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Artigo de método

A convecção aumentou a entrega do vetor viral adeno-associado Optogenetic ao córtice de Rhesus macaque a orientação de imagens em linha de MRI

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DOI:

10.3791/59232

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23 de maio de 2019

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1Departments of Bioengineering, University of Washington, 2Washington National Primate Research Center, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Washington, 4Department of Physiology and Center for Integrative Neuroscience, University of California, San Francisco

Neste artigo

Resumo

Aqui, nós Demonstramos a ressonância magnética (Sr.)-a entrega aumentada da convecção guiada (CED) de vetores virais no córtice como uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais no cérebro do macaque.

Resumo

No primata não-humano (NHP) optogenética, infectando grandes áreas corticais com vetores virais é muitas vezes uma tarefa difícil e demorada. Aqui, Nós demonstramos o uso de ressonância magnética (RM)-guiada por convecção reforçada de entrega (CED) de vetores virais optogenéticos em córtices primários somatosensorial (S1) e motor (M1) de macacos para obter uma expressão cortical eficiente e generalizada de canais iônicos sensíveis à luz. Os vetores virais adeno-associados (AAV) que codificam o opsina vermelho-deslocado C1V1 fundidos à proteína fluorescente amarela (EYFP) foram injetados no córtice de macacos do rhesus o Sr.-guiado CED. Três meses após a infusão, a imagem latente epifluorescente confirmou grandes regiões da expressão optogenética (> 130 milímetros2) em M1 e em S1 em dois macaques. Além disso, nós pudemos gravar respostas luz-evocadas confiáveis da electrofisiologia das áreas expressando usando matrizes micro-electrocorticographic. A análise histológica mais atrasada e a imunomarcação de encontro ao repórter revelaram a expressão optogenética difundida e densa em M1 e em S1 que correspondem à distribuição indicada pela imagem latente epifluorescente. Esta técnica permite-nos obter a expressão através das grandes áreas do córtice dentro de um período de tempo mais curto com dano mínimo comparado às técnicas tradicionais e pode ser uma aproximação óptima para a entrega viral optogenética em grandes animais tais como nhps. Esta aproximação demonstra o grande potencial para a manipulação do rede-nível de circuitos neural com célula-tipo especificidade em modelos animais evolutionarmente perto dos seres humanos.

Introdução

Optogenetics é uma ferramenta poderosa que permite a manipulação da atividade neural e o estudo das conexões de rede no cérebro. A implementação desta técnica em primatas não humanos (NHPs) tem o potencial de melhorar a nossa compreensão da computação neural em grande escala, cognição e comportamento no cérebro do primata. Embora a optogenética tenha sido implementada com sucesso em nhps nos últimos anos1,2,3,4,5,6,7, um desafio que pesquisadores enfrentam está alcançando altos níveis de expressão em grandes áreas cerebrais nesses animais. Aqui, nós estamos fornecendo uma aproximação eficiente e simplificada para conseguir níveis elevados de expressão optogenética através das grandes áreas do córtice nos macaques. Esta técnica tem um grande potencial para melhorar a atual estudos optogenéticos nestes animais em combinação com o estado-da-arte de gravação8,9 e estimulação óptica10 tecnologias.

O fornecimento aprimorado de convecção (CED) é um método estabelecido de entrega de agentes farmacológicos e outras grandes moléculas, incluindo vetores virais, para o sistema nervoso central11,12,13. Considerando que os métodos convencionais de parto envolvem múltiplas infusões de baixo volume distribuídas em pequenas regiões do cérebro, a CED pode alcançar uma distribuição mais ampla e uniforme do agente com menos infusões. O fluxo de fluido a granel acionado por pressão (convecção) durante a infusão permite transdução mais ampla e uniformemente distribuída do tecido alvo ao entregar vetores virais com CED. Em estudos recentes, nós Demonstramos a transdução e a expressão optogenética subseqüente de grandes áreas do motor preliminar (M1) e dos córtices somatosensory (S1)9 e do tálamo14 usando a ressonância magnética (Sr.)-guiada CED.

Aqui, nós esboçamos o uso de CED para conseguir a expressão optogenética através das grandes áreas corticais com somente algumas injeções corticais.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pela Universidade da Califórnia, San Francisco institucional de cuidados e uso de animais do Comitê (IACUC) e estão em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório. O procedimento a seguir foi realizado com dois macacos machos adultos de 8 e 7 anos de idade, pesando 17,5 kg e 16,5 kg (macaco G e macaco J), respectivamente.

Nota: Use técnicas assépticas padrão para todos os procedimentos cirúrgicos.

1. imagem de base

  1. Sedate e entubar o animal e manter a anestesia geral isoflurano (concentração alterada entre 0 a 5% conforme necessário, dependendo de sinais vitais, tais como frequência respiratória e frequência cardíaca). Monitore a temperatura do animal, a frequência cardíaca, a saturação de oxigênio, as respostas eletrocardiográficas e a pressão parcial da maré final do CO2 durante todo o procedimento.
  2. Coloque o animal em um quadro estereotódico compatível com MR (ver a tabela de materiais) em que permanecerá durante todo o procedimento. Ligue o animal a uma máquina portátil de isoflurano compatível com MR e transportá-la para o scanner de ressonância magnética (3 T).
  3. Adquira o T1 padrão (ângulo flip = 9 °, tempo de repetição/tempo de eco = 668,6, tamanho da matriz = 192 x 192 x 80, espessura da fatia = 1 mm) e T2 (ângulo de aleta = 130 °, tempo de repetição/tempo de eco = 52,5, tamanho da matriz = 256 x 256 x 45, espessura da fatia = 1 mm) imagens anatômicas do Sr referência e para o planeamento cirúrgico.
  4. Recupere o animal da anestesia e transporte-o à área de carcaça animal.
  5. Use as imagens adquiridas T1 e T2 para determinar a colocação da craniotomia. A posição da craniotomia pode precisamente ser determinada combinando a área cortical do interesse do Sr. com o Atlas do cérebro do macaque (Paxinos, Huang, Petride, edição de toga 2ND ). Além disso, essas imagens de linha de base podem fornecer uma estimativa para os locais de infusão viral. As regiões corticais de interesse aqui demonstradas são M1 e S1.

2. implante de câmara compatível com MR

  1. Sedate e entubar o animal e mantem a anestesia geral com monitoração anestésica padrão como em 1,1.
  2. Coloque o animal no quadro estereotódico compatível com o Sr em que permanecerá ao longo da implantação da câmara e da entrega do vetor viral. Ligue o animal a uma máquina portátil de isoflurano compatível com MR.
  3. Criar uma incisão sagital aproximadamente 2 cm da linha média com um comprimento de cerca de 5 cm com um bisturi.
  4. Retire o tecido mole subjacente do crânio usando elevadores (ver tabela de materiais).
  5. Criar uma craniotomia circular (2,5 cm de diâmetro) para cobrir as trajetórias pré-planejadas para injeções usando um trephine (ver tabela de materiais).
    1. Abaixe o ponto de centralização do trephine após a borda do trephine. Crie um recuo no centro da craniotomia planejada suficientemente profundamente no crânio para ancorar a trefina usando o ponto de centralização ajustável do trephine. Exercite o cuidado para evitar penetrar completamente a profundidade do crânio, pois isso pode causar danos ao tecido neural subjacente.
    2. Lave periodicamente a área com soro fisiológico conforme necessário para manter a umidade do tecido em toda a craniotomia.
    3. Uma vez que o centro foi feito, abaixe o trephine no crânio e gire o trephine no sentido horário e anti-horário ao aplicar a pressão descendente até que a tampa do osso possa ser removida com fórceps. Exercite o cuidado para evitar danificar o tecido subjacente com o trephine.
  6. Rosqueie uma sutura fina (tamanho 6-0) através do dura no centro da craniotomia e levante a dura puxando delicadamente a sutura da superfície do cérebro que cria uma barraca no centro da craniotomia.
  7. Em seguida, perfure a dura perto do centro da tenda usando tesouras oftalmálicas finas para evitar danificar o cérebro. Em seguida, cortar a dura do centro para a borda da craniotomia e continuar ao longo da borda com tesouras opthalmic multa.
  8. Monte a câmara cilíndrica personalizada com o tipo CED (Figura 1; ver secção 4 para instruções de produção) para o crânio em cima da craniotomia para fornecer suporte de cânula durante a PERFUSÃO de CED, de tal forma que a curvatura da flange da câmara se alinha bem com a curvatura do crânio.
  9. Prenda os implantes ao crânio usando os parafusos plásticos e o acrílico dental ou alguns parafusos Titanium.

3. entrega viral do vetor

  1. Logo após a implantação da câmara compatível com MR e a inserção da grelha de injecção da cânula (Figura 1a-B, figura suplementar 1) na câmara, encha a grelha com soro fisiológico (0,9% NaCl) para visualizar os locais de injecção através de imagens anatômicas Mr e Encha as cavidades da câmara com a gelatina absorvente estéril molhada para manter a umidade do cérebro (Figura 1F).
  2. Cubra a pele e o cilindro com uma incisão antimicrobiana estéril incise para manter a esterilidade dos cilindros durante o transporte e infusões MR. Coloque uma cápsula de vitamina E para marcar a parte superior da grelha de injecção para identificação positiva.
  3. Enquanto o animal permanece intubado, retire o tubo endotraqueal do circuito de anestesia e volte a anexá-lo a uma máquina portátil de isoflurano compatível com MR e transportar o animal para o scanner de ressonância magnética.
  4. Adquira imagens T1 (ângulo flip = 9 °, tempo de repetição/tempo de eco = 668,6, tamanho da matriz = 192 x 192, espessura da fatia = 1 mm, 80 fatias) para calcular a distância do topo da grade de injeção e da superfície cortical. A cápsula da vitamina E é claramente visível em imagens T1 e deve ser usada como um marcador para a parte superior da grade da injeção (Figura 2a). Utilize a ferramenta de régua do software de imagem MR para medir a distância entre a parte superior da grelha de injecção e a superfície cortical.
  5. Adquira imagens T2 (ângulo da aleta = 130 °, tempo de repetição/tempo de eco = 52,5, tamanho da matriz = 256 x 256, espessura da fatia = 1 milímetro, 45 fatias) para determinar as guias ideais da cânula para cada local baseado no local alvejado da infusão (Figura 2b-C). Como mencionado mais cedo, a grade da cânula é enchida com o soro fisiológico que é o mais melhor visível em imagens do T2. Usando o software de imagem latente de MR, role através dos planos coronal e sagital para encontrar a posição do alvo da infusão.
  6. Após descongelamento o vetor viral por algumas horas na temperatura ambiente, misture o vetor viral com o gadotérico do agente de contraste do Sr. (relação de 250:1; 2mm gd-dTpa, veja a tabela dos materiais) pela mistura da pipeta ou do vortex.
    Nota: A técnica apresentada foi testada para vetores de AAV com um promotor de CamKIIa expressão de condução de C1V1 fundido ao EYFP (AAV 2.5-CamKII-C1V1-EYFP, Titer: 2,5 x 1012 moléculas de vírus/ml; ver tabela de materiais).
  7. Carregue o vírus misto em um tubo de 0,2 mL de alta pressão IV (ver tabela de materiais).
  8. Estabeleça um campo estéril fora do varredor do Sr. para preparar a linha viral da infusão.
  9. Usando a tubulação de alta pressão IV, conecte uma linha de extensão longa (aproximadamente 3-5 medidores, dependendo da posição da bomba da infusão no que diz respeito ao furo do Sr.) a uma seringa MR-Compatible de 3 mL e prima com soro fisiológico.
  10. Ligue a extremidade distal da linha de extensão longa à extremidade proximal da tubagem 0,2 mL IV carregada com o vírus e prenda a cânula resistente ao refluxo com uma ponta escalonada de 1 mm (Figura 2D; ver secção 5 para instruções de produção da cânula) para a extremidade distal do Este conjunto com um conector do cateter do estilo da braçadeira (veja a tabela dos materiais) (Figura 2e).
  11. Por último, defina a seringa numa bomba compatível com MR (ver tabela de materiais). Coloque o controlador da bomba na sala de controle do scanner, pois não é compatível com o Sr.
  12. Usando as imagens anatômicas da linha de base obtidas antes, selecione a localização da grade de injeção da cânula e a profundidade de inserção necessária para atingir o local de infusão alvo. Marque a profundidade de inserção na cânula usando fita estéril.
  13. Comece a infusão a uma taxa de 1 μL/min e valide visualmente o fluxo do fluido na linha de infusão observando a ejeção do fluido da ponta da cânula.
  14. Insira a cânula manualmente através da grelha de injecção para a profundidade alvo, mantendo o fluxo na linha de infusão, pois isso impedirá o tecido penetrado de entupimento da cânula durante a inserção.
  15. Adquira imagens ponderadas em T1 rápidas (2 minutos) (ângulo de aleta = 30 °, tempo de repetição/eco = 3, 5, tamanho da matriz = 128 x 128, espessura da fatia = 1 mm, 64 fatias) para monitoramento on-line da infusão viral do vetor.
  16. Após a infusão de ~ 10 μL do vetor de tal forma que o vírus suficiente é infundido para detectar no MR scanner, obter imagens de MR para verificar a colocação correta cânula como evidente pela propagação observada do vírus. Se a profundidade da cânula inserida estiver incorreta, ajuste a profundidade de acordo ou remova lentamente a cânula e tente novamente a inserção como em 3,12.
  17. Monitore a infusão através da orientação de imagens de MR em linha (flash T1 tornado mais pesado) e aumente a taxa de infusão a 5 μL/min por 1 μL/min etapas cada poucos minutos (Figura 3a).
  18. Após a infusão de aproximadamente 40 μL do vetor viral, começar a reduzir a taxa de perfusão em 1 μL/min passos e parar a perfusão após ~ 50 μL é injetado e deixar a cânula no lugar por 10 minutos.
  19. Lentamente retire a cânula do cérebro e mover para o próximo local. Repita as etapas 3,9 a 3,19 para cada local.
  20. Cubra o cilindro com um drapejar estéril na extremidade das injeções, antes do transporte animal. Em seguida, transportar o animal de volta para a sala de operação.
  21. Explante a câmara MR-Compatible e fecha a incisão cirúrgica substituindo a aleta do osso e o músculo sobrejacente e suturando a pele usando técnicas assépticas padrão ou substitua a câmara com um cilindro Titanium e um dura artificial (veja Yazdan-Shahmorad et al. 20169) para a gravação e estimulação neural.

4. produção de câmara compatível com MR

  1. Fabricar a grelha de injecção de cânula de náilon (Figura 1a-B) fazendo a usinagem de acordo com as dimensões especificadas (Figura 1 suplementar).
  2. 3D imprimem o cilindro Mr-Compatible fora do estireno do butadieno do acrilonitrila (plástico ABS0 (Figura 1C-E) (Veja o arquivo suplementar 1 – 3; Veja a tabela de materiais para a impressora 3D e os materiais).
    Nota: Um projeto mantem uma grade fixa da injeção da cânula dentro do cilindro MR-compatible (Figura 1C), quando outro permitir a rotação da grade, estendendo a região da injeção (Figura 1D-E).
  3. Rosqueie a grade da injeção da cânula e bata a cavidade correspondente da câmara MR-Compatible tal que ambas as partes exibem o mesmo Threading.
    Nota: Qualquer tipo de Threading pode ser usado desde que ambos os componentes têm o mesmo Threading.
  4. Insira a grelha de injecção de cânula de nylon aparafusando no orifício roscado do cilindro compatível com MR.

5. produção de cânula resistente a refluxo13

  1. Corte um tubo de sílica de 30 cm de comprimento com 0,32 mm de ID e 0,43 mm de diâmetro para a tubagem de sílica interna (ver tabela de materiais) utilizando uma lâmina de barbear.
  2. Corte um tubo de sílica de 7,5 cm de comprimento e 5 cm de comprimento com 0,45 mm de ID e 0,76 mm de diâmetro para a tubagem de sílica exterior (ver tabela de materiais).
  3. Adira a tubulação exterior de 7,5 cm à tubulação interna de 30 cm com cianoacrilato de tal forma que o tubo interno se estende 1 mm além do tubo externo, fazendo o passo resistente ao refluxo (Figura 2D). Para garantir que o cianoacrilato não entra no interior da tubagem interna, coloque o cianoacrilato no exterior da tubagem interior longe da ponta da cânula.
  4. Cole o tubo de sílica de 5 cm de comprimento na outra extremidade da tubagem interna para fixação ao conector do cateter de estilo Clamp (ver passo 3,10).

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Resultados

Fornecimento aprimorado de convecção (CED) orientação de RM

A disseminação do vetor viral foi monitorada durante a infusão de CED a orientação de imagens de MR on-line (Figura 3a). Neste estudo, S1 e M1 de dois macacos foram direcionados (Figura 3B). Os volumes de distribuição tridimensional foram estimados em uma análise post-hoc das imagens de MR (

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Discussão

Aqui, nós esboçamos uma técnica viável e eficiente para conseguir a expressão optogenética em grande escala no córtice somatosensory e do motor preliminar de NHP pelo Sr.-guiado CED. O uso da CED guiada por MR apresenta vantagens significativas sobre os métodos tradicionais de infusão viral no cérebro de NHP. Uma dessas vantagens é a capacidade de atingir a expressão em grandes áreas com menos infusões necessárias. Por exemplo, com métodos convencionais, múltiplas injeções de 1-2 μl da expressão de rendimento vetorial em...

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Divulgações

A PNS tem interesse financeiro na Neuralink Corp., uma empresa que está desenvolvendo terapias clínicas usando estimulação cerebral.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association pós-doutorado Fellowship (AY), defesa avançada pesquisa projetos agência (DARPA) reorganização e plasticidade para acelerar a recuperação de lesões (REPAIR; N66001-10-C-2010), R01. NS073940, e pelo centro de imagiologia da neurociência UCSF. Este trabalho também foi apoiado pelo Instituto Nacional de saúde infantil Eunice Kennedy Shiver & desenvolvimento humano dos institutos nacionais de saúde o prêmio número K12HD073945, o Washington National Primate Research Center (WaNPCR, P51 OD010425), e o centro de Neurotecnologia (CNT, um centro nacional de ciência da Fundação de engenharia de pesquisa a subvenção CEE-1028725). Agradecemos a Camilo Diaz-Botia, Tim Hanson, Viktor Kharazia, Daniel Silversmith, Karen J. MacLeod, Juliana Milani e Blakely Andrews por sua ajuda com os experimentos e NaN Tian, Jiwei He, Peter Ledochowitsch, Michel Maharbiz e Toni Haun para obter ajuda técnica.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubulação IV de alta pressão de 0,2 mLSmiths Medical Inc., Dublin, OH, EUA533640
0,32 mm de diâmetro, 0,43 mm de diâmetro externo Tubo de sílicaPolymicro Technologies1068150027
0,45 mm de diâmetro interno, 0,76 mm de diâmetro externo Tubo de sílicaPolymicro Technologies1068150625
AAV2.5-CamKII-C1V1-EYFPPenn Vector Core, Universidade da Pensilvânia
ABS plásticoStratasys, MN, EUAABSplus-P430
Cortina antimicrobiana para inciso3M6650EZIoban Drape
Dental AcrílicoHenry Schein, Inc.1013117Elevadores de agente de ligação acrílico
VWR International, LLC.10196-564Elevador Langenbeck,
sutura finaMcKesson Medical-Surgical Inc.
GadoteridolProhance, Bracco Diagnostics, Princeton, NJ0270-1111-04
Laser para estimulação de luzOmicron-Laserage, AlemanhaPhoxX 488-60
MR compatível com seringa de 3 ccAparelho Harvard, Holliston, MA, EUA59-8377
Software de imagem MRPixmeoOsiriX MD 10.0
compatível com MR BombaAparelho Harvard, Holliston, MA, EUAHarvard PHD 2000
Quadro estereotáxico compatível com RMKOPF1430M MRI
Perifix Clamp Style Catheter ConnectorB-Braun, Bethlehem, PA, USAN/A
Parafusos de plásticoPlásticos 10-80 x 1/8NParafusos de nylon
Parafusos de titânioCrist Instrument Co., Inc.6-YCX-0312Parafusos ósseos auto-roscantes
TrephineGerMedUSA Inc,SKU: GV70-42
uPrinter SE Impressora 3DStratasys, MN, EUAN / A
Cápsula de vitamina EPure Encapsulations, LLC.DE1
Gelatina absorvível estéril úmidaPfizer Inc.AZL0009034201Gelfoam
de ponta larga 1034505

Referências

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