Summary
ここでは、モーションキューなどの代替視覚特徴が魚類の方向性決定にどのように影響するかを定量化する行動アッセイを示すプロトコルを提示する。代表的なデータは、ゴールデンシャイナー(Notemigonus crysoleucas)が仮想魚の動きに従う速度と正確さで提示されます。
Abstract
集団動物の行動は、個々のフィットネスに不可欠な個々の動機や社会的相互作用から生じます。魚は長い間、集団的運動、特に環境と社会情報を生態学的な文脈にまたがって統合する能力に関する調査に影響を与してきました。このデモンストレーションでは、魚の行動応答を定量化するために使用される技術を示します, この場合, ゴールデンシャイナー (ノエミゴヌスクライソロルカス),コンピュータの視覚化とデジタル画像分析を使用して視覚刺激に.コンピュータビジュアライゼーションの最近の進歩により、視覚的な特徴を制御し、社会的相互作用のメカニズムを分離するために細かく操作できるラボでの実証的なテストが可能になります。この方法の目的は、孤独かグループかにかかわらず、個人の方向性の決定に影響を与えることができる視覚的特徴を分離することです。このプロトコルは、物理Y迷路ドメイン、記録装置、プロジェクターとアニメーションの設定とキャリブレーション、実験的なステップとデータ分析に関する詳細を提供します。これらの技術は、コンピュータアニメーションが生物学的に有意な応答を引き出すことができることを示している。さらに、この技術は、幅広い実験用途に対する代替仮説、ドメイン、および種のテストに容易に適応可能です。仮想刺激の使用は必要な生きている動物の数の減少そして取り替えを可能にし、結果として実験室のオーバーヘッドを減らす。
このデモンストレーションでは、仮想コンセ異性の移動速度(2体の長さ/秒)の小さな相対的な差が、仮想によって提供される方向の手がかりに従う速度と精度を向上させるという仮説をテストします。シルエット。結果は、背景雑音(67%の画像の一貫性)が存在する場合でも、視覚的な手がかりの速度の増加によって輝く方向決定が大きく影響を受けることを示しています。モーションキューがない場合、被験者はランダムに方向を選択しました。意思決定速度とキュー速度の関係は可変であり、キュー速度の増加は方向精度に対してやや不均衡な影響を及ぼしました。
Introduction
動物は、他の人と対話し、騒々しい環境をナビゲートする際に、情報に基づいた意思決定を行うために、継続的に生息地を感知し、解釈します。個人は、ソーシャル情報を行動に組み込むことで、状況認識や意思決定を強化することができます。しかし、社会的情報は、主に、特定のメッセージを伝えるために進化した直接信号(例えば、ワグル)を介して進化した直接信号を介してではなく、信頼できない可能性がある意図しない手がかり(すなわち、捕食者を避けるために突然の操縦)を介して推論に起因する。ミツバチで踊る)1.特に個人がグループで旅行する場合、個人がソーシャル キューや感覚情報の価値を迅速に評価する方法を特定することは、調査者にとって困難な作業です。ビジョンは、社会的相互作用2、3、4を支配する上で重要な役割を果たし、研究は、各個人の視野に基づいて魚学校で発生する可能性のある相互作用ネットワークを推測している5、 6.しかし、魚学校は動的なシステムであり、グループメンバー間の相互作用から生じる固有の共線性と交絡要因のために、特定の特徴や近隣の行動に対する個々の応答を分離することは困難です。このプロトコルの目的は、代替視覚機能が単独またはグループ内を移動する個人の方向性の決定にどのように影響するかを分離することによって、現在の作業を補完することです。
現在のプロトコルの利点は、操作実験とコンピュータの視覚化技術を組み合わせて、個人が自然界で経験する可能性のある基本的な視覚機能を分離することです。具体的には、Y-maze(図1)を用いて、バイナリ応答に向きの選択を折りたたみ、仮想隣人の水泳行動を模倣するように設計されたコンピュータアニメーション画像を紹介する。これらの画像は迷路の下から投影され、1つ以上の被験者の下で泳ぐコンセ異性のシルエットを模倣します。形態、速度、一貫性、水泳行動などのこれらのシルエットの視覚的特徴は、代替仮説7をテストするために容易に調整される。
本論文は、モデルの社会的魚種であるゴールデン・シャイナー(ノテミゴヌス・クライソルーカス)の個体が仮想隣人の相対的な速度にどのように反応するかを分離することによって、このアプローチの有用性を示す。プロトコルの焦点は、ここで、仮想近傍の方向的影響がその速度によって変化するかどうか、およびそうであれば、観察された関係の形態を定量化することにある。特に、シルエットの固定された割合がリーダーとして機能し、弾道的に片方の腕または別の腕に向かって移動することによって、方向キューが生成されます。残りのシルエットは、リーダー/ディストラクタ比を調整して調整できるバックグラウンドノイズを提供するためにランダムに動きまくることによって、ディストラクタとして機能します。ディストラクタに対するリーダーの比率は、方向の手がかりの一貫性をキャプチャし、それに応じて調整することができます。ディストラクタシルエットは、シルエットを境界から反射させることにより、決定領域(「DA」、図1A)に限定されたままです。ただし、リーダーのシルエットは、DA 領域を離れ、指定されたアームに入ってから、シルエットが腕の長さの 1/3 を通過するとゆっくりとフェードアウトします。リーダーがDAを離れると、新しいリーダーのシルエットが代わりを務め、正確な経路をたどり、実験を通じてリーダー/ディストラクタ比がDAで一定であることを確認します。
仮想魚の使用は、視覚感覚情報の制御を可能にしながら、被験者の方向応答を監視しながら、グループ内のソーシャルナビゲーション、動き、または意思決定の新しい特徴を明らかにする可能性があります。ここで使用されるアプローチは、コンピュータ アニメーションを操作して複雑さの変化する行動パターンを生成することにより、致命的なストレスや捕食が社会的相互作用に及ぼす影響など、幅広い質問に適用できます。
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Protocol
すべての実験プロトコルは、環境研究所、米国陸軍エンジニアと研究開発センター、ビックスバーグ、MS、米国(IACUC# 2013-3284-01)の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1.感覚迷路の設計
- 専用ルームの透明なサポートプラットフォームの上に設置された防水ポリメタクリレートY迷路プラットフォーム(自社製)で実験を行います。プラットホームは1.9 cmの厚さであり、幅1.3 m、長さ1.3 mおよび高さ0.19 mである押し出されたアルミニウムの4つの7.62 cmのビームによって支えられている。
- 施工と決定領域を同一に構築する(図1A)。ここでは、Y迷路の腕は、長さ46センチ、幅23センチ、奥行き20cmで、中央の決定エリアは直径約46cmです。
- Y迷路の下部にある白いプロジェクトスルーシアタースクリーンを付けて、視覚的な刺激をドメインに投影します。
- Y迷路の側面を白いビニールでコーティングし、外部の視覚刺激を制限します。
- リモートで制御されたクリアゲート(クリアモノフィラメント経由)を設置し、中央の決定エリアから保持エリアを分割し、順化後に被験者を迷路に放出します。
- 外部の部屋や廊下からの光の影響や影の動きを最小限に抑えるために、ドアフレームの床に届く遮光ブラインドなど、魚がライト、ハウジング、機器を見ないようにブラインドを追加します。
2. 記録機器
- 背景画像、仮想魚と被写体魚の間で必要なコントラストに基づいて、オーバーヘッドカメラ(白黒)を選択します。
- 上から迷路を記録し、魚や視覚的な投影の動作を記録するためにオーバーヘッドカメラをインストールします。
- このデモでは、b/w ギガバイト イーサネット (GigE) カメラを使用して、コントロール ルームに 1 Gb イーサネット カードを搭載したコンピュータに 9 m IP ケーブルを接続します。
- カメラを隣接する部屋のコンピュータに接続し、観察者がゲート、視覚刺激プログラム、およびカメラ録画ソフトウェアをリモートで制御できます。
- カメラの設定がサンプリングレートと周波数レートで、カメラとソフトウェアがルーム ライトと位相を合わせておらずに発生するちらつきを防ぐことを確認します。
- 場所の電気周波数を確認します。カメラのサンプリング レート(フレーム/秒、fps)をオフセットして、AC 周波数を数で乗算または除算してちらつきを防ぎます。
- ソフトウェアとコンピュータを使用して画像の鮮明度が最適化され、関連する動作を視覚化するようにカメラ設定を設定します。
- このデモでは、1280 ピクセル x 1024 ピクセルの空間解像度で 30 fps でサンプリングを実行します。
3. 照明、プロジェクター、カメラの設定を校正する
- 実験室の壁に沿って4つのオーバーヘッドトラック照明システムをインストールします。
- ライトの調整可能な制御スイッチを取り付けて、適切な部屋の周囲光を実現する柔軟性を高めます。
- 迷路の反射を避けるためにライトを配置します(図1B)。
- 迷路のサポート構造の下端に短いスロー (ST) プロジェクターを固定します (図 1C)。
- 投影解像度を選択します(このデモでは 1440 ピクセル x 900 ピクセルに設定)。
- オーバーヘッドライトとプロジェクターによって作成された周囲光レベルを調整して、被験者のハウジングルームで見つかった照明条件に合わせて調整します(ここでは、曇りの日の自然光に相当するデモンストレーション実験中に134±5ルクスに設定します)。
- 実験中に調光スイッチの位置をロックまたはマークして、簡単さと一貫性を保つ。
- カメラ ビューア プログラムを使用して、露出モード、ゲイン、およびホワイト バランス コントロールを制御するカメラを構成します。
- このデモでは、パイロンビューアを「連続撮影」、8000 μsの露出時間、0ゲイン、96ホワイトバランスに設定し、ビデオ録画を制御します。
4.視覚投影プログラムのキャリブレーション:背景
- 迷路の底に均質な背景を投影し、プロジェクターからの光の歪みを測定します。ここでは、科学的なプロジェクト用にカスタマイズされたビジュアライゼーションを作成するための扱いやすい、十分に文書化されたプラットフォームである処理 (v. 3) を使用して背景を作成しました(https://processing.org/examples/) 。
- 迷路の下部に投影する処理ウィンドウを実行するプログラムを作成します。ウィンドウの背景色のカスタマイズは、RGB カラー コードを受け入れるバックグラウンド コマンドを使用して行われます。いくつかの小さな例のプログラムは、処理チュートリアル (https://processing.org/tutorials/) にあります。
- 背景カラープログラムを使用して、プロジェクターと外部照明条件を調整します。
- 画像処理プログラムを使用してプロジェクターによって作成された光の歪みを測定し、作成された予想される均質な背景からの偏差を識別します。ImageJ (v. 1.52h) の使用には、次の手順が適用されます。https://imagej.nih.gov/ij/)。
- 一等な背景色で照らされたY迷路の静止画画像をキャプチャし、ImageJで開きます。
- 直線、セグメント化、またはフリーハンドラインツールを使用すると、ホットスポットの中央の最も明るい位置からY迷路の上部まで直線の垂直線を描画します(図2A)。
- [分析] メニューから[プロファイルのプロット]を選択して、グレースケール値とピクセル単位の距離のグラフを作成します。
- ピクセル データを、インデックス列とピクセル値列で構成されるコンマ区切りファイル (.csv ファイル拡張子) として保存します。
- 投影領域を迷路 (図2B)に合わせ、不要な光の歪みをモデル化して、プロジェクターによって作成される色の歪みを減らします (図 2C)。次に、現在のデモで実行した手順の概要を示します。
- 適切なタブ区切り読み取り機能を使用して ImageJ ピクセル強度データ ファイルをインポートします (例えば、tidyverse パッケージから read_csv を読み取り、コンマ区切りファイルで読み取ります)。
- 変動係数など、サンプルトランスレクトに沿った光強度の変動を計算し、バックグラウンドで作成された歪みのレベルのベースライン参照を提供します。
- 生のピクセル値を変換して、最も明るい色調から暗い強度までの相対的な変化を反映し、最小のピクセル強度がイメージ プログラムで選択した目的の背景色値に近づきます。
- 異常の最も明るい部分から始まる変換ピクセル強度値をプロットすると、一般に、ソースからの距離の関数として強度値の減衰傾向が生じます。非線形最小二乗 (関数nls)を使用して、データに最も適したパラメータ値を推定します (ここでは、ガウス減衰関数)。
- R(v. 3.5.1)を使用してプロジェクターによって作成される色の歪みを減らすために、バックグラウンドカウンタイメージ(処理v.3)を生成するために採用された同じプログラムを使用してカウンタグラデーションを作成します。
注: グラデーション関数は、中心からの距離の関数としてピクセル強度が変化する画像の最も明るいスポットを中心とした一連の同心円を生成します。各リングの色は、モデルによって予測されるピクセル強度の変化を背景色から差し引くことによって定義されます。それに応じて、リング半径もソースからの距離に応じて増加します。最適な適合モデルは、グラデーション全体のピクセル強度を減らし、背景の均一性を提供する必要があります。- 必要なパラメータを調整して、視覚刺激プログラム
を使用してガウスのグラデーションを作成します。- パラメータaは、ガウス分布グラデーションの明るさ/暗度に影響します。値が大きいほど、グラデーションが暗くなります。
- パラメータbはグラデーションの分散に影響します。値が大きいほど、グラデーションが広くなり、目的の背景ピクセル強度cに平準化されます。
- パラメータcは、目的の背景ピクセル強度を設定します。値が大きいほど、背景が暗くなります。
- saveFrame関数を使用してイメージをフォルダに保存し、実験中に固定の背景画像をアップロードして、実験中に刺激をレンダリングする際のメモリ負荷を最小限に抑えます。
- 図 2Cに示すように、バックグラウンド生成プログラムを再実行し、結果を視覚的に検査します。ステップ 4.3 を繰り返して、サンプルトランセクト全体の光強度の変動の程度を減らす上で観察された改善を定量化します。
- 必要なパラメータを調整して、視覚刺激プログラム
- 照明レベル、モデルパラメータ、またはトランスレクトでカバーされる距離(カウンターグラデーションの外半径など)を経験的に調整して、順応ゾーンのRGB値が決定領域に近くなるまで手動で調整します。この検定のモデルパラメータは、a = 215、b = 800、および c = 4 でした。
- 実験視覚刺激プログラムに最終的なフィルタを追加します。
を使用してガウスのグラデーションを作成します。5.視覚投影プログラムを校正:視覚刺激
注: 視覚的な刺激のレンダリングとアニメーションは、プラットフォームのチュートリアルと共に以下の手順をガイドとして使用して処理を行うこともできます。現在のプログラムのロジックの概略図 (図3) に記載されており、追加の詳細については、Lemasson et al. (2018)7.次の手順は、現在の実験で行われたキャリブレーション手順の例を示しています。
- ビジュアルプロジェクションプログラムVfish.pdeを開き、迷路の決定領域(図1A)内の投影を中心にし、テスト中の仮説に基づいて視覚投影を調整します(例えば、一致するシルエットのサイズと速度を調整します)被験者のもの)。キャリブレーションは、あらかじめ選択されたデバッグ フラグを使用して、メイン プログラム (Vfish.pde) のヘッダーで手で調整されます。デバッグ モード (DEBUG = TRUE) では、各 DEBUGING_LEVEL_# フラグ (数値 0 から 2) を順番にステップ実行して、必要な調整を行います。
- DEBUGGING_LEVEL_0 フラグを 'true' に設定し、スケッチ ウィンドウで再生アイコンを押してプログラムを実行します。投影が中央に配置されるまで、x と y の位置値(ドメイン パラメータ dx と dy)を変更します。
- 魚のシルエットのサイズをスケーリングするには、DEBUGGING_LEVEL_1 を 「true」に設定します(楕円としてレンダリングされます)。プログラムを実行し、被験者の平均サイズと一致するまで楕円の幅(eW)と長さ(eL)を繰り越して調整します。その後、シルエット (ss) のベースライン速度を調整するために、DEBUGGING_LEVEL_2 を 「true」に設定します。
- デバッグ モードを終了するには、DEBUG = FALSE を設定します。
- ディストラクタのシルエットが決定領域 (DA,図 1A)にバインドされたままで、リーダーのシルエットの軌道がどちらかの腕に正しく位置合わせされ、DA 内のリーダー/ディストラクタの比率が一定であることを確認します。
- プログラムの GUI をステップステップして、オプションの機能を確認します。
- データがファイルに正しく書き出されていることを確認します。
- 記録ソフトウェアが視覚的な投影を使用して被写体の魚を追跡できることを確認します。魚を追跡する手順は、以前にカイダノヴィッチ・ベルリンら (2011)8, Holcomb et al. (2014)9, Way et al. (2016)10および Zhang et al. (2018)11.
6. 動物の準備
- 性別、年齢、遺伝子型を含む研究の質問とアプリケーションに基づいて被験者の種を選択します。実験保持タンクに被験者を割り当て、ベースライン生体統計(例えば、体長と質量)を記録する。
- 迷路内の環境条件を保持システムの環境条件に設定します。行動のベースライン実験のための水質条件は、多くの場合、種および実験ドメインのセットアップに最適に保持されます。
- このデモンストレーションでは、12 h 光/12 h ダークサイクル、オーバーヘッドフリッカフリーハロゲンライトを 134 ± 5 ルクス、22 ± 0.3°C、97.4 ± 1.3% 溶存酸素、および pH 7.8 ± 0.1 の条件を使用します。
- 実験試験の開始前に、コンピュータで生成された視覚刺激(例えば、魚のシルエット)なしで、1日あたり最大30分間ドメインに動物を移すことによって、動物を習慣化します。
- その時点で被験者の魚が選択され、割り当てられ、計量され、測定され、実験タンクに移されることを確認してください。
注:ここでは、ゴールデンシャイナーの標準長さと湿った重量は、それぞれ63.4 ±3.5 mm SLと1.8 ±0.3g WWでした。 - 水槽と迷路の間で魚を移動する際には、水から水への移動を使用して、取り扱いや空気暴露によるストレスを軽減します。
- 被験者の自然な生体リズムを反映した、定期的な固定光サイクル中に実験を行う。これにより、被験者は、行動に対する消化効果を制限するために、毎日の実験試験の終わりに供給することができます。
7. 実験手順
- ルームプロジェクターとLEDライトトラックシステムを所定の明るさレベル(このデモでは134±5ルクス)にオンにし、電球を暖めます(約10分)。
- カメラビューアプログラムを開き、セットアップから保存した絞り、色、録画の設定をロードして、最高品質のビデオを確実に実現します。
- パイロンビューアを開き、記録に使用するカメラをアクティブにします。
- [カメラドロップダウン]メニューから[フィーチャを読み込む]を選択し、保存したカメラ設定フォルダに移動します。
- 保存した設定(ここではcamerasettings_20181001)を開き、ビデオの品質を確認し、連続撮影をクリックします。
- パイロンビューアを閉じます。
- ビジュアルプロジェクションプログラムVfish.pdeを開き、投影が迷路の中央に残っている、DataOutフォルダが空であることを確認し、プログラムが期待どおりに動作していることを確認します。
- ステップ 5.1.1 を使用して、キャリブレーション リングが DA の中央に配置されていることを確認します。
- DataOut フォルダを開いて、その日の空であることを確認します。
- Vfish.pde のスケッチ ウィンドウで再生を押して視覚的な刺激プログラムを実行し、ダミー変数を使用してプログラムの機能を確保します。
- 魚ID番号(1~16)を入力し、「Enter」を押し、YまたはNを押して「はい」または「いいえ」を押して選択を確認します。
- グループサイズ(ここで1に固定)を入力し、選択を確認します。
- 目的のシルエット速度(0-10 BL/s)を入力し、選択を確認します。
- Enterキーを押して順化期間を過ぎて移動し、決定領域内の仮想魚の投影を確認します。
- [一時停止]を押してプログラムを一時停止し、ダミーの結果の選択肢 (左 (1) または右 (2) を入力します。
- [停止]を押してプログラムを終了し、データをファイルに書き出します。
- データが DataOut フォルダ内のファイルに正しく書き込まれたことを確認し、魚が順応するためにドメインに配置される前に、ラボ ノートでテスト実行としてファイルをログに記録します。
- クロックタイムとストップウォッチを使用して、ラボ ノートブックで試用版の開始時刻と停止時間をログに記録し、一部のレプリケートトライアルの短い期間のためにビデオ再生から後で抽出できる経過時間を補完します。
- 水の変化を行う(例えば、30%)迷路に被験者を転送する前に、保持システムサンプ水を使用しています。
- 迷路と保持システムの間で水質が類似していることを確認し、ゲートが機能していることを確認して、水の高さのすぐ上まで滑らかにスライドすることを確認します。
- 実験の過程で被験者治療暴露をランダム化した所定の実験スケジュールを使用して、現在の試用版で選択された値を入力します(順化画面で停止し、ステップ7.3.3.1 - 7.3.3.3)。
- 治療の組み合わせデータをラボ ノートブックに記録します。
- 被写体をY迷路保持エリアに10分間移動します。
- ビデオ録画を開始し、順応期間の終了時に Vfish.pde ウィンドウのReturnキーを押します。これにより、視覚的な投影が開始されます。
- 仮想魚がドメインに現れたら、クロックタイムを記録し、保持ゲートを持ち上げます(図4A)。
- 被験者の体の50%が選択アームに移動したとき(図4B)、または指定された期間が経過した場合(例えば、5分)、試験を終了する。
- クロック時間、ストップウォッチからの開始時刻と停止時刻、および被験者の選択(左(1))、右(2)、または選択なし(0))を記録します。
- ビデオ録画を停止し、視覚刺激プログラムで一時停止を押すと、ユーザーにトライアル結果データ (選択した腕番号または 0 を選択して選択が行われなかったことを示す) を求めます。選択を確認すると、プログラムは最初の画面に戻り、次の実験試行に期待される値を待ちます。
- 被写体を集め、それぞれの保持タンクに戻します。試用ごとに手順 7.7-7.13 を繰り返します。
- セッション(AMまたはPM)の終了時に、セッションの最後の魚が決定を下したら、プログラムで停止を押します。[停止]を押すと、セッションのデータがファイルに書き出されます。
- 水質の安定性を確保するために、朝のセッションの終わりに水交換を繰り返します。
- その日の最後のトライアルの後、ラボノートブックを確認し、必要なノートを作成します。
- ビジュアル刺激プログラムの[停止]を押して、収集したデータを DataOut フォルダに出力します。
- ビジュアライゼーション プログラムによって保存されたデータ ファイルの番号、名前、および場所を確認します。
- 朝の設定と比較するために迷路の部屋の光レベルと一緒に、水質をログに記録します。通気システムとヒーターをY迷路に入れます。
- プロジェクターと実験室のトラッキング照明をオフにします。
- 所定の毎日の配給を魚に餌を与える。
8. データ分析
- 実験データに必要な変数(日付、試用、被験者ID、プログラムによって選択された腕、テストされた視覚因子、被験者の選択、開始時間と終了時間、コメントなど)が含まれていることを確認します。
- 記録エラー(人またはプログラムが誘発)がないか確認します。
- 応答を集計し、被験者の一部に任意の方向バイアスの兆候をチェックする(例えば、制御条件における腕選択に関する二項試験)7。
- 実験が同じ個体に対して繰り返し測定を使用して設計されている場合、ここでの場合と同様に、混合効果モデルの使用が推奨される。
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Representative Results
仮説とデザイン
この実験システムの有用性を実証するために、ゴールデンシャイナーが視覚的な合図に従う精度は、そのキューの速度で向上するという仮説をテストしました。野生型ゴールデンシャイナーを使用した(N=16、体長、BL、および湿式重量、WW、63.4±3.5mmおよび1.8±0.3g、敬意を払って)。視覚刺激(リーダー/ディストラクタ比)の一貫性は0.67に固定され、モーションキュー(リーダー)がディストラクタに対して移動する速度を操作しました。指向性の手がかりを提供するリーダーシルエットの速度レベルは、0-10 BL/s(2の増分)の範囲で、魚12における活動の持続的、長期、またはバーストスイミングモードを反映すると一般的に考えられる速度の範囲に及ぶ。コントロールレベル0では、リーダーのシルエットはランダムに指向されたディストラクタの間で目的地の腕に向けられましたが、シルエットは動きませんでした。プログラムによってトライアルごとにランダムに行き先アームが選ばれました。距離単位は、被験者の平均標準長さによって定義された体長で、時間は秒単位です。現在の代表的な分析では、一次応答変数(意思決定速度と精度)の測定に重点を置いていますが、実験の設計により、研究者は被験者の動きを追跡し、その動きを分析することで、追加情報を抽出することができます。キネマティック。
我々の魚の被験者は、プロトコルのセクション6に続いて収容された。各被験者は、1日あたり1レベルの治療にさらされた。我々は、日をまたがって被験者の治療レベル(キュー速度)内で、被験者が毎日テストされた順序の両方を無作為化した。線形および一般化された線形混合効果モデル(LMMおよびGLMM、それぞれ)を用いて、被験者が視覚刺激に従った速度および精度に対するリーダーのシルエット速度の影響をテストした。被験者IDは、両方のモデルでランダム効果として含まれていました。
データと調査結果
モーションキューがない場合、ゴールデンシャイナーは期待どおりに動作し、ランダムにその方向を選択しました(刺激速度= 0、二項検定、n左= 33、n右= 40、= 0.45、P = 0.483)。 ほとんどの被験者は、ドメイン内でストレスの多い行動の兆候を示さなかったし、割り当てられた時間(5分)以内に決定的な決定を行ったが、被験者の22%は、保持領域を離れるか、または決定領域に入ることを嫌がった。これらの優柔不断な魚からのデータは分析に含まれていなかった。我々の被験者の残りの78%は、それらの刺激の速度が増加するにつれて方向刺激に従う精度の有意な改善を示した(GLMM,z = 1.937, P = 0.053)。図5Aは、刺激速度レベルの増加ごとに方向精度が1.2倍増加するこの関係の性質を示しています。この関係は控えめに不均衡であり、それ自体はキュー速度の変化に対するしきい値応答を示唆するものではありません。刺激速度の増加はまた決定速度の有意な増加をもたらした(LMM、F 1,56= 4.774、P = 0.033)。 しかし、図5Bに明らかなように、意思決定速度の傾向は、刺激速度レベルにわたって一貫性がなく、非常に変動していました。これらの意思決定速度データで明らかなのは、刺激が動いていないときよりも5~20倍長い被験者を平均して、どこでも取ったということです(刺激に対する意思決定速度は4.6 ±2.3sと81.4 ±74.7s) それぞれ0と8の速度、±標準偏差、SD)。実際、制御レベルがなければ、刺激速度の関数としての意思決定速度に大きな変化は見つかりませんでした。
図 1.Y-Maze ドメイン。A.意思決定試験用Y迷路装置の画像アヌーテーションは、保持領域(HA、緑)、意思決定領域(DA、青)、左意思決定アーム(LDA)、および右意思決定アーム(RDA)を表します。B.オーバーヘッド調整可能なトラック照明とGigEカメラの配置を備えたY迷路と部屋の画像(4つのオーバーヘッドライトストリップのうちの1つだけが表示されます)。C.試用中、または試行中の動きを排除するために、スライドキャリッジによってロックされたプロジェクター配置を含むY迷路(サイドビュー)の画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.背景および刺激の口径測定。A.保持領域と決定領域 DA (平均ピクセル強度 112 ± 1278) の間に均一な背景色とピクセル強度トランジェクト (緑色の線) を持つ照射された Y 迷路の画像。プロジェクターの電球(ホットスポット)によって生成される光勾配がはっきりと見えます。B.投影と DA の位置合わせを示す画像。C.フィルタリングされた背景と、キャリブレーション(サイズ、速度)のためにDAの中央に投影された孤独なシルエットを持つ迷路の画像。(C) にカウンターグラデーションの背景を追加すると、背景が暗くなり(平均ピクセル強度 143.1 ± 5.5)、空間変動度が大幅に低下します(変動係数は 11.4 (A.) から 0.03 (C.) になります。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.実験で使用されるビジュアライゼーションプログラムにおける一般的な操作フローの概略図。その他の手続きの詳細については、7 を参照してください。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.本物と仮想の両方の魚のシルエットを持つ実験的な試み。A.ホールディングエリア(緑色の円)を残してゴールデンシャイナーをイメージします。B.仮想魚のシルエットの中の決定領域(緑の円)における(ライブ)ゴールデンシャイナーの画像。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.モーション キューの相対的な速度の変化に対する方向応答の精度と速度。A.ゴールデンシャイナーが刺激速度(BL/s)に対してプロットされた「リーダー」のシルエットに従った魚の決定精度のグラフ。B.刺激速度(BL/s)に対してプロットされた魚の決定速度のグラフ。データは±標準誤差を意味し、SE.15仮想シルエットのグループは、67%の一貫性レベル(15のシルエットのうち10はリーダーとして機能し、残りの5つのシルエットはディストラクタとして機能した)で決定ゾーン全体にランダムに分布し、0-10 BL/sからのリーダーの速度は、シルエットのどれも動かしていないコントロールを除いて、すべての速度レベルで1 BL/sで固定されたままでした。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
視覚的な手がかりは、黒と白の格子13にさらされた魚の光運動応答を引き起こすことが知られており、近隣の速度が動的相互作用を支配する上で影響力のある役割を果たすという理論的および経験的証拠が増加しています。魚学校で観察7,14,15,16,17.対照的な仮説は、グループ内の個人が、すべての識別可能な手がかり14に比例して反応する、モーションしきい値応答17を採用する、衝突時間を監視するなど、近隣の動きを統合する方法を説明するために存在する18.これらの代替仮説をテストする最初のステップは、その根底にある仮定を検証することです。ここでは、特定の感覚機能が方向性の決定を導く上で果たす役割を特定する際に、プロトコルの有用性を示しました。
我々は、社会的な魚種であるゴールデンシャイナーの個体が、学校で特異性を模倣するように設計された視覚刺激の相対的な速度の変化にどのように反応するかを単離した。黄金の輝き指向性精度は、視覚刺激の相対的な速度の増加と共に改善したが、これらの変数間の機能的関係はわずかに不均衡であった。意思決定速度と刺激速度の関係は有意ですが、非常に変動し、一貫性がありませんでした。しかし、この結果は、これらの魚の視野に散在する画像に見られる速度差が、応答を引き起こし、そのオプレアト・アイトを導く上で重要な役割を果たしていることを示している。特定の隣人の行動の中から個人がどのように選択するかを、刺激に相反する方向を導入することによって、現在の設計で調査することができる。
ゼブラフィッシュ、ダニオ・レリオとの最近の実験では、我々は孤独な試験7で優柔不断の証拠を見つけなかったが、このデモでゴールデンシャイナーは、保持領域を残すことに大きな消極的を示しました。これらの2つの種の違いは、彼らの人生史戦略と彼らの社会的傾向(または依存)の相対的な強さによって説明することができる。ゼブラフィッシュは、ゴールデン・シャイナーズ(例えば、学部と義務的な学校の生徒3)よりも可変的な社会的一貫性を示すように見えます。ゴールデンシャイナーの社会的一貫性が強いほど、ゼブラフィッシュよりも高いレベルの恥ずかしがり屋、またはドメイン内の躊躇を示す被験者に寄与した可能性があります。
手順の順序は、プロトコルでは微妙ですが、重要です。ライト、プロジェクター、およびプログラム フィルタのバランスをとるプロセスは、新しいドメインで予想されるよりも時間がかかる場合があります。このプロトコルでは、(ドメインではなく)壁から反射するトラックライトの使用、調整可能なライト コントローラ、プロジェクター用のプログラム生成フィルタなど、セットアップとライトバランスの時間を短縮するために学習された教訓が含まれています。また、人間の目に視覚的に許容されるように見えるものは、カメラとソフトウェアが同じように見えないため、照明条件を追加調整する必要がある場合があることを考慮してください。モニタの角度をわずかに変更しても、背景グラデーションの変更が発生します。したがって、ファイル設定の詳細なメモの取り込みと保存により、実験中に変更が発生する可能性が大幅に低下します。ここで説明するように、物理からフィルタリングにプロセスを移動すると、成功への最速のステップが得られます。
STプロジェクターを使用すると、モニターに対する空間的な柔軟性が向上しますが、このアプローチは「ホットスポット」と呼ばれる不要な視覚的異常を作成します。ホットスポットは、プロジェクターの電球の近くによって作成された投影面上の明るいスポットです。プロトコルでは、セクション4は、バックグラウンドフィルタの作成とドメイン全体の均質な雷のチェックに専念していました。ここで提供される手順は、不要なグラデーションをモデリングし、モデルを使用して逆グラデーションを再現して効果に対抗することで、ホットスポットの不要な影響を回避または最小化するのに役立ちます。最後に、STプロジェクターモデルは異なる場合がありますが、画像調整(回転、反転、前面または背面画面投影)とキーストーン補正(±3-5度)は、欲望画像がドメインに適合し、歪みのために調整することができることを保証するのに便利な機能です。
時間が経つにつれて、実験室は、ハードウェア(すなわち、カメラ、ケーブル、ビデオカード、モニター)の変更によって容易に更新されました。ハードウェアの変更により、照明のバランスをとり、潜在的なプログラムの問題を解決するための起動時間が増える可能性が高いことに注目してください。したがって、任意のハードウェアは、目的の実験が完了するまでシステムに専用することをお勧めします。ほとんどの課題は、モニタ、ビデオカード、カメラのパフォーマンスの違いに結びついています。この作業の時点以降、内部テスト ドメインを削除して他のテスト ドメインに切り替えることができる新しいドメインが開発されました。実験ドメインとサポート構造を設計する際には、この柔軟性を考慮することをお勧めします。
現在のプロトコルでは、研究者は、学校内で期待される視覚環境を反映する方法で視覚的特徴を分離および操作すると同時に、実際のコンコンセクション(例えば)への暴露に伴う交絡因子を制御することができます。,飢餓,親しみやすさ,攻撃性)7.一般に、仮想魚のコンピュータアニメーション(CA)(すなわち、シルエット)は、行動応答19、20、21を刺激する上でその明確な利点のためにより一般的になりつつある慣行である。CAは、視覚手がかり(方向、速度、一貫性、または形態)をカスタマイズしながら、生きた動物を覚醒剤として使用する場合に達成できるものを超える所望の刺激に標準化と再現性のレベルを導入することができます。行動研究におけるバーチャルリアリティの使用は、動物22と人間23の両方で着実に増加しており、技術がより利用可能で扱いやすいものになるにつれて、強力な経験ツールになることを約束します。これらの仮想アプローチを組み合わせることで、科学における動物倫理(例えば、IACUC、AAALAC、ACURO)24の生きた動物の要件を置き換え、削減し、実験室のコストと負担を同時に削減します。
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Disclosures
すべての著者は、実験設計、分析、論文の執筆に貢献しました。A.C.U. と C.M.W. のセットアップとデータの収集。著者は何も開示していない。
Acknowledgments
セットアップアシスタンスを提供してくださったブライトン・ヒクソンに感謝します。このプログラムは、基礎研究プログラム、環境品質と設置(EQI;米国陸軍エンジニア研究開発センター テクニカルディレクター、エリザベス・ファーガソン博士。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black and white IP camera | Noldus, Leesburg, VA, USA | https://www.noldus.com/ | |
| Extruded aluminum | 80/20 Inc., Columbia City, IN, USA | 3030-S | https://www.8020.net 3.00" X 3.00" Smooth T-Slotted Profile, Eight Open T-Slots |
| Finfish Starter with Vpak, 1.5 mm extruded pellets | Zeigler Bros. Inc., Gardners, PA, USA | http://www.zeiglerfeed.com/ | |
| Golden shiners | Saul Minnow Farm, AR, USA | http://saulminnow.com/ | |
| ImageJ (v 1.52h) freeware | National Institute for Health (NIH), USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LED track lighting | Lithonia Lightening, Conyers, GA, USA | BR20MW-M4 | https://lithonia.acuitybrands.com/residential-track |
| Oracle 651 white cut vinyl | 651Vinyl, Louisville, KY, USA | 651-010M-12:5ft | http://www.651vinyl.com. Can order various sizes. |
| PowerLite 570 overhead projector | Epson, Long Beach CA, USA | V11H605020 | https://epson.com/For-Work/Projectors/Classroom/PowerLite-570-XGA-3LCD-Projector/p/V11H605020 |
| Processing (v 3) freeware | Processing Foundation | https://processing.org/ | |
| R (3.5.1) freeware | The R Project for Statistical Computing | https://www.r-project.org/ | |
| Ultra-white 360 theater screen | Alternative Screen Solutions, Clinton, MI, USA | 1950 | https://www.gooscreen.com. Must call for special cut size |
| Z-Hab system | Pentair Aquatic Ecosystems, Apopka, FL, USA | https://pentairaes.com/. Call for details and sizing. |
References
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