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Artigo de método

Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

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DOI:

10.3791/59253

⸱

13 de abril de 2019

 , 
1Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University

Neste artigo

Resumo

Descrevemos aqui a elevado-throughput detecção e quantificação de oligossacarídeos de leite humano de fucosilado (HMOs) usando um biossensor de células inteiras. Também demonstramos aqui, a adaptação desta plataforma para análise de cepas de produção de HMO, com foco na melhoria da relação sinal / ruído.

Resumo

Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são componentes de hidrato de carbono complexo do leite materno que exibem abundantes benefícios na saúde infantil. No entanto, otimização de sua síntese biotecnológica é limitada pela relativamente baixa taxa de transferência da deteção e quantificação de monossacarídeo e ligações. Técnicas convencionais de análise de glicano incluem métodos cromatográficos/massa-espectrometria com taxa de transferência na ordem de centenas de amostras por dia sem automação. Aqui, demonstramos um biossensor bacteriano geneticamente codificado para a elevado-throughput, enlace específico detecção e quantificação das estruturas fucosilado HMO, 2'-fucosyllactose e 3-fucosyllactose, que alcançamos através de heteróloga expressão de fucosidases. Como a presença de lactose no leite ou em processos biotecnológicos poderia levar a falsos positivos, demonstraremos também a redução do sinal de lactose usando diferentes estratégias. Devido a alta taxa de transferência desta técnica, muitas condições de reação ou parâmetros de biorreator podem ser analisados em paralelo em questão de horas, permitindo a otimização da fabricação de HMO.

Introdução

Oligossacarídeos de leite humano (HMOs) são derivados de lactose oligossacarídeos, geralmente composto por monômeros de açúcar de três a oito. Eles têm uma redução de lactose (Gal-β1, 4-Glc) terminam e são mais alongados por ligações glicosídicas (β-1,3 - ou β-1,6-) para glicose (Glc), galactose (Gal) ou N-acetilglicosamina (GlcNAc). Além disso, a fucose (Fuc, α-1,2 - ou α-1,3-) ou ácido siálico (Sia ou NeuAc, α-2,3 - ou α-2,6-) resíduos são frequentemente adicionados1.

Análise atual de oligossacarídeos e outros carboidratos é limitada em escopo e throughput pela necessidade de espectrometria cromatográfica/de massa (MS) tecnologia2,3,4,5, 6 , 7, que pode demorar mais ou menos uma hora por exemplo, para não mencionar a necessidade de equipamento caro, colunas especializadas e agentes derivatizing e conhecimentos sobre o funcionamento deste equipamento8. Ligações de oligossacarídeo são particularmente difíceis de determinar, exigir avançado MS9,10 ou de técnicas de ressonância magnética nuclear (NMR)11. Otimização rápida da síntese desses oligossacarídeos assim é limitada pela taxa de transferência deste passo lento e analítico.

Neste estudo, demonstramos a deteção de ligação específica de fucosilado trissacarídeo baseada em lactose planos de saúde, enfocando o 2'-fucosyllactose (2'-FL) que é o HMO mais abundante no leite humano, usando um geneticamente codificado toda célula Escherichia coli Biosensor com um limite de detecção em 4 mg/L. Uma característica importante deste biosensor é sua capacidade de distinguir entre trissacarídeos isoméricos. O princípio de projeto baseia-se na expressão de fucosidases específico em e. coli que liberar à lactose de planos de saúde, cuja presença é detectada pelo operon lac , que por sua vez, gera um sinal fluorescente. Conseguimos isso através da construção de um sistema de dois-plasmídeo, um abrigando o enlace específico fucosidase e o outro uma proteína fluorescente repórter. Esta plataforma de biosensor é apropriada para seleção da elevado-produção por citometria de fluxo ou leitor de microplaca. Também demonstramos a utilização do biosensor para quantificar o 2'-FL produzido por uma cepa de engenharia12. Dentro deste estudo, também apresentamos três estratégias na remoção seletiva de lactose que pode resultar em falso sinal positivo do biosensor, dado que a tensão de engenharia produtor é cultivada em lactose.

Os biosensores geneticamente codificados tomados em conjunto, permitem-nos detectar e quantificar a planos de saúde de uma forma de ligação específica, que é difícil mesmo com cromatografia em fase gasosa, MS, ou NMR técnicas. Devido a sua alta produtividade e facilidade de uso, este método deve ter difundidas aplicações na engenharia metabólica e síntese dos planos de saúde.

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Protocolo

1. condições de cultura e indução de célula

Nota: Nos experimentos seguintes, três cepas são utilizadas: Escherichia coli BL21 (DE3) com um vetor vazio, Escherichia coli BL21 (DE3) com plasmídeos pAfcA14 e pET28:green proteína fluorescente (GFP) e Escherichia coli BL21 (DE3) com plasmídeos pAfcB14 e pET28:GFP. Todas as cepas são cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) ou media mínimos com antibióticos apropriados. Prepare soluções estoque de 1.000 x canamicina (50 mg/mL) e carbenicilina (100mg/mL) em deionizada (DI) de água.

  1. Preparação de meios de comunicação
    1. Prepare a LB mídia adicionando 25g de LB estoque de pó para 1 litro de água DI. Autoclave a 121 ° C por 20 min esterilizar a solução de. Espere até a temperatura de mídia LB esterilizada é inferior a 60 ° C, antes da adição de 1 µ l de estoque de antibiótico para cada 1 mL de LB mídia.
    2. Para preparar placas LB, adicione o ágar 15 g à mídia LB antes da esterilização. Espere até a temperatura de ágar LB esterilizada é inferior a 60 ° C, antes da adição do antibiótico.
    3. 1.1.3 para as células biosensing, prepare mídia ou placas com antibióticos duas, canamicina e carbenicilina.
  2. Indutores de hidrato de carbono
    1. Preparar soluções estoque das indutores de carboidratos no molares equivalentes a 20 g/L de lactose: 29 g/L de 2'-FL e 3-FL.
      Nota: Cada 200 µ l de células exigirão 20 µ l de 2'-FL ou 3-FL.
    2. Induzir a 200 µ l de células com concentração final de 2,0 g/L de lactose ou 2,9 g/L de concentração final de 2'-FL/3-FL. Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e deixe as culturas a crescer durante a noite.
  3. Cultura celular
    1. No dia anterior a semente do experimento 5 mL de LB suplementado com canamicina e carbenicilina de uma colônia bacteriana fresca, utilizando uma técnica estéril.
    2. Incubar as culturas a 37 ° C, com agitação e crescem as culturas durante a noite.
    3. Transferi 50 µ l de cultura durante a noite para 5 mL de fresco LB/M9 mídia com canamicina e carbenicilina. Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e crescer até cultura chegou a densidade óptica em 600 nm (OD600) de 0,5-0,7. Nesta fase de log de mid, as células podem ser induzidas.

2. medida da fluorescência e limites de detecção

  1. Preparação de células por citometria de fluxo
    1. Transferi as culturas durante a noite para tubos de 1,5 mL e centrifugar 12.500 x g por 1 min.
    2. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 µ l de 1 x fosfato salino (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM de NaCl em água DI, pH 7,2) para preparar uma suspensão de célula única e transferir a única célula suspensão de tubos de citometria de fluxo de 5 mL.
    3. Manter as células no escuro a 4 ° C até rodando as amostras em um citômetro de fluxo. Para melhores resultados, analise as células mais rapidamente possível.
    4. Selecione 488 nm do laser para excitar a GFP. Recolha os níveis de fluorescência fluoresceína isotiocianato (FITC) (20.000 – 40.000 eventos, gated para dispersão de frente e lateral evitar detritos e agregados de células) com um filtro de passa-banda 525/50 nm.
  2. Calibrando o biosensor
    1. Para fazer uma curva de calibração, faça diluições de 8 – 10 de padrão 2'-FL na escala 0 – 2.500 mg/L.
    2. Cultura de células de biosensing o 2'-FL (contendo pAfcA e pET28:GFP) e induzi-los com as diluições padrão, conforme descrito anteriormente na seção 1.3. Realize três repetições biológicas para cada diluição.

3. detecção e quantificação de 2'-FL em uma cepa de produtor

  1. Cultivo da estirpe de produtor
    1. Para fazer a media mínimos, preparar soluções separadas de 1 M K2HPO4, Filipa4·7H2O, citrato de sódio e 1 M de tiamina-HCl. esterilizar as soluções usando um filtro de 0,22 µm. Misture M9 mídia pó de caldo com 1 L de água DI. Autoclave a solução M9 a 121 ° C durante 15 min. esfriar a solução até 50 ° C. Adicione MgSO4, CaCl2, K2HPO4, Filipa4·7H2O, citrato de sódio e tiamina para concentrações finais de 2mm, 0,1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L e 7,5 µ g/L, respectivamente.
    2. Inicie uma cultura de 2'-FL produzir tensão, por exemplo, JM109 gwBC-F2, em 5 mL de LB mídia e deixá-lo crescer durante a noite a 37 ° C, conforme descrito no Baumgartner et al.12.
    3. Subcultura em 1%, conforme descrito anteriormente na etapa 1.3.3 em 250 mL da mídia mínima preparada na etapa 3.1.1. Adicionar o glicerol a uma concentração final de 10 g/L e incubar a cultura a 37 ° C.
    4. Quando a cultura atinge uma OD600 de 0,5-0,7, adicionar isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a uma concentração final de 0.5 mM e lactose para uma concentração final de 2 g/L.
    5. Incubar a 37 ° C, com agitação contínua e permitir culturas cresça para 24 h.
  2. Extração de 2'-FL
    1. Transferi as culturas durante a noite para tubos de 50ml estéril e centrifugar 900 x g por 15 min.
    2. 3.2.2 descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em água DI. Repeti a etapa de lavagem três vezes para remover à lactose residual e finalmente re-suspender em 5 mL de água Desionizada.
    3. Para lisar a suspensão de células, use um sonicador em 30% de energia, em 30 pulsos de s. Manter as células no gelo em todos os momentos.
    4. Centrifugar as células lisadas por 25 min a 2.000 x g. Remover o sobrenadante, passá-lo através de um estéril (por exemplo, de 0,22 µm) filtrar e armazená-lo em 4 ° C até análise.
  3. Quantificação com biosensor
    1. Inocular uma cultura de células de 2'-FL biosensing e no log de meio da fase, induzir com equivalente lisado celular concentrações estimadas de 2'-FL usado para fazer a curva de calibração, conforme descrito na seção 2.2. Executar a calibração no mesmo ambiente que a amostra a analisar (por exemplo, lisado celular total) adicionando diluições de 2'-FL para controle (ou seja, não-produtor) lisado antes de induzir células biosensor filtrado celular.
    2. Execute as amostras em um citômetro de fluxo. Gera uma curva de dose-resposta plotando a saída de fluorescência contra a concentração de oligossacarídeo. Compare a resposta das normas para o lisado celular.

4. seletiva remoção de lactose

Nota: As células biosensing são sensíveis à lactose e é desejável que o biosensor detectar seletivamente a planos de saúde de lactose. Uma estratégia incluiria lavagem de células, conforme descrito na seção 3.2. Três outras estratégias são descritas abaixo.

  1. Tratamento com comercial purificado β-galactosidase
    1. Dissolver o liofilizado β-galactosidase para 1.000 (lactase FCC) unidades/mL, em 1 mM MgCl2 ou uso comercial do β-galactosidase na solução.
    2. Para determinar a concentração óptima de enzima necessária, crescer um inóculo de 2'-FL biosensing células e induzir com lactose 2 g/L e 2,9 g / L 2'-FL em meados fase log.
    3. A 100 culturas µ l, adicionar quantidades variáveis de β-galactosidase, até 12 unidades e deixe as culturas a crescer durante a noite a 37 ° C, com agitação contínua.
    4. Medir a fluorescência, conforme descrito na seção 2.1 e calcular as unidades ideais da enzima necessária pela determinação da concentração mínima de enzima para alcançar a desejada atenuação do sinal.
    5. A 2'-FL produzindo células cultivadas por 24 h, adicionar ideais unidades de β-galactosidase e incubar durante uma noite a 37 ° C. Prossiga com o protocolo para a determinação do título 2'-FL conforme descrito na seção 3.3.
  2. Pré-tratamento com LacZ + tensão
    1. Iniciar uma cultura de 25 mL de 2'-FL produzir tensão e uma vez induzido no log de meio da fase, incubar a cultura a 37 ° C por 24 h.
    2. Inocular uma Escherichia coli BL21 (DE3) cultura em LB, cultivá-la para log de meio da fase a 37 ° C e adicionar 50 mL de cultura (2:1) para a cultura de 24 h.
    3. Incube a 37 ° C por 3 h. prosseguir com o protocolo para a determinação do título 2'-FL conforme descrito na seção 3.3.
  3. Precipitação de lactose com etanol
    Nota: Esta seção é adaptada do Matsuki et al.12.
    1. Iniciar uma cultura de 25 mL de 2'-FL produzir tensão e uma vez induzido no log de meio da fase, incubar a 37 ° C por 24 h.
    2. Adicione dois volumes de etanol 100% para a cultura, agite bem e incubar a 37 ° C por 4 h.
    3. Centrifugar a suspensão de 900 x g durante 15 min. recolher o sobrenadante e incubar durante uma noite a 4 ° C, que precipita a lactose.
    4. Remova a lactose precipitada, passando a solução através de um filtro de papel (11 µm). Recolha o filtrado que é a célula do lisado contendo o 2'-FL, que pode ser quantificada pelo seguinte seção 3.3.

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Resultados

Nós projetamos um biossensor celular específico para o 2'-FL que pode ser usado em conjunto com a produção biotecnológica do oligossacarídeo. Isto baseia-se na clivagem enzimática específica de modificação de açúcares terminais gerando à lactose e, assim, a ativação do operon do lac , levando à expressão de uma proteína fluorescente repórter sob um promotor inducible à lactose, proporcionalmente à quantidade de 2'-FL. Para demonstrar a sua especificidade de ligação, 3-fucosyllact...

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Discussão

Apresentamos uma estratégia de alto rendimento para a detecção de ligação específica de fucosilado oligossacarídeos do leite humano. Isso foi conseguido através da construção de biossensores de célula inteira por engenharia genética de e. coli , que, após indução com os glicanos específicos, responder com um sinal fluorescente. O protocolo também detalhes sobre como o biosensor pode ser usado para detectar e quantificar a planos de saúde em uma estirpe bacteriana metabolicamente engenharia.

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Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização Universidade do estado de Iowa. Fe foi parcialmente financiado pela NSF Trinect Fellowship e Manley Hoppe cátedra. T.J.M. foi parcialmente apoiado pela Karen e Denny Vaughn faculdade Fellowship. Os autores agradecer o Iowa University fluxo Cytometry instituição estadual e do W.M. Keck Metabolomics Research Laboratory para assistência com fluorescência e estudos de LC-MS.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2'-Fucosil-lactose Carbosynth 41263-94-9
3-Fucosil-lactose Carbosynth 41312-47-4
AgarFisher ScientificBP9744500
Cloreto de Cálcio, DihidratadoFisher ScientificC79-500
Carbenicillin Fisher ScientificBP26481
Dextrose (D-Glicose), CitômetroFisher ScientificD16-1
BDFACSCanto Plus RUO
HPLCAgilent Technologies1100 Series HPLC
Coluna de HPLCLunaC18 coluna de fase reversa
CanamicinaFisher Scientific
Caldo LB, Miller Fisher Scientific12-795-027
LactoseFisher Scientific64044-51-5
M9, Sais Minimimais, 5xSigma-AldrichM6030
Sulfato de Magnésio, AnidroFisher ScientificM65-500
MSAgilent TechnologiesArmadilha Seletiva de Massa SL detector
Cloreto de sódioSigma-Aldrich7647-14-5
Fosfato de sódio dibásicoSigma-Aldrich7558-79-4
Fosfato de sódio monobásicoSigma-Aldrich13472-35-0
de Fluxo Anidro11815024

Referências

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939(2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).

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