciona o menor desconforto e dor aos animais. Este método é consistente com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.
    4. Adicione 4 vezes o peso da sacarose (250 mM) -TRIS (10 mM)- Tampão de homogeneização EDTA (1 mM) (pH 7.4) complementado com comprimidos completos do inibidor de Protease (ver Tabela de Materiais) conforme recomendações dos fabricantes. Homogeneize-se em um tubo de polipropileno de 15 mL, utilizando um homogeneizador geral de tecido laboratorial em velocidade média no gelo até ficar homogêneo. Homogeneize-se no gelo para evitar que o tecido fique quente durante a homogeneização.
    5. Centrifugar o fígado homogeneiza a 1500 x g por 10 min e, em seguida, despeje o supernante. Centrifugar o supernante por 1 h a 100.000 x g. Encaixe o supernatante e armazene a -80 °C. O supernatante é o Csoúsico S-100.
  2. Trifluoroacetilação de S100 e JHDN5
    NOTA: A trifluoroacetilação dos grupos ε-amino de resíduos de liseina da S-100 será realizada de acordo com o procedimento de Satoh18. Todas as partes deste experimento, com exceção dos últimos dias de diálise, são realizadas no capô da fumaça.
    1. Determine a concentração proteica total do S-100 citosóico utilizando o ensaio de ácido bicinchonínico (ensaio BCA)7. Diluir 20 mgs de rato BALB/c S100 ou JHDN5 a 10 mL com dH2O em um frasco de 70 mL Erlenmeyer. Ajuste o pH para 10 com 1N KOH.
    2. Adicione 4,7 mmole de S-ethyltrifluorothioacetato (S-ETFA), à solução. Mantenha o pH entre 9,9 e 10,0 com KOH 1N administrando KOH na moda gotícula por aproximadamente 1 h. Registo o volume total de KOH para cada reação.
    3. Transfira as soluções para fitas diálise separadas (Não enchimento demais). Dique as fitas por 72 h contra 4 L de dH2O com três mudanças por dia. Após a diálise, grave o volume final de TFA-S100 ou TFA-JHDN5 e, em seguida, aliquot em tubos rotulados. Encaixe o congelamento e armazene a -80 °C.
    4. Uma concentração estimada é determinada dividindo a quantidade inicial de S100 ou JHDN5 (em mg) pelo volume final após a diálise (mL). Para determinar a modificação percentual da proteína nativa19, diluir 1,0 mg de cada proteína nativa e alterada tfa (se a concentração final for superior a 1,0 mg) a 1,0 mL com dH2O em tubos de bala separados e preparar um branco usando 1,0 mL dH2O. Se a concentração da proteína alterada pelo TFA for inferior a 1,0 mg, não dilua
      1. Para separar os poços de uma placa de 96 poços, adicione 50 μL das proteínas em branco, nativas e alteradas. Adicione 50 μL de 4% NaHCO3 seguido por 50 μL de 0,1% 2,4,6-trinitrobenzeno ácido sulfônico a cada poço.
      2. Incubar a placa a 40 °C por 2 h. Após a incubação, adicione 50 μL de 10 % SDS a cada poço seguido por 25 μL de 1N HCl.
      3. Leia em OD de 334 nm e, em seguida, registo absorvente de cada composto de 200 a 600 nm, a fim de confirmar a queda característica na absorvância a 334 nm. Calcule a modificação percentual dos resíduos de lise por TFA, utilizando a seguinte fórmula:
        figure-protocol-1

2. Imunização de camundongos para induzir hepatite

NOTA: O DIH é modelado em camundongos BALB/c por meio de imunizações com proteínas citosóicas hepáticas que foram alteradas covalentemente por cloreto de trifluoracetil (TFA), um modelo de metabólito de drogas, TFA-S1006 ou um epítope de CYP2E1 covalentamente alterado por TFA9, TFA-JHDN5 que induz hepatite, células T autorativas e autoanticorpos CYP2E1. Os camundongos exibem uma fase de ativação esplênica 2 semanas após a imunização inicial e uma fase hepática por 3 semanas que é caracterizada por inflamação granulócítica. Camundongos BALB/c fêmeas são mais suscetíveis do que os machos à hepatite neste modelo.

  1. No dia 0, imunizar camundongos BALB/c de 6 a 8 semanas subcutâneos na base do pescoço com 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 emulsificadas em volumes iguais de adjuvante completo de Freund (CFA). No dia 0, imunizar os camundongos com 50 ng de toxina de coqueluche, intramuscularmente em uma das patas traseiras. No dia 7, imunizar os camundongos subcutâneamente na base da cauda com 200 μg de TFA-S100 ou 100 μg de TFA-JHDN5 emulsionados em volumes iguais de CFA para garantir que cada rato receba duas injeções do mesmo imunogênio.
    NOTA: Os camundongos são monitorados de hora em hora durante as primeiras 6 horas após a imunização e, em seguida, pelo menos duas vezes por dia durante uma semana. Se os camundongos demonstrarem sinais de dor ou angústia, como postura curvada ou peles de babados, os analgésicos devem ser administrados de acordo com a ACUC local. Se for observado dor ou angústia significativas, os camundongos devem ser avaliados por um veterinário para determinar se a eutanásia é necessária.
  2. Determinação de respostas imunes de células T CD4+ a auto-proteínas inteiras, epítopos de auto-proteínas ou o hapten TFA usando citometria de fluxo
    1. Após a sedação de camundongos com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com xilazina de 4-6 mg/kg via injeção intraperitoneal, confirme a profundidade adequada da anestesia conforme descrito na etapa 1.1.1 e depois identifique o baço após expor a cavidade intra-abdominal usando tesoura microcirúrgica. Corte o baço no pedículo e coloque em uma placa de Petri com soro de bezerro fetal PBS/2% (FCS).
      NOTA: A eutanásia será induzida nos camundongos por injeção intraperitoneal de cetamina/xilazina adicional (80 mg/kg: 8 mg/kg), seguida de luxação cervical e abertura da cavidade torácica para colapsar os pulmões. Este método proporciona o menor desconforto e dor aos animais. Este método é consistente com as recomendações do Painel de Eutanásia da Associação Médica Veterinária Americana.
    2. Solte as células usando lâminas de vidro foscos e transfira para um tubo de polipropileno cônico de 50 mL. Lave com PBS/2% FCS, elevando o volume para 50 mL e centrifugando a 335 x g usando uma centrífuga refrigerada no banco. Despeje o supernatante e repita este passo.
    3. Remova as células vermelhas usando 1 mL de tampão de lysing ACK por 1 min e traga volume de até 50 mL com PBS/2% FCS. Centrifugar a 335 x g e despeje o supernatante.
    4. Conte as células. Rotule as células com CFSE por 30 minutos no gelo no escuro, de acordo com as instruções do fabricante. Suspender suspensões de célula única em 6 placas de poço de 3x106 células/mL por poço em PBS/2% FCS.
    5. Estimule as células rotuladas com CYP2E1, JHDN5 ou TFA-OVA (10 μg/mL) por 72 h a 37 °C em 5% DE CO2, 95% de ar (umidificado). Após a incubação, colorigue as células com CD4-APC (1:100) por 30 minutos no gelo e analise por citometria de fluxo dentro de 3 dias.
    6. Utilize a seguinte estratégia de gating para identificar células CD4+CFSE+: as células CD4+CFSE+serão identificadas a partir das células vivas fechadas e exibidas como histogramas de células proliferando.
  3. Isolamento de células imunes infiltradas de camundongos imunizados.
    1. Para isolar as células imunes infiltradas nos fígados no dia 14 ou dia 21, anestesiar os camundongos por injeção intraperitoneal com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4-6 mg/kg de xilazina e confirmar a profundidade adequada da anestesia como descrito na etapa 1.1.1. Após laparotomia usando uma incisão midline feita com uma tesoura micro cirúrgica, como descrito em 1.1.2, cannulate a veia portal com uma agulha de calibre 25 e, em seguida, corte a cava vena inferior abaixo das veias renais.
    2. Perfunda cada fígado a uma taxa de fluxo de 10 mL/min com 40 mL de PBS em um banho de água 37 °C. Após a perfusão, usando uma tesoura micro cirúrgica, corte o fígado no pediculo hepático, remova a vesícula biliar e corte o fígado no hilum.
    3. Interrompa o fígado em uma peneira de aço inoxidável de malha usando um pilão de seringa estéril de 20 mL e PBS frio. Filtre a suspensão celular resultante em tubos de centrífuga pré-esterilizados de 50 mL usando uma tela de malha de 300. Leve cada suspensão a 50 mL usando PBS frio e depois lave a suspensão por centrifugação por 10 min a 370 x g.
    4. Descarte o supernasce e, em seguida, acumule cada pelota por tratamento em novos tubos de 50 mL (recomenda-se um tubo por rato; no entanto, se as amostras forem agrupadas, 2-4 pelotas/tubo são recomendadas). Suspenda as pelotas agrupadas em 45 mL Percoll 35% (em PBS) e 100 UI/mL heparina.
    5. Gire cada tubo a 500 x g por 10 min a 20 °C. Descarte o supernascimento e suspenda a pelota em 5 mL de PBS e, em seguida, adicione 1 mL de tampão de lise ACK a cada pelota por 10 minutos no gelo.
    6. Leve cada tubo a 50 mL com PBS e lave por centrifugação por 10 min a 370 x g. Descarte o supernasce e depois lave as células com PBS/2% FCS por centrifugação por 10 min a 370 x g. Conte as células.
    7. Análise do tipo celular usando citometria de fluxo
      NOTA: Aqui está um exemplo de como foxp3+tregs induzidos podem ser detectados.
      1. Incubar células 1x106 com reagente de bloqueio fcr e mancha com diluições de 1:100 de CD4-FITC, CD25-PE e CD45-PerCP por 30 minutos no gelo. Em seguida, colora as células intracelularmente com FoxP3-APC.
      2. Fixar as células com 250 μL de tampão de fixação (ver Tabela de Materiais) e armazenar a 4 °C até a análise por citometria de fluxo dentro de 3 dias.
      3. Recomenda-se a seguinte estratégia de gating para detectar Foxp3+Tregs induzidos em suspensões de células únicas de fígado, baço ou linfonodos usando citometria de fluxo: Identifique células vivas usando o kit de manchas Aqua Dead Cell Live/Dead Fixable. Em seguida, portão em células hepáticas que são CD45+ (PerCP, clone RA3-6B2) e células gate CD4+ (FITC, cloneGK1.5) do portão CD45+. Das células CD4+, identifique as porcentagens das células CD25+(PE, clone 7D4) e FoxP3+ (APC, clone 3G3).
  4. Análise histológica dos tecidos hepáticos para hepatite
    1. No dia 21, fixar as seções hepáticas (5 μm de espessura) em formalina tamponada 10% neutra e mancha com Hemaoxilina &Eosin.
    2. Determine as pontuações de histologia primeiro em baixa potência (40X) em uma média de 2 visualizações e confirme em 64X. Escore as seções teciduais da seguinte forma: Grau 0=sem inflamação ou necrose; Grau 1= inflamação lobular menor sem necrose; Grau 2= inflamação lobular envolvendo <50% da seção; Inflamação grau 3=lobular envolvendo ≥ 50% da seção; e grau 4=inflamação com necrose.
  5. Determinação dos níveis de citocina tecidual em baços e fígados.
    1. No dia 14 ou dia 21, homogeneize as amostras de fígado ou baço (1 g) de cada rato em 1 mL de RPMI/2% FCS até suavizar usando um homogeneizador de laboratório geral em configuração média. Mantenha a amostra fria no gelo.
    2. Centrifugar o homogeneizado por 15 min a 1455 x g a 4 °C usando uma centrífuga de desktop refrigerada. Encaixe o supernatante e armazene a -80 °C até ficar pronto para uso. Os níveis de citocina e quimiocina podem ser medidos com kits comerciais elisa, conforme instruções do kit. Padronize os níveis de citocinas convertendo os níveis (em mL ou μL) em pg/g de tecido.
  6. Detecção de anticorpos de soro para CYP2E1, o epítope CYP2E1 JHDN5 e o metabólito da droga TFA.
    1. Nos dias 14 ou 21, sedeia os camundongos com 40-60 mg/kg de cetamina misturada com 4-6 mg/kg de xilazina. Confirme a profundidade adequada da anestesia observando uma redução do tônus muscular e nenhuma resposta a estímulos dolorosos, como uma pitada de dedo do dedo (reflexo de abstinência), além da perda de reflexos de direito e perda de reflexos palpebrais. Utilize uma agulha de 25 G presa a uma seringa tuberculina e aproxime-se do coração avançando lentamente a agulha para a cavidade torácica sob as costelas e imediatamente lateral ao processo xifoide. Coletar sangue usando punção intracardiac.
    2. Uma vez coletado o sangue, deixe-o coagular à temperatura ambiente. Centrifugar as amostras de sangue a 295 x g por 20 minutos à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente a sera, aliquot a sera e escor ao congelamento de encaixe a -20 °C.

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Resultados

O calendário de vacinação utilizado para induzir o DIH apresentado na Figura 1 representa as duas imunizações necessárias na base do pescoço (dia 0) e a base da cauda (dia 7). A Figura 2 mostra dados representativos de proliferação obtidos no dia 14 utilizando CFSE em resposta ao CYP2E1, JHDN5, o epítope CYP2E1 e o metabólito trifluoroacetil (TFA) dos anestésicos. A Figura 3 mostra a estratégia de gating e a análise representativa d...

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Discussão

A força deste protocolo repousa em sua reprodutibilidade; por isso, é fundamental aderir às etapas sugeridas. A formulação do imunogênio pode ser uma barreira para alguns; no entanto, reproduzimos nosso modelo usando o epítope descrito em nosso documento, que remove a necessidade de isolar a fração S100 do fígado. É provável que epítopos adicionais ou proteínas possam ser alterados e induzir hepatite após as imunizações; no entanto, descrevemos essas proteínas que usamos com resultados confiáveis. Várias proteínas foram ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Dr. Njoku gostaria de reconhecer o Dr. Noel R. Rose, PhD, por sua orientação e discussões perspicazes que resultaram na formulação deste modelo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,1% 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico ácido (TNBS)ThermoFisher28997
AKP Kit de SubstratoBioRad172-1063
Camundongos BALB/cJackson
CellTrace™ Kit de Proliferação Celular CFSEThermoFisherC34554
CFA H37RaBecton Dickinson (Difco Bacto)231131
Reagente bloqueador FcRMilteyi130-092-575
Suplemento geralThermoFisherHPRG770
HepaRG™ células criopreservadasThermoFisherHPR GC10
Vivo/Morto Fixável Kit de manchas Aqua Dead Cell ThermoFisherL34965
NaHC03Millipore SigmaS5761
Percoll®Millipore SigmaP1644-1L
Lista de Toxinas ConvulsasBiologicals180
Tamponamento de Fosfato Salino pH 7.4Vários
Pierce™ Mini Comprimidos de Inibidor de Protease, Livre de EDTAThermoFisher88666
Hidróxido de PotássioJT Baker3140-01
S-etiltrifluorotioacetato (S-ETFA)Millipore Sigma177474
Slide-a-lyzer (10 K, 12 ml)ThermoFisher66810
UltraPure™ Solução SDS, 10%ThermoFisher24730020
Williams Media E, sem vermelho de fenolThermoFisherA1217601
de diálise

Referências

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