Quantificação de Proteome-largo de rotulagem homogeneidade a nível da molécula

Análise de proteoma, que visa quantificar todo o conjunto de moléculas de proteínas expressado na célula, é uma abordagem valiosa em estudos biológicos e medicamentos atuais. Esta análise baseia-se geralmente na espectrometria de massa, que identifica a espécie de proteína baseado em espectros gerados através da ionização de proteína^1,2,3. Um método alternativo para análise de proteoma é electroforese, incluindo a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), eletroforese capilar e eletroforese bidimensional (2D) gel. Este método baseia-se na rotulagem fluorescente específico de todas as moléculas de proteína nas células analisadas, seguidas através de separação eletroforética e detecção e quantificação de cada espécie de proteína. Para atingir a rotulagem obrigatório específico de proteína, uma estratégia é usar tinturas fluorescentes que podem ligar às proteínas através de interações eletrostáticas e hidrofóbicas, tais como o azul de Coomassie e Ruby-Sypro^4,5,6 . Uma estratégia alternativa é usar a rotulagem covalente com corantes contendo éster de N-Hidroxisuccinimida (NHS) ou maleimide, que pode ligar covalentemente a proteínas através de resíduos comuns, tais como aminas primárias e tióis, respectivamente,^{7, 8}.

Entretanto, a sensibilidade da deteção de fluorescência é ideal para a análise de proteínas de baixo-abundância e pequeno número de células. Imagens de fluorescência única molécula é um dos métodos mais sensíveis que permite a detecção de corantes fluorescentes individuais e as proteínas etiquetadas em vitro e in vivo^{9,10,11,12, 13,14,15}. Aplicação deste método de imagem para análise de proteoma baseada em eletroforese é esperada para permitir ensaios altamente sensíveis e quantitativos pela contagem individuais proteínas fluorescente-labeled. No entanto, isso ainda não está claro se etiquetando com corantes fluorescentes é bastante homogêneo em todas as moléculas de proteína, e como esta homogeneidade é afectada por espécies diferentes proteínas (Figura 1). Medições de solução simples em massa podem ser usadas para obter uma relação molar de corantes fluorescentes para proteínas chamadas 'eficiência de acoplamento'⁸ ou 'rotulagem eficiência', mas essa propriedade não fornece informações de homogeneidade a rotulagem entre moléculas de proteína.

Aqui, descrevemos o protocolo para um ensaio investigar a homogeneidade de rotulagem para todas as espécies de proteína no celular (Figura 2)¹⁶. As duas principais etapas deste teste são imagens e purificação de proteínas. Na primeira etapa, todas as proteínas nas células fluorescente são rotuladas e biotinilado, então extraído separadamente usando electroforese em gel, seguido por electroelution. Na segunda etapa, propriedades de fluorescência de moléculas de proteínas individuais nas amostras extraídas são avaliadas com base na imagem única molécula. Estes dados, parâmetros importantes para a análise de contagem, tais como a percentagem de proteínas rotulado com pelo menos um corante, o que chamamos de rotulagem de ocupação (LO)¹⁶, e o número médio de corantes fluorescentes ligadas a uma molécula de proteína única (n̄ _corante), pode ser caracterizado. No protocolo, um processo otimizado para rotular o célula HeLa proteome com tintura de cianina 3 (Cy3) baseados em éster NHS é apresentado como um exemplo e pode ser modificado com outros procedimentos de rotulagem de acordo com os objectivos de pesquisa desejado.

1. preparação da pilha

1. Cultivar as células de HeLa em um prato de 10 cm a 37 ° C abaixo de 5% de CO₂ em Dulbecco é modificado médio da águia contendo 10% de soro fetal bovino.
2. Recolha pilhas exponencialmente crescentes, uma vez que eles chegaram a confluência de 70%, seguindo as instruções de ATCC¹⁷.
   1. Enxague as células com 5 mL de 1x salina tamponada fosfato (PBS) (pH 7,4). Remova a PBS.
   2. Adicione 1 mL de 0,1% de ácido de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar a 5 min a 37 ° C.
   3. Monitore a progressão da dissociação celular por microscopia.
   4. Uma vez que as células tornam-se redondo e são desanexadas do prato, adicione 4 mL de meio de crescimento e quebrar a aglomeração de células pipetando.
   5. Conte o número de células, usando um contador de célula.
   6. Centrifugar a 150 x g durante 10 minutos num tubo de centrífuga. Remover o meio e ressuspender as células com 5 mL de 1X PBS (pH 7,4).
   7. Repita a etapa 1.2.6. Ressuspender as células em 1X PBS (pH 7,4) a uma concentração final de 10⁶ células/mL, utilizando o número de contagem na etapa 1.2.5.
      Nota: A suspensão de eritrócitos pode ser aliquotadas e armazenado a-80 ° C durante vários meses. Repetir um ciclo de congelamento/descongelamento deve ser evitado.

2. celular Lise e rotulagem fluorescente

1. Fazer 10 mL de tampão de lise (borato de 0,1 M, 1% sulfato dodecyl de sódio (SDS) e 1% Tween 20). Ajuste o pH 12 usando 2 M de NaOH.
   Cuidado: NaOH concentrado é corrosivo. Use óculos e luvas adequadas ao preparar esta solução.
   Nota: Tampão de Lise pode ser armazenado por até uma semana à temperatura ambiente.
2. Mix 100 μL de Lise buffer com 1 μL de 1m ditiotreitol (DTT) e 4 μL de 50% 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CAPS).
3. Misturar 1 μL da cultura de pilha (aproximadamente 1.000 células) com o misto lysing buffer da etapa 2.2. Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas. Incube no escuro à temperatura ambiente por 5 min com agitação suave. Re-homogeneizar a solução pipetando lentamente.
4. Adicione 1 μL de 2 μg/mL tintura de Cy3 NHS-éster. Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas. Incube durante 5 min no escuro à temperatura ambiente com agitação suave.
   Nota: O pH elevado desta reserva provoca a neutralização dos resíduos de lisina em proteínas, levando a uma maior reactividade.
5. Repeti a adição de 1 μL de 2 μg/mL tintura de Cy3 NHS-éster. Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas. Incube durante 10 min no escuro à temperatura ambiente com agitação suave.
   Nota: Esta repetida adição de corante de NHS-éster pode aumentar a eficiência de rotulagem porque alguns do corante Cy3 NHS-éster é hidrolisado e desativado pelo pH elevado do buffer de reação.
6. Ajustar o pH 7,2, adicionando 100 μL de 0,8 M 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES)-NaOH pH 7.2 para saciar a reação. Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas.
7. Adicionar 20 μL de 19 mg/mL-biotina (polietileno glicol (PEG))₂-amina e 5 μL de 20 mg/mL 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Homogeneizar a solução pipetando lentamente para evitar bolhas. Incube durante 1 h no escuro à temperatura ambiente com agitação suave.
   Nota: Este passo biotinylation é necessário fixar as moléculas de proteína em uma lamela de microscópio em uma densidade fixa e com nenhuma polarização para espécies de proteína.
8. Remover os reagentes de rotulagem não tenha reagidos e concentrar a amostra usando uma coluna de ultrafiltração com 10 kDa Cut-off, seguindo as instruções do fabricante.
   Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. A amostra pode ser armazenada a-80 ° C durante várias semanas.

3. recuperação e separação do proteoma

1. Adicione 4 x tampão de amostra SDS (200 mM Tris-HCl pH 6,8, SDS de 4%, 4% de glicerol e 0,4% de bromofenol).
   Nota: Para evitar danos de tintura, a amostra de proteína não deve ser aquecida, como feito em SDS-PAGE padrão e deve ser mantida em temperatura ambiente.
2. Execute o padrão de SDS-PAGE para a amostra de proteína e uma escada molecular, usando o gel do acrilamido de 20%. Migrar a amostra no gel com uma tensão constante (160 V) até a migração frente sai só o gel.
3. Imagem do gel para identificar a localização das bandas de proteínas (Figura 3).
4. Corte as porções de gel incluindo frações proteicas de interesse usando uma lâmina afiada, baseada nas posições da banda. Fracionamento em picos de 16, 23, 55 e 120 kDa e em 19 – 25, 25-32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97 – 136 e 136 – 226 kDa regiões são mostradas na Figura 3.
5. Extrato de proteínas usando uma dialyzer por electroelution com um tamanho de poro de 6 – 8 kDa, seguindo as instruções do fabricante.
   Nota: A amostra coletada pode ser armazenada a-80 ° C durante várias semanas.

4. preparação de lamela microscópio

1. Prepare-se para cada amostra 200 μL de tampão de avidina (pH 5 mM HEPES-NaOH 7.2, 10 avidin ng/mL e 2 mg/mL albumina de soro bovino (BSA)).
2. Prepare as lamelas de 22 x 22 mm e 0,15 mm de espessura. Expor as lamelas para ar plasma usando um plasma líquido de limpeza para 1 min para limpar e ativar suas superfícies.
3. Casaco de lamelas com avidina por rotação-revestimento 200 μL de tampão de avidina, usando um aplicador de rotação durante 5 segundos a 500 rpm, seguido de 30 segundos a 1.000 rpm. Incube as lamelas durante 15 minutos à temperatura ambiente para deixá-los secar.
4. Prepare-se para a amostra de proteína lamelas.
   1. Dilua a amostra de proteína (de 3.5) 100 vezes em pH 5 mM HEPES-NaOH 7.2.
   2. Lugar de 100 μL de amostra diluída na superfície no centro da lamela avidina-revestido (da etapa 4.3).
   3. Incube no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente.
5. Prepare o controlo positivo.
   1. Lugar de 100 μL de 10 ng/mL purificado fluorescente biotina em 5 mM HEPES-NaOH pH 7.2 no centro do avidin revestido lamela (da etapa 4.3).
   2. Incube no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente.
      Nota: Esta lamela de controlo positivo fornece a densidade de avidina pontos de ligação, que é usado para calcular o LO.
6. Prepare o controle negativo.
   1. Rotação-casaco o plasma limpos lamela com 200 μL de 5mm BSA HEPES-NaOH e 2 mg/mL (sem avidina).
   2. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente para secar.
   3. Adicione 100 μL de 10 ng/mL purificado fluorescente biotina em pH 5 mM HEPES-NaOH 7.2.
   4. Incube no escuro durante 15 minutos à temperatura ambiente.
      Nota: Esta lamela de controlo negativo fornece a quantidade de ligação não-específica de biotina fluorescente para a lamela sem avidina.
7. Lave cada lamela com 200 µ l de água destilada pipetando nas bordas da lamela para não tocar no meio da lamela com a ponta. Repeti esta lavagem três vezes.
   Nota: Depois de aspirar água na lamela, água deve ser imediatamente colocada na lamela para evitar sequem completamente.
8. Expor o plasma de ar para o mesmo número de lamelas etapa 4.2.
9. Coloca a lamela limpada na lamela ligados a amostra da etapa 4.7 para evitar a secagem.

5. observação com microscopia de fluorescência única molécula

1. Arranque de um microscópio de fluorescência de campo largo-campo ou evanescente.
   Cuidado: Direto ou radiação laser dispersas pode causar olho ou danos de pele. Use óculos de protecção adequados e proteger o trajeto da luz do laser.
   Nota: Para a instalação do microscópio, refira por favor nosso anterior publicação¹⁶. Brevemente, um microscópio de fluorescência de campo largo-campo ou evanescente equipado com uma excitação de laser de alta potência 488 nm, uma lente objetiva de abertura numérica elevada e uma câmera de alta sensibilidade pode ser usado para esta medição. Além disso, para uma medição automatizada, um palco de amostra translação XY controlada por computador, obturadores mecânicos por excitações do laser e um sistema de auto-foco são recomendados para ser instalado.
2. Definir a lamela no microscópio e encontrar o foco.
3. Execute uma verificação de telha para obter pelo menos 100 imagens.
   Nota: A iluminação do laser deve ser controlada com obturadores mecânicos para ser exposto à amostra somente quando a gravação de imagens com a câmera, para minimizar o fotobranqueamento. Se houver muitas amostras, usando um programa de computador para controlar os microscópio dispositivos automáticos de medição é recomendado. Cada imagem inclui normalmente 100-500 pontos de molécula quando usando uma lente objetiva de 60 x.

6. análise e extração de informações de imagem

1. Se a imagem tiver irregularidades devido o padrão de iluminação laser, realize processamento de imagem para corrigi-lo¹⁸.
   1. Adquira uma imagem de referência, medindo-se com uma amostra de lamela consistindo de corantes uniformemente difundido usando uma câmera definindo a mesma como na etapa 5.3.
   2. Adquira uma imagem deslocamento medindo com nenhuma excitação do laser, usando a mesma configuração de câmera.
   3. Subtrai a cada valor de pixel em cada imagem de amostra e a imagem de referência com o valor da imagem deslocada.
   4. Divida cada valor de pixel na imagem de amostra subtraídos pelo valor da imagem de referência subtraídos.
2. Recolher imagens adquiridas corretamente e remova o fundo da imagem.
   1. Remova imagens contendo grandes agregados fluorescentes manualmente.
   2. Remova o fundo da imagem, aplicando o algoritmo de bola rolando-¹⁹ com um raio de bola de 50 pixels usando o ImageJ²⁰.
   3. Aguçar imagens subtraindo imagens borradas, usando o ImageJ (aguçar a função de imagem).
3. Encontrar e analisar pontos da molécula em imagens.
   1. Identifica pontos de molécula com o limiar ienes do algoritmo²¹ usando o ImageJ.
   2. Filtre pontos com menos de dois pixels para excluir o escuro ruído da câmera e manchas mais de 20 pixels para excluir as agregações de proteínas usando o ImageJ (gerente de ROI).
   3. Conte o número de pontos em cada imagem. Usando imagens corrigidas (etapa 6.1.4), analisar a iluminação total intensidades dentro de pixels para cada local usando o ImageJ.
4. Calcule a ocupação de rotulagem (LO) usando a seguinte fórmula:
   LO = (número de contagens na amostra / número de contagens em controlo positivo) x 100
5. Calcule o número médio de corantes fluorescentes, ligadas a uma molécula de proteína única (n̄_corante).
   1. Analise um histograma das intensidades de cada ponto.
      Nota: O histograma geralmente tem vários picos, e cada pico representa um diferente número de moléculas de corante, ligado a uma proteína. O primeiro, segundo e terceiro pico no histograma corresponde às moléculas de 1, 2 e 3, respectivamente.
   2. Calcule a intensidade média de histograma. Também Calcule a intensidade do pico do primeiro pico aplicando um encaixe Gaussian.
   3. Calcule n̄_corante dividindo a intensidade média com o pico de intensidade.

A Figura 4 representa os dados de imagem raw para peso molecular diferentes frações de proteínas de célula HeLa lisada, bem como o controle positivo e negativo. Enquanto a amostra de proteína e o positivo controlam exibição 100 – 500 pontos por imagem, o controle negativo exibe nenhum ou poucos pontos, mostrando que o protocolo suficientemente inibe inespecificas de corantes para a superfície da lamela. Histogramas de intensidade local para as amostras da proteína e o controlo positivo apresentam vários picos, representando a ligação estocástica de corantes para aminas primárias em proteínas e avidina tetrâmero estruturas22, respectivamente. Todos os pontos mostraram fotobranqueamento intermitente e gradual com excitação contínua do laser, destacando a observação no nível única molécula (Figura 5AB).

O LO é calculado a partir do rácio do número de pontos em cada amostra de proteína, para que no controle positivo. O LO medido a partir da amostra de lisado de célula HeLa variou de 50% para a menor peso molecular (16 kDa) fração a 90% para a mais alto peso molecular (120 kDa) fração e foi de 72% para a amostra de proteome todo sem separação (Figura 6). Correspondentemente, n̄corante tendem a aumentar com o aumento do peso molecular. Estas tendências de aumento são consideradas para ocorrer devido ao maior número de resíduos de lisina, levando ao aumento do NHS-éster tingir a ligação. Por exemplo, a fração de 23 kDa tem um alto valor LO devido ao grande número de resíduos de lisina em proteínas histonas constantes dessa fração.

Figura 1: efeito de proteome rotulagem homogeneidade na proteína número contando. O número de contagem de proteína é altamente dependente como fortemente e homogeneamente moléculas de proteína são rotuladas, em vez do rácio número de proteínas para corantes. A homogeneidade pode ser marcada usando um parâmetro denominado rotulagem ocupação (LO), que define a probabilidade de moléculas de proteína rotulado contra moléculas de proteínas totais. Esse valor fornece a eficiência de contagem de proteína (ou seja, rendimentos mais elevados LO superiores contam números (à esquerda) e vice versa (à direita)). Enquanto um valor LO de 100% é o ideal, LO de < 100% pode fornecer um fator de atenuação para estimar os números absolutos de proteína. Esta figura foi modificada de Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: fluxo de trabalho ensaio. Primeiro, as lamelas (um) e (b) são tratados com avidin para atingir uma densidade fixa. Amostra segundo, fluorescente-etiquetada proteínas são biotinilado e anexado a lamela (um) através da interação de avidina-biotina. Em paralelo, quase 100% fluorescente-etiquetadas purificada biotina é imobilizada em lamela (b). Em terceiro lugar, as lamelas são fotografadas por microscopia de fluorescência de único-molécula para obter a distribuição de brilho e número de manchas de fluorescência. Finalmente, o parâmetro de homogeneidade, LO, é calculado a partir a relação de números de ponto em (um) para que em (b). Esta figura foi modificada de Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: separação de uma amostra de células HeLa proteome utilizando SDS-PAGE. Fluorescente etiquetado lisado celular total biotinilado foram migradas em dois diferentes geles (20% do acrilamido) e proteínas visualizadas usando o Visualizador de gel, com um tempo de exposição de 5 min e 10 min para 1 do gel e gel 2, respectivamente. As caixas vermelhas representam as regiões de gel que foram cortadas para fora e extraídas. Esta figura foi modificada de Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: única imagens de molécula de amostras de proteome. Fluorescência spot imagens (à esquerda) e histogramas das intensidades mancha (à direita) obtidas de peso molecular diferente proteome fracções. Barra de escala é 10 μm. As setas no controle positivo indicam o passo de rotulagem diferente de avidina. Esta figura foi modificada de Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: fotobranqueamento de spots fluorescentes. (A) Time-Lapse imagens dos pontos fluorescentes sob excitação contínua do laser. (B) tempo vestígios de intensidades de fluorescência em pontos diferentes. Os vestígios mostram também as fotobranqueamento de um ou dois passo, indicando os respectivos números de corantes foram acoplados à proteína no lugar da amostra purificada de BSA. Esta figura foi modificada de Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: rotulagem homogeneidade das amostras de proteome. LO (azul) e n̄corante (vermelho escuro) obtidos de peso molecular diferentes frações. Os dados são expressos como média ± imagens s.e. 98, 46, 27, 77, 44, 39, 62, 101, 65, 62, 82, 61 e 70 foram analisados para a célula inteira lisada, 16, 23, 55, 120, 19-25, 25-32, 32-42, 42-54, 54-69, 69-97, 97 – 136 e 136 – 226 kDa frações , respectivamente. Esta figura foi modificada de Leclerc et al.16 Copyright 2018 American Chemical Society. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram o interesse financeiro concorrentes seguintes: RIKEN entrou com um pedido de patente sobre esses resultados com S.L. e Y.T. nomeado como co-inventores.