Artigo de método

Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

DOI:

10.3791/59249

⸱

26 de março de 2019

 , 
1Theodor Kocher Institute, University of Bern

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Resumo

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A unidade neurovascular (NVU) é composta por células endoteliais microvasculares, formando a barreira hemato - encefálica (BBB), uma membrana basal endotelial com pericitos incorporados, e o limitans glia composta pela membrana basal parenquimatosa e hamartomas final-feed abraçando o aspecto abluminal do microvessels do sistema nervoso central (SNC). Além de manter o CNS homeostase o NVU controla tráfico de células imunes para o CNS. Durante immunosurveillance do SNC baixos números de linfócitos ativados podem atravessar a barreira endotelial sem causar disfunção BBB ou doença clínica. Em contraste, durante neuroinflammation tais como esclerose múltipla ou seu modelo animal encefalomielite auto-imune experimental (EAE) um grande número de células do sistema imunológico pode atravessar o BBB e, posteriormente, o limitans de glia eventualmente alcançando o parênquima do CNS levando a doença clínica. Migração de células imunes para o parênquima do CNS é, portanto, um processo de duas etapas que envolve uma migração sequencial através da barreira endotelial e glia do NVU empregando mecanismos moleculares distintos. Se após a sua passagem através da barreira endotelial, células T encontram seu antígeno cognato em células apresentadoras de perivascular sua reativação local irá iniciar mecanismos subsequentes, levando à ativação focal de gelatinases, que permitirá que as células T para atravessar a barreira glia e insira o parênquima do CNS. Assim, avaliar tanto, permeabilidade BBB e atividade da MMP na correlação espacial ao acúmulo de células imunes no SNC durante EAE permite especificar a perda da integridade das barreiras endoteliais e gliais do NVU. Aqui mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa e como analisar posteriormente permeabilidade BBB in vivo usando uma combinação de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos ainda mais, como Visualizar e localizar gelatinase atividade no cérebro de EAE por zymogaphy in situ, acoplada à imunofluorescência citológicas de membranas de porão do BBB e CD45 + invadindo as células imunes.

Introdução

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Sistema nervoso central (SNC) coordena todas as funções mentais em vertebrados e corpo, e homeostase do CNS é essencial para uma comunicação adequada dos neurônios. Homeostase do CNS é garantido pela unidade neurovascular (NVU), que protege o CNS de meio de mudança do fluxo de sangue. O NVU é composto de CNS microvascular em células endoteliais, que são bioquimicamente únicos e estabelecer a barreira hemato - encefálica (BBB) em interferência contínua com pericitos, astrócitos, neurônios e componentes da matriz extracelular (ECM), que estabelece dois membranas de porão distintas1. A membrana basal endotelial que ensheathes o aspecto abluminal das células endoteliais BBB abriga um número elevado de pericitos e é composto de laminina α4 e α5 laminina, além de outras proteínas de ECM2. Em contraste, a membrana basal parenquimatosa consiste de laminina α1 e α2 laminina e é abraçada por hamartomas ponta-pés. A membrana basal parenquimatosa juntamente com os fim de astrocyte-pés compõe o limitans glia que segrega a rede neuronal CNS do líquido cefalorraquidiano preenchido perivascular ou espaços subaracnoideo3. Devido a arquitetura original do NVU, célula imune ao tráfico para o CNS é distinta do que em tecidos periféricos como requer um processo de duas etapas com as células do sistema imunológico, primeiro violar o BBB endotelial e, posteriormente, o limitans glia a fim de alcançar o parênquima do CNS.

Esclerose múltipla (em) é uma doença comum do MPTP do SNC, em que um grande número de células do sistema imunológico em circulação Insira o CNS e causar neuroinflammation, desmielinização e perda focal de integridade BBB4. Perda de integridade BBB é uma marca início do MS, conforme indicado pela presença de contraste gadolínio realçando lesões no SNC como visualizado por ressonância magnética (MRI)5. Extravasamento de leucócitos para o CNS ocorre ao nível da postcapillary vênulas; no entanto, os precisos mecanismos envolvidos na diapedese de células imunes através da membrana basal do BBB e, posteriormente, a barreira glia permanecem para ser explorado. Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) serve como um modelo animal para MS e tem contribuído significativamente para o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da MS. Por exemplo, usando o modelo de EAE foi descoberto que o extravasamento de leucócitos ocorre em um processo de várias etapas, incluindo uma captura inicial e rolamento passo mediada por selectinas e mucina-como moléculas como ligante de glicoproteína P-selectina (PSGL) -1, seguido de prisão firme integrina-dependente e um rastreamento de células T em células endoteliais BBB aos lados permissivos para diapedese6.

Uma vez que as células T cruzaram o BBB endotelial e a membrana basal endotelial, eles precisam encontrar seu cognato antígeno macrófagos ou células dendríticas estrategicamente localizadas nos espaços leptomeníngeo ou perivascular. Essa interação induz a produção focal de mediadores pró-inflamatórios esse gatilho os subsequentes mecanismos necessários para invasão de tecido do CNS de células do sistema imunológico através da glia limitans7,8,9. Ativação focal de matrix-metaloproteinases (MMP) -2 e MMP-9 altera chemokine ativação e induz a degradação dos receptores de matriz extracelular em astrocyte ponta-pés, que é um pré-requisito para imunológico migração de células através da glia limitans para o Parênquima do CNS e induzir o aparecimento de sintomas clínicos de EAE10,11.

Combinando a deteção do CNS, infiltrando-se imune celular com BBB escapamento e gelatinase atividade em cortes de tecido do CNS fornece informações valiosas sobre a integridade funcional da barreira endotelial e glia no contexto de neuroinflammation. Por exemplo, recentemente investigamos a perda constitutiva da molécula de adesão endotelial junção apertada molécula (JAM)-B em células imunes ao tráfico para o CNS no contexto da EAE. Comparado ao saudáveis camundongos C57BL/6 de tipo selvagem, saudáveis littermates JAM-B-deficiente mostraram sem comprometimento da integridade do BBB, como demonstrado pela avaliação de permeabilidade in vivo usando marcadores endógenos como exógenos12. No contexto da EAE, JAM-B-deficientes C57BL/6 ratos mostraram sintomas de doença melhorou, que foi associado com interceptação de células inflamatórias na leptomeníngeo e perivascular espaços12. Para examinar este fenômeno aplicamos em situ zimografia, permitindo a identificação de gelatinase atividade para testar se a falta de atividade de gelatinase em camundongos JAM-B-deficiente pode ser responsável para o número reduzido de células do sistema imunológico capazes de romper a glia limitans12.

Dada a disponibilidade de diferentes geneticamente modificada do mouse modelos faltando, por exemplo, moléculas de junção apertada BBB diferentes que podem causar alterações na função do BBB, metodologias para investigar a integridade do BBB são importantes. Além disso, recentemente desenvolvidas drogas poderiam impactar sobre os obstáculos do NVU. Aqui nós mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa com a glicoproteína do oligodendrocyte mielina (MOG)-peptídeo aa35-55 em adjuvantes de Freund completo. Explicamos como localizar infiltração de células imunes em toda as barreiras endoteliais e gliais o NVU e como estudar a integridade da barreira endotelial e gliais in vivo por detecção in situ de marcadores exógenos e atividade de gelatinase, respectivamente.

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Protocolo

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Todos os estudos foram conduzidos sob as diretrizes de acordo com a legislação Suíça relativa à protecção dos animais e foram aprovados pelo Instituto veterinário no Cantão de Berna, Suíça (números de permissão: BE 31/17 e ser 77/18).

1. habitação de camundongos C57BL/6 em condições (SPF) livre de patógeno específico

  1. Ciclo de casa os ratos em gaiolas ventiladas individuais com 12/12 h claro-escuro. Providenciar comida e água ad libidum. Para supervisionar a qualidade microbiológica dos ratos, a coorte experimental foi submetido a monitoramento de integridade trimestral por roupa de cama suja sentinelas FELASA recomendações13a seguir.
  2. Socos de orelha de uso para marcar individualmente camundongos C57BL/6 fêmeas de 8 a 12 semanas.

2. imunização de camundongos C57BL/6

  1. Preparação de soluções14:
    1. Por adjuvante de Freund completo (CFA), mistura de 30 mL de adjuvante de Freund incompleto com 120 mg de calor recém pestled inativado Mycobacterium tuberculosis (H37RA) sob uma coifa. Solução estoque de loja a 4 ° C.
    2. Para a solução de peptídeo-MOGaa35-55, dissolver MOGaa35-55-peptide em PBS estéril (4 mg/mL) e armazenar a-80 ° C.
    3. Prepare o MOG-emulsão:
      1. Dilua o CFA 1:2 com solução-mãe de MOG-peptídeo em um microtubo de 2 mL.
      2. Selar o microtubo com filme de selagem e corrigir no vortex, cobrindo completamente o tubo com fita adesiva. Emulsão de vórtice para 4 h a 4 ° C.
    4. Prepare as seringas com emulsão estável:
      1. Pegue o microtubo e rapidamente spin para baixo a emulsão utilizando uma centrífuga de mesa pequena. Colete a emulsão em uma seringa com uma agulha de injeção 18 x 1½'' (1,2 x 40 mm).
      2. De acordo com o número de ratos, ajustar o volume de emulsão na seringa (100 µ l/mouse) e substituir a agulha de 18 G com uma agulha de injeção 27 x ¾'' (0,4 x 19 mm). Sele a agulha de injeção, anexada à seringa com película de vedação.
    5. Para a solução de reserva de toxina (PTx) coqueluche, dissolver 50 µ g de PTx liofilizado em 500 µ l de PBS estéril (100 ng / µ l). Solução estoque de loja a 4 ° C.
    6. Para a solução de trabalho de PTx, misture 97 µ l de PBS estéril com 3 µ l de solução-mãe de PTx (300 ng/100 µ l) por mouse (para uso de injeção intraperitoneal uma agulha 30 x ½'' (0,3 x 13 mm)).
  2. Indução de EAE
    1. ANESTHETIZE camundongos C57BL/6 com isofluorano, usando um sistema de evaporação. Para induzir anestesia em camundongos, expor o mouse para isofluorano 4,5% de oxigênio em uma câmara de incubação pequeno antes de transferir o mouse para uma máscara com 2,1% isofluorano. Use uma unidade de anestesia equipada com almofada de aquecimento para evitar a hipotermia do mouse.
    2. Corrigir o mouse anestesiado em uma mão e primeiro injetar 30 µ l de MOG35-55/CFA-emulsão por via subcutânea em flancos pata traseira (Figura 1:1 + 2; no total 60 µ l; esquerda flanco 30 µ l e flanco direito 30 µ l) em estreita proximidade com os linfonodos inguinais.
    3. Posicione o mouse na sua barriga e injetar 20 µ l de MOGaa35-55/CFA-emulsão para o esquerda e bem macio tecido adiposo na raiz da cauda (Figura 1:3 + 4; no total 40 µ l; lado direito e lado esquerdo cauda raiz 20 µ l de cauda raiz 20 µ l) e uma pequena gota de int MOGaa35-55/CFA-emulsão o pescoço do mouse (Figura 1: 5).
    4. 100 µ l de solução de PTx intraperitonealmente injete o mouse. Segure a cabeça do rato abaixo do centro do corpo evitando a injeção para o intestino.
    5. Substituir a dieta de manutenção (extrudate principais nutrientes: 18,5% de proteína bruta; gordo cru 4,5% 4,5% de fibra bruta; cinzas brutas 6,5%; 35% de amido; energia metabólica: 13.1 MJ/kg) para reprodução de dieta (extrudate principais nutrientes: 23,5% de proteína bruta, gordura bruta 5,5%; 3% de fibra bruta; cinza total 5,7%; 36% de amido; energia metabólica: 14.3 MJ/kg) a fim de fornecer os ratos com alimentos de maior teor de energia antes e durante a doença clínica esperada.
    6. Remover a máscara facial e transferir o mouse para sua gaiola em casa com uma almofada de aquecimento. Certifique-se que o mouse está totalmente acordado e motile após 10 minutos.
    7. Repeti a PTx injecção (2.2.4) 48 h após o primeiro tratamento.

3. Pontuação de ratos EAE

  1. Verificar o status de saúde dos ratos EAE todas as manhãs, dando uma olhada dentro de jaulas.
  2. Marca os ratos EAE todas as tardes.
  3. Leve todos os ratos individuais incluídos no experimento EAE fora da gaiola e verificar se a cauda tem tônus movendo-a para cima com um dedo. Um rato saudável prosseguirá sua cauda (cauda tem um tônus). EAE clínico foi iniciado, o tônus da cauda se inferior, visível por uma diminuição gradual da cauda. Eventualmente o mouse não será capaz de levantar a cauda em tudo.
  4. Coloque cada rato individual incluído no experimento EAE no banco limpo e observar e documentar o comportamento ambulante. Consulte a tabela 115 por critérios de Pontuação para a avaliação da severidade da doença (o placar EAE).
  5. Avaliar e documentar o peso de cada rato incluído no experimento.
  6. Para garantir uma alimentação adequada e absorção de água pelos ratos, exibindo uma clínica EAE Pontuação de 1 fornecer alimento umedecido em um prato de plástico na parte inferior da gaiola e atualizar diariamente.

4. ensaio de permeabilidade In vivo

  1. Preparações de soluções:
    1. Para soluções estoque de dextrano, dissolvem-se 10 mg de 10 kDa dextrano Alexa Fluor 488, bem como 3 kDa dextrano Texas Red em 500 µ l de solução de cloreto de sódio 0,9% (20 mg/mL).
    2. Para a solução de trabalho de dextrano, apenas antes da injeção Pipetar 55 µ l de 10 kDa dextrano Alexa Fluor 488 estoque (20 mg/mL) de solução em um pedaço de filme de selagem e adicionar 55 µ l de 3 kDa dextrano solução Vermelho Texas (20 mg/mL). Misture e coletar 100 µ l em uma seringa descartável fina (concentração final de 2 mg/100 µ l).
    3. Para a solução de estoque de formaldeído (PFA) 10%, combinar 10g de PFA extra pura em pó, 100 mL de PBS e 200 µ l de NaOH 1N num copo de vidro limpo e calor até precisamente de 56 ° C sob agitação utilizando um agitador magnético; manter a 56 ° C por 30 min até que o PFA é completamente dissolvido; arrefecer à temperatura ambiente; ajustar o pH para 7,4; e filtrar através de um filtro de papel. Loja a - 20 ° C. A solução pode ser diluída ainda mais usando a PBS.
  2. Em breve anestesia saudável C57BL/6 ratos ou camundongos C57BL/6, sofrendo de EAE com isoflurano (o mouse será sedado por aproximadamente 1 min). Use um sistema automatizado como na etapa 2.2.1 (ratos serão expostos a 4,5% de isoflurano em oxigênio em uma câmara de indução e depois transferidos para uma máscara com 2,1% de isoflurano).
  3. Coloque o mouse anestesiado em posição lateral, em cima da mesa, então por via intravenosa (por exemplo, retrô-orbitally) 100 µ l de traçadores fluorescentes injetar o rato antes que o mouse acorde.
  4. Imediatamente remover a máscara e certifique-se de que o mouse está totalmente acordado e motile após a anestesia curta. Deixe o marcador circular por 15 min.
  5. Prossiga com a etapa 5.1.

5. perfusão de ratos

  1. Para avaliação da permeabilidade in vivo:
    1. Iniciar o procedimento de 15 min após a injeção do traçador fluorescente através da indução de anestesia profunda isoflurano. Para induzir anestesia profunda em camundongos usar 2,3% de isoflurano em oxigênio. Use o reflexo de retirada de pata para julgar a profundidade da anestesia (beliscar a pele entre os dedos; falta de flexão indica uma profundidade suficiente) e sonda os reflexos de tanto o membro anterior e o membro posterior de ratos submetidos a EAE.
    2. Corrigir o mouse em suas costas e pulverizar a barriga com etanol. Abra o tórax usando uma tesoura e retirar o diafragma. Abra o átrio direito do coração batendo usando uma tesoura e perfundir o mouse através do ventrículo esquerdo do coração, com 10 mL de PBS, seguido por 10 mL de 4% PFA em PBS.
      Cuidado: Para evitar a inalação de PFA, perfundir o mouse em uma coifa.
    3. Prossiga para a seção 6.
  2. Para em situ zimografia:
    1. Induzir a anestesia profunda isoflurano utilizando isoflurano 2,3% de oxigênio em um rato sofrendo de EAE e verifique a profundidade da anestesia como na etapa 5.1.1.
    2. Em seguida, corrigir o mouse em suas costas e pulverizar a barriga com etanol. Abra o tórax usando uma tesoura e retirar o diafragma. Abra o átrio direito do coração batendo usando uma tesoura e perfundir o mouse através do ventrículo esquerdo do coração com 20 mL de PBS.
    3. Prossiga para a seção 6.

6. dissecção e congelamento do cérebro

  1. Preparação do banho de arrefecimento:
    1. Encher um recipiente de dewar plana com gelo seco picado e adicionar 2-methylbutane (isopentano) até que o líquido atinge cerca de 1 cm acima do bloco de gelo seco. Cubra com uma tampa solta – por exemplo, uma capa de um balde de gelo.
  2. Cortar a cabeça do rato perfundido com tesoura afiada e retire a pele e as orelhas usando um conjunto menor de tesoura.
  3. Disse cuidadosamente o solidéu por corte a partir do foramen magnum na frente à esquerda e à direita, permitindo o solidéu upfold sobre o cérebro. Em seguida, levante com cuidado para fora o cérebro intacto da base do crânio enquanto separando os nervos ópticos, usando uma espátula metálica plana.
  4. Coloque o cérebro em papel alumínio e corte do cérebro em três pedaços (cérebro frontal, meio cérebro e cerebelo + tronco cerebral), colocando dois cortes coronais.
  5. Preencher um cryomold (25 x 20 x 5 mm) para o primeiro trimestre com matriz de corte (O.C.T.) de temperatura ideal, coloque fatias do cérebro com o lado anterior de cada pedaço de cérebro virado para baixo para a cryomold e cobrir o tecido completamente com matriz O.C.T..
  6. Coloque o cryomold com o tecido em uma orientação horizontal para o banho de 2-Methylbutane e certifique-se de que o tecido congela do fundo ao topo dentro de 1 minuto, evitando mergulhando o bloco de tecido todo o banho.
  7. Transferência de tecido congelado a-80 ° C para armazenamento e proceda à seção 7.

7. preparação de seções do tecido congelado

  1. Equilibrar a temperatura do tecido congelado de-80 ° C a-20 ° C em criostato por 30 min.
  2. Remover o bloco do tecido do cryomold e monte sobre o suporte do tecido do criostato (conjunto de-15 ° C) usando a matriz O.C.T..
  3. Aparar as arestas do bloco de tecido sobre o titular do criostato com um bisturi afiado e começar a cortar o bloco de tecido, removendo a 20 µm de seções com a faca do criostato até que o tecido é visível.
  4. Para a análise de permeabilidade in vivo do BBB:
    1. 6-10 µm tecido seções de corte, recolhê-los em lâminas de vidro de adesão e imagem imediatamente as seções cobertas com cobertura usando um microscópio de fluorescência.
    2. Avalie o aparecimento de vasos sanguíneos no cérebro (preste atenção ao acentuado bordas de não-vazamento vasos sanguíneos comparados para difundir os padrões de fluorescência observados para as embarcações de sangue pingando). Como controle positivo, verifique se o escapamento do traçador no estroma dos órgãos circunventriculares ou plexo coroide, que falta um BBB.
  5. Para em situ zimografia:
    1. Corte 6 µm histologicos usando um criostato, recolhê-los em lâminas de vidro de adesão e congelar os cortes histologicos a-20 ° C em uma caixa de congela contendo gel de silicone na tampa.

8. em situ zimografia combinado com mancha da imunofluorescência laminina/CD45

  1. Preparo de soluções:
    1. Prepare a solução de incorporação:
      1. Misture 6 g de glicerol (qualidade analítica), 2,4 g de poli (álcool vinílico), 6 mL de ddH2O e 12 mL de tampão Tris de 0,2 M, pH 8 e agitar (agitador magnético) a solução para 4h no RT
      2. Transferir a solução para um tubo de centrífuga de 50 mL e deixá-lo descansar por 2 h no RT Posteriormente, incube a solução por 10 min a 50 ° C (banho-maria) e centrifugar por 20 min a 2.700 x g, à temperatura ambiente.
      3. Pegue o sobrenadante e congelar em alíquotas a-20 ° C.
    2. Prepare a solução de gelatina fria:
      1. Dissolva 0,1 g de gelatina fria de pele bovina em 10 mL de ddH2O.
      2. Deixá-lo de molho pelo menos 1 dia e armazenar alíquotas a 4 ° C.
    3. Prepare o gelado metanol (-20 ° C):
      1. Colocar 100% de metanol em uma jarra de coplin e esfriar até-20 ° C.
    4. Prepare a solução-mãe de azida de sódio 10%:
      1. Adicionar 1 g de azida de sódio a 10 mL de ddH2O e armazenar à temperatura ambiente.
    5. Prepare a solução de trabalho de azida de sódio 0,1%:
      1. Mix 99 µ l dos ddH2O com 1 µ l de solução-mãe de azida de sódio 10%.
    6. Dissolver 1 mg de fluoresceína conjugada tintura-extinto (DQ) gelatina de pele de porco em 1 mL de azida de sódio trabalhando solução e loja 100 alíquotas µ l protegidas da luz a 4 ° C.
    7. Dissolver 30 mg de 1,10-fenantrolina monohidratada em 76 µ l de etanol e loja a-20 ° C.
    8. Prepare 25 x solução de inibidor de protease:
      1. Adicione 1 comprimido de inibidor de protease livre de EDTA a 2 mL de ddH2O. Loja a-20 ° C.
    9. Imediatamente antes da utilização, prepare a solução de reação (150 µ l/seção):
      1. Centrifugue a 1 mg/mL solução de gelatina DQ por 5 min a 13.300 x g.
      2. 127.2 Mix µ l de ddH2O 15 µ l de 10 x amortecedor da reação (Kit de ensaio Gelatinase/colagenase; ver Tabela de materiais), 0,3 µ l de gelatina fria de 20 mg/mL, 1,5 µ l de gelatina DQ 1 mg/mL e 6 µ l de 25 x solução de inibidor de protease.
    10. Imediatamente antes da utilização, prepare a solução de reação de controlo negativo phenantroline (150 µ l/seção):
      1. 125.2 Mix µ l de ddH2O 15 µ l de 10 x amortecedor da reação, 0,3 µ l de gelatina fria de 20 mg/mL, 1,5 µ l de gelatina DQ 1 mg/mL, 6 µ l de 25 x inibidor de protease EDTA livre e 2 µ l de 2m 1,10-phenantroline (inibidor MMP).
    11. Imediatamente antes da utilização, prepare solução de reação de controlo negativo (não-fluorescente) gelatina fria (150 µ l/seção):
      1. Mix 128,7 µ l de ddH2O, 15 µ l de buffer de reação de 10x, 0,3 µ l de gelatina fria de 20 mg/mL e 6 µ l de inibidor de protease de 25 x livre de EDTA.
    12. Preparar o anticorpo primário cocktail para counterstaining, por exemplo, 0,95 anticorpo antilaminina polyclonal µ g/mL e anticorpo de anti-CD45 polyclonal rato 10 µ g/mL em 1% de BSA em PBS e preparem-se apropriado do isotipo controle coquetéis de anticorpo primário.
    13. Preparar a solução de anticorpo secundário, por exemplo, 7,5 µ g/mL Cy3 cabra anti-rato + 15 µ g/mL anticoelho AMCA em BSA 1% em PBS (proteger da luz).
  2. Descongelar a 6 seções do tecido cerebral não fixa µm de ratos EAE dentro da caixa de congelação plástico contendo gel de silicone na tampa em uma coifa para evitar a retenção de água no tecido e 2 secções de tecido em uma corrediça, separadas por linhas de desenho com uma água repelindo a caneta
  3. Preparar soluções de reação (8.1.9-8.1.11 de passos), centrifugue por 5 min a 13.400 x g em temperatura ambiente e pre-quente a 37 ° C, utilizando um banho de água.
  4. Hidratar as seções de tecido por 5 min a 37 ° C, utilizando o tampão de reação 1x. Em seguida, despeje o tampão de reação 1x, adicionar solução de reação sobre as secções de tecido e incubar durante 4 h a 37 ° C. Lave slides 5 vezes em ddH2O.
  5. Corrigir as seções por 5 min com metanol gelada a-20 ° C e depois lavar seções uma vez com PBS em temperatura ambiente.
  6. Adicionar 1% de BSA em PBS para as seções e incubar durante 20 min em temperatura ambiente (proteger da luz). Em seguida, descartar BSA 1% em PBS das seções lançando os slides sobre o tecido, adicione o cocktail de anticorpo primário e incubar por 1h à temperatura ambiente (proteger da luz).
  7. Lavar as seções duas vezes com PBS, adicione o cocktail de anticorpo secundário e incubar por 1h à temperatura ambiente (proteger da luz).
  8. Lave as seções duas vezes com PBS, montar as lâminas com solução de incorporação, deixe seções montadas secar durante a noite em temperatura ambiente (proteger da luz). Finalmente, analise o tecido manchado seções usando um microscópio fluorescente.

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Resultados

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Avaliação do curso clínico da EAE em camundongos C57BL/6 deve resultar em uma curva de doença, conforme representado na Figura 2A e mudanças no peso do corpo do mouse conforme apresentado na Figura 2B. C57Bl/6 ratos imunizados com MOGaa35-55 geralmente começam a desenvolver sintomas da doença em torno de 10 a 12 dias após a imunização ativa (figura 1A). Normalmente, ratos imunizados mostram uma queda transitória de peso corporal no ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir e monitorar EAE em camundongos C57BL/6 fêmeas. As fêmeas são preferencialmente escolhidas, e há uma incidência de mulheres: os homens de 3:1 em MS. Para avaliar a gravidade da EAE, fizemos uso de uma folha de Pontuação de 3 pontos. Severidade da EAE geralmente é marcada em relação a gravidade das disfunções motor. Ratos com avançados estágios da EAE, ou seja, exibir uma pontuação acima de 2 deve ser sacrificado para evitar o sofrimento desnecessário dos animais. Assim, recomen...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reconhecemos com gratidão Lydia Sorokin, quem tem compartilhado seu original em situ zimografia protocolo10 conosco.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anticorpo anti-coelho AMCAJackson ImmunoResearch111-156-045Loja em 4 ° C; proteger da luz
Anti-CD45 Anticorpo (30F11)Pharmingen07-1401Armazene em 4 ° C
Anti-Laminina AnticorpoDAKOZ0097Loja em 4 ° C
Alimentos de reproduçãopor exemplo, PROVIMI KLIBA SA3336
Gaiolas ventiladas individualmente, linha azul Tipo II ou III,por exemplo, Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fração VApplichemA1391Armazenar em 4 ° C
Gelatina friaSigma-AldrichG 9391
Frasco Coplin + rack, por exemplo, Carl Roth GmbH + Co. KGH554.1; H552.1
Cy3 anti-rato anticorpoJackson ImmunoResearch111-156-144Loja em 4 ° C; proteger da luz
Lamínulas 24 x 40 mm # 1por exemplo, Thermo Scientific85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10.000 MW)por exemplo, Sondas molecularesD22910Armazenar em -20 ° C; proteger da luz
Dextran Texas Red (3000 MW)InvitrogenD3328Armazenar a -20 &graus; C; proteger da luz Kit de
Ensaio de Gelatinase/Colagenase EnzChek Thermo Fisher Científico; EnzCheckE12055Loja a -20 ° C; proteger da luz
Camundongos fêmeas C57BL/6J (8-12 semanas),por exemplo, Janvier LabsFêmeas, 8-12 semanas
’ ’ (1,2 mm x 40 mm) agulha de injeção, por exemplo, BD, BD Microlance 3304622
27G x ¾ ’ ’ – Agulha de injeção Nr. 20 (0,4mm x 19mm)por exemplo, BD, BD Microlance 3302200
30G x ½ ’ ’ (0,3 mm x 13 mm) agulha de injeção, por exemplo, BD, BD Microlance 3304000
Freund incompleto' adjuvante (IFA)e.g. Santa Cruz Biotechnologysc-24648Loja em 4° C
Alimentos de manutenção, por exemplo, PROVIMI KLIBA SA3436
MOGaa35-55 peptídeo, por exemplo, GenScriptStore em -80 ° Lâminas
microscópio C (Superfrost Plus)Thermo ScientificJ1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA, por exemplo, BD231141Armazenar em 4 ° C 
NaCl 0,9 %B. Composto 3535789
O.C.T. da Braun (Tissue-Tek)Sakura4583
Omnican 50 30G x ½ ’ 'B. Braun9151125S
ParaformaldeídoMerck30525-89-4
Toxina da coqueluchepor exemplo, List biological laboratories, Inc.180Loja em 4 > C
poli (álcool vinílico) (Mowiol 4-88)Sigma-Aldrich81381
Inibidor de Protease livre de EDTA (Roche)Sigma-Aldrich4693132001Loja em 4 ° C
repelente, por exemplo, DAKO Pen,por exemplo, DAKOS2002
filme de vedação, por exemplo, Parafilm M, por exemplo, Sigma-AldrichP7793
Gel de sílicapor exemplo, Carl Roth GmbH + Co. KG9351.1
Tesoura de costuraFST15012-12
seringa de 1 ml, por exemplo, PRIMO62.1002
seringa de 10 ml, por exemplo, CODAN Medical Sistema2022-05
Univentor 400UNO. Bv
, , Caixa de congelamento para lâminas histológicas, por exemplo, Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1 18G x 1½ de , caneta , , vaporizador ApS

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363(2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

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