Method Article

Modelo de matriz extracelular óssea tridimensional para osteossarcoma

DOI:

10.3791/59271

⸱

April 12th, 2019

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O modelo de matriz extracelular (BEM) de osso de osteossarcoma (OS) é bem estabelecida e mostrado aqui. Ele pode ser usado como um andaime apropriado para simulando tumor primário crescimento em vitro e fornecendo um modelo ideal para o estudo da heterogeneidade de mutagénese e histológica do sistema operacional.

Abstract

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Osteossarcoma (OS) é o mais comum e um tumor ósseo primário altamente agressivo. É caracterizado com variações anatômicas e histológicas, juntamente com as dificuldades de diagnósticos ou prognósticos. Sistema operacional é composto por células cancerosas Leishmania e fenotipicamente heterogêneas. Elementos do microambiente ósseo são provou conta para progressão de doença e heterogeneidade do tumor. Matriz extracelular óssea (BEM) retém a matrizes microestrutural e componentes bioquímicos do nativo da matriz extracelular. Este nicho de tecido-específica fornece um andaime favorável e a longo prazo para proliferação e célula OS semeadura. Este artigo fornece um protocolo para a preparação da modelo BEM e sua aplicação mais experimental. OS células podem crescer e se diferenciar em múltiplos fenótipos consistentes com a complexidade histopatológica das amostras clínicas OS. O modelo também permite a visualização de diversas morfologias e sua associação com alterações genéticas e mecanismos reguladores subjacentes. Como homólogo para OS humanos, este modelo BEM-OS pode ser desenvolvido e aplicado para a patologia e pesquisa clínica do sistema operacional.

Introduction

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Osteossarcoma (OS) geralmente ocorre em áreas, a metáfise de ossos longos, um crescimento activo durante a adolescência. Mais de 80% dos sites OS afetados têm preferência para a metáfise da tíbia proximal proximal do úmero e fêmur distal e proximal, correspondente à posição do crescimento placa1. OS compreende vários subtipos de células com propriedades mesenquimais e considerável diversidade nas características histológicas e grau. Evidências suportam as células-tronco mesenquimais (MSCs), cometido precursores de osteoblastos e pericitos como as células de origem2,3,4,5. Estas células podem acumular alterações epigenéticas ou genéticas e dar origem a OS sob a influência de certos sinais microenvironmental de osso. Mecanismos intrínsecos e extrínsecos resultam na instabilidade genômica e heterogeneidade do sistema operacional, com vários fenótipos clínicos e morfológicos6,7. Para terapias individualizadas ou triagem de novas drogas, novos modelos precisam ser gerado para contra heterogeneidade ou outras desordens clínicas.

Sistema operacional é um tumor sólido maligno intra ósseo. A complexidade e a atividade ao redor de elementos do microambiente conferem diferenças fenotípicas e funcionais sobre células do sistema operacional em diferentes locais de um tumor. A matriz extracelular óssea (BEM) fornece um andaime estrutural e bioquímico para deposição mineral e remodelação óssea. A parte orgânica da matriz extracelular (ECM) consiste principalmente de tipo eu colágeno secretado pelas células da linhagem osteoblástica, enquanto sua porção mineralizada é composta de fosfato de cálcio sob a forma de hidroxiapatita8. O papel dinâmico das redes de ECM é regular a adesão celular, diferenciação, cross-talk e tecido função manutenção9.

Desmineralizada BEM e ECM hidrogel tem sido utilizado com sucesso na cultura de pilha e pode aumentar a proliferação de célula10,11. Sintetizado como osso ECM pode regular o tamanho do pool, decisões de destino e progressão da linhagem do MSCs12,13,14. Além disso, resultados provas de sua significância clínica para fornecer atividade osteogênica por processos celulares estimulantes durante o osso formação e regeneração15,16,17.

Neste artigo, o nosso grupo estabelece um modelo modificado e alternativa favorável para tridimensional cultura a longo prazo. OS células injetadas pelo BEM derivado de tecido apresentam um fenótipo de forma heterogénea mesenquimal prontamente em comparação com plásticos culturas bidimensionais. BEM derivado mostrar tecidos homólogos site-specific, sua vantagem dramática como sendo um nicho nativo para ósmio em vitro células e tem um grande potencial em pesquisas teóricas e clínicas de sistema operacional. Esta plataforma BEM caracterizada é simples mas eficiente para a investigação em vitro e pode ser prorrogada em modelagem de vários tipos de câncer.

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Protocol

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Uso e cuidados com animais sejam realizadas de acordo com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório (publicação de NIH NO.80-23, revisto em 1996) após aprovação do Animal ética Comissão de Sun Yat-sen da Universidade.

1. osso preparação

  1. Obter 4 de camundongos BALB/c de 6 semanas de idade (sem exigência de sexo-específico). Eutanásia em um rato assepticamente por deslocamento cervical e corte fresca fíbula, tíbia e fêmur de um membro posterior com tesoura cirúrgica estéril. Retire o tecido epitelial e em seguida retire o máximo de tecido mole quanto possível, usando uma tesoura e pinça.
  2. Lave os ossos da perna com soro fisiológico estéril 10mm tamponado fosfato (PBS) duas vezes para remover o sangue em um prato de 6 cm. Mergulhe os ossos em etanol a 75% por 3 min, em seguida, lave duas vezes com PBS. Os ossos limpos podem ser armazenados em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com PBS estéril a-80 ° C durante meses até necessária.
    Nota: PBS usado em todas as etapas a seguir tem 10 mM PO43−.

2. osso desmineralização e decellularization

  1. Descongelar os ossos congelados à temperatura ambiente e depois congelar novamente a-80 ° C por 1 h. submeta os ossos a mais de 2 – 3 ciclos de gelo-degelo por ataque de Lise e tecido celular.
  2. Incubar os ossos em um tubo de centrífuga de 50ml estéril com 0,5 N HCl durante a noite à temperatura ambiente num agitador de plataforma ou orbital balanço com balanço suave/vibração para assegurar uma cobertura completa e até mesmo dos ossos.
    Nota: Certifique-se de que os ossos estão totalmente imersos durante o movimento no ácido e não se estabelecem durante o processo. O volume da solução de HCl deve ser mais de dez vezes mais que os ossos.
  3. Após descalcificação, decantar a solução de HCl completamente e lave em água corrente por 1 h. Em seguida, lave os ossos duas vezes por 15 min por lavagem com água destilada num balanço agitador de plataforma ou orbital.
    Nota: Certifique-se de remover completamente a solução ou água entre lavagens e após a última lavagem com água destilada.
  4. Extrai os lipídios nos ossos desmineralizados com uma mistura 1:1 de metanol e clorofórmio em um tubo de centrífuga de 50 mL embrulhado com papel alumínio por 1h à temperatura ambiente10.
  5. Em seguida, transferência dos ossos em outro tubo de metanol embrulhado com papel alumínio por 30 min. Retire o metanol completamente e enxágue com água destilada água duas vezes durante 15 minutos, agitando suavemente. Decantar a água de lavagem final e prossiga com as etapas a seguir sob condição estéril.
    Nota: Durante a etapa de extração, luz deve ser evitada para evitar a decomposição de clorofórmio. A mistura pode ser armazenada em recipiente resistente à luz, ou um tubo de centrifugação embrulhado com papel alumínio. Realizar todo o tratamento e lavar passos sob modesta rotação ou movimento de balanço.
  6. Lavar os ossos em um prato de 6cm com PBS estéril por 3 min e depois transferir os ossos para um novo tubo de centrífuga de 50 mL. Adicionar 40 mL estéril 0,05% do trypsin-EDTA (TE) no tubo e incubar os ossos para 23 h numa incubadora de CO2 a 37 ° C18.
  7. Descartar a solução TE e lavar duas vezes com PBS estéril, suplementado com 90 μg/mL ampicilina e 90 canamicina μg/mL. Após decantação final lavar PBS completamente, reabastecer com 40 mL PBS estéril. Lave abundantemente durante 24 horas à temperatura ambiente com suave balançando ou agitando para embeber antibiótico.
    Nota: Todos os PBS estéril usado nesta e as etapas a seguir contém 90 μg/mL ampicilina e 90 canamicina μg/mL. Lavagem da noite sob rotação ou movimento de balanço são executadas para imersão completa de longos períodos com antibióticos para alcançar a esterilização eficaz dos espaços de pore.
  8. Remover a PBS e transfira os ossos para um tubo de centrifugação 50ml fresco cheio de PBS estéril. O preparado desmineralizada e ossos decellularized são chamados de matriz extracelular óssea (BEM) e podem ser armazenados a 4 ° C por 2 meses até necessária.

3. propagação e cultura de células

  1. Tirar o BEM do frigorífico de 4 ° C e mergulhe-a em 75% de etanol por 30 s, em seguida, enxaguar com PBS duas vezes. Transferi o BEM em uma placa de cultura de células limpo 6-poços. Adicione 2 mL meio de cultura completo (Dulbecco modificado médio/F12 da águia (DF12) contendo 5% de soro fetal bovino, 90 de μg/mL ampicilina e 90 canamicina μg/mL). Incubar o BEM durante a noite em uma incubadora de CO2 a 37 ° C.
  2. Obter linhas de célula OS humanas (MNNG/HOS e MG-63). Suspenda a aproximadamente 1.0 x 105 OS células com 100 μL PBS contendo vermelho de fenol como indicador.
    Nota: Para melhor controlar e observar várias camadas células dentro do modelo tridimensional do BEM, MNNG/HOS e MG-63 estão infectadas com o vetor de Lentivirus expressando fluorescente mCherry e proteína verde fluorescente (GFP).
  3. Depois que o BEM é totalmente embebido no meio, injete células OS BEM da epífise proximal ou distal quando a agulha atinge a cavidade medular do BEM. Incubar o modelo OS-BEM durante um período mínimo de 2 h em um umidificado 5% CO2 atmosfera a 37 ° C, para garantir que as células injetadas aderirem firmemente ao BEM.
    Nota: Pré-aquecer todos os meios utilizados para cultura de células. A incubadora usada para cultura de células tem um umidificado 5% CO2 atmosfera a 37 ° C.
  4. Adicionar 1 mL de meio de cultura completo na placa de revestir completamente a superfície da cultura BEM durante a noite em uma incubadora de CO2 a 37 ° C.
  5. Suavemente, transferi o modelo OS-BEM em um novo poço da placa de 6 com uma pinça estéril e refeed 1 mL de meio de cultura fresco. Cultura do modelo durante 14 dias, numa incubadora de CO2 a 37 ° C e refrescar o meio de cultura, de acordo com a situação de proliferação de células do sistema operacional.
  6. Continue monitorando o status médio de cor e células sob o microscópio de fluorescência invertido durante o processo de cultura. Quando as células OS expandem a placa, suavemente, transferi o modelo OS-BEM para outro novo bem com pinça estéril.
    Nota: O meio de cultura é vermelho brilhante em pH 7,4, que é o valor de pH ideal para cultura de células de mamíferos mais. Se o meio se transforma em laranja ou até mesmo amarelo, atualize imediatamente o meio para manter um ambiente saudável para as células do sistema operacional.
  7. Transferir o modelo BEM-OS em um novo poço com uma pinça e lavar suavemente com PBS para remover o meio de cultura. Em seguida, transferir para um tubo de centrífuga de 15 mL e corrigir com formalina 10% tamponada para identificação histológica.

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Results

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Após a desmineralização e decellularization, BEM parece ser translúcido com forte resistência e tenacidade em relação ao osso nativo do rato. Um pequeno resíduo de músculo e o espaço da cavidade medular podem ser claramente observadas (Figura 1A, B). Para determinar a decellularization eficaz do BEM, BEM é incorporado em parafina, após a fixação e em seguida cortado em seções de 3 – 5 μm para coloração de hematoxilina-eosina (H & E). A remoção completa do núcleo de célul...

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Discussion

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Geralmente, OS podem ser classificados como osteoblástica, chondroblastic e fibroblastic subtipos dependendo de seu componente histológico dominante. Seu prognóstico é dependente não só parâmetros histológicos, mas também no seu sítio anatômico. Pode ocorrer no interior dos ossos (na haste intramedular ou compartimento intracortical), nas superfícies dos ossos e em sites extraosseous19. O surgimento e a heterogeneidade do sistema operacional podem ser elucidados como uma conjugação de eventos oncog...

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Disclosures

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Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgements

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Os autores valorizam o apoio de Liuying Chen por sua assistência administrativa e Zhao longa por sua excelente assistência técnica durante a construção de andaimes de matriz extracelular do osso. Este estudo é suportado por concessões da Fundação Nacional de ciências naturais da China (31871413).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubo de centrífuga de 15 mLGreiner188271
Tubo de centrífuga de 50 mLGreiner227270
Placa de cultura de células de 6 cmGreiner628160
Placa de 6 poçosGreiner657160
AmpicilinaSigma-AldrichA9393
C57-BL/6J camundongoLaboratório da Universidade Sun Yat-sen Centro
CO2 incubadoraSHEL LABSCO5A
Fosfato de sódio dibásico Fábricareagentes químicos de GuangzhouBE14-GR-500G
DMEM/F12Sigma-AldrichD0547
Soro bovino fetalHycloneSH30084.03
BLAU717805
KanamicinaSigma-AldrichPHR1487
MG-63Academia Chinesa de Ciências, BancoLinha celular de osteossarcoma humano
MNNG/HOSAcademia Chinesa de Ciências, BancoLinha celular de osteossarcoma humano
Vermelho de fenolSigma-AldrichP4633Uma solução de vermelho de fenol é usada como indicador de pH: sua cor exibe uma transição gradual do amarelo para o vermelho na faixa de pH de 6,6 a 8,0.
Cloreto de potássioSangon BiotechA100395
Fosfato de potássio MonobásicoSangon BiotechA501211
Cloreto de sódioSangon BiotechA501218
Animal de de Células de Xangai de Células de Xangai

References

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