Visualizando o comprometimento das barreiras endoteliais e Glial da unidade Neurovascular durante encefalomielite auto-imune Experimental In Vivo

Resumo

Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.

Resumo

A unidade neurovascular (NVU) é composta por células endoteliais microvasculares, formando a barreira hemato - encefálica (BBB), uma membrana basal endotelial com pericitos incorporados, e o limitans glia composta pela membrana basal parenquimatosa e hamartomas final-feed abraçando o aspecto abluminal do microvessels do sistema nervoso central (SNC). Além de manter o CNS homeostase o NVU controla tráfico de células imunes para o CNS. Durante immunosurveillance do SNC baixos números de linfócitos ativados podem atravessar a barreira endotelial sem causar disfunção BBB ou doença clínica. Em contraste, durante neuroinflammation tais como esclerose múltipla ou seu modelo animal encefalomielite auto-imune experimental (EAE) um grande número de células do sistema imunológico pode atravessar o BBB e, posteriormente, o limitans de glia eventualmente alcançando o parênquima do CNS levando a doença clínica. Migração de células imunes para o parênquima do CNS é, portanto, um processo de duas etapas que envolve uma migração sequencial através da barreira endotelial e glia do NVU empregando mecanismos moleculares distintos. Se após a sua passagem através da barreira endotelial, células T encontram seu antígeno cognato em células apresentadoras de perivascular sua reativação local irá iniciar mecanismos subsequentes, levando à ativação focal de gelatinases, que permitirá que as células T para atravessar a barreira glia e insira o parênquima do CNS. Assim, avaliar tanto, permeabilidade BBB e atividade da MMP na correlação espacial ao acúmulo de células imunes no SNC durante EAE permite especificar a perda da integridade das barreiras endoteliais e gliais do NVU. Aqui mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa e como analisar posteriormente permeabilidade BBB in vivo usando uma combinação de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos ainda mais, como Visualizar e localizar gelatinase atividade no cérebro de EAE por zymogaphy in situ, acoplada à imunofluorescência citológicas de membranas de porão do BBB e CD45 + invadindo as células imunes.

Introdução

Sistema nervoso central (SNC) coordena todas as funções mentais em vertebrados e corpo, e homeostase do CNS é essencial para uma comunicação adequada dos neurônios. Homeostase do CNS é garantido pela unidade neurovascular (NVU), que protege o CNS de meio de mudança do fluxo de sangue. O NVU é composto de CNS microvascular em células endoteliais, que são bioquimicamente únicos e estabelecer a barreira hemato - encefálica (BBB) em interferência contínua com pericitos, astrócitos, neurônios e componentes da matriz extracelular (ECM), que estabelece dois membranas de porão distintas¹. A membrana basal endotelial que ensheathes o aspecto abluminal d....

Protocolo

Todos os estudos foram conduzidos sob as diretrizes de acordo com a legislação Suíça relativa à protecção dos animais e foram aprovados pelo Instituto veterinário no Cantão de Berna, Suíça (números de permissão: BE 31/17 e ser 77/18).

1. habitação de camundongos C57BL/6 em condições (SPF) livre de patógeno específico

1. Ciclo de casa os ratos em gaiolas ventiladas individuais com 12/12 h claro-escuro. Providenciar comida e água ad libidum. Para supervisionar a qualidade microbiológica dos ratos, a coorte experimental foi submetido a monitoramento de integridade trimestral por roupa de cama suja sentinelas FELASA recomendações

Resultados

Avaliação do curso clínico da EAE em camundongos C57BL/6 deve resultar em uma curva de doença, conforme representado na Figura 2A e mudanças no peso do corpo do mouse conforme apresentado na Figura 2B. C57Bl/6 ratos imunizados com MOGaa35-55 geralmente começam a desenvolver sintomas da doença em torno de 10 a 12 dias após a imunização ativa (figura 1A). Normalmente, ratos imunizados mostram uma queda transitória de peso corporal no .......

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo para induzir e monitorar EAE em camundongos C57BL/6 fêmeas. As fêmeas são preferencialmente escolhidas, e há uma incidência de mulheres: os homens de 3:1 em MS. Para avaliar a gravidade da EAE, fizemos uso de uma folha de Pontuação de 3 pontos. Severidade da EAE geralmente é marcada em relação a gravidade das disfunções motor. Ratos com avançados estágios da EAE, ou seja, exibir uma pontuação acima de 2 deve ser sacrificado para evitar o sofrimento desnecessário dos animais. Assim, recomen.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-coelho AMCA	Jackson ImmunoResearch	111-156-045	Loja em 4 ° C; proteger da luz
Anti-CD45 Anticorpo (30F11)	Pharmingen	07-1401	Armazene em 4 ° C
Anti-Laminina Anticorpo	DAKO	Z0097	Loja em 4 ° C
Alimentos de reprodução	por exemplo, PROVIMI KLIBA SA	3336
Gaiolas ventiladas individualmente, linha azul Tipo II ou III,	por exemplo, Tecniplast	1145T, 1285L
BSA fração V	Applichem	A1391	Armazenar em 4 ° C
Gelatina fria	Sigma-Aldrich	G 9391
Frasco Coplin + rack	, por exemplo, Carl Roth GmbH + Co. KG	H554.1; H552.1
Cy3 anti-rato anticorpo	Jackson ImmunoResearch	111-156-144	Loja em 4 ° C; proteger da luz
Lamínulas 24 x 40 mm # 1	por exemplo, Thermo Scientific	85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10.000 MW)	por exemplo, Sondas moleculares	D22910	Armazenar em -20 ° C; proteger da luz
Dextran Texas Red (3000 MW)	Invitrogen	D3328	Armazenar a -20 &graus; C; proteger da luz Kit de
Ensaio de Gelatinase/Colagenase EnzChek	Thermo Fisher Científico; EnzCheck	E12055	Loja a -20 ° C; proteger da luz
Camundongos fêmeas C57BL/6J (8-12 semanas),	por exemplo, Janvier Labs	Fêmeas, 8-12 semanas
’ ’ (1,2 mm x 40 mm) agulha de injeção	, por exemplo, BD, BD Microlance 3	304622
27G x ¾ ’ ’ – Agulha de injeção Nr. 20 (0,4mm x 19mm)	por exemplo, BD, BD Microlance 3	302200
30G x ½ ’ ’ (0,3 mm x 13 mm) agulha de injeção	, por exemplo, BD, BD Microlance 3	304000
Freund incompleto' adjuvante (IFA)	e.g. Santa Cruz Biotechnology	sc-24648	Loja em 4° C
Alimentos de manutenção	, por exemplo, PROVIMI KLIBA SA	3436
MOGaa35-55 peptídeo	, por exemplo, GenScript		Store em -80 ° Lâminas
microscópio C (Superfrost Plus)	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA	, por exemplo, BD	231141	Armazenar em 4 ° C
NaCl 0,9 %	B. Composto 3535789
O.C.T. da Braun (Tissue-Tek)	Sakura	4583
Omnican 50 30G x ½ ’ '	B. Braun	9151125S
Paraformaldeído	Merck	30525-89-4
Toxina da coqueluche	por exemplo, List biological laboratories, Inc.	180	Loja em 4 > C
poli (álcool vinílico) (Mowiol 4-88)	Sigma-Aldrich	81381
Inibidor de Protease livre de EDTA (Roche)	Sigma-Aldrich	4693132001	Loja em 4 ° C
repelente, por exemplo, DAKO Pen,	por exemplo, DAKO	S2002
filme de vedação, por exemplo, Parafilm M	, por exemplo, Sigma-Aldrich	P7793
Gel de sílica	por exemplo, Carl Roth GmbH + Co. KG	9351.1
Tesoura de costura	FST	15012-12
seringa de 1 ml	, por exemplo, PRIMO	62.1002
seringa de 10 ml	, por exemplo, CODAN Medical Sistema	2022-05
Univentor 400	UNO. Bv

, , Caixa de congelamento para lâminas histológicas, por exemplo, Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1 18G x 1½ de , caneta , , vaporizador ApS