Artigo de método

Protocolo de isolamento gota lipídica rápida usando um Kit de isolamento organela bem estabelecidas

DOI:

10.3791/59290

⸱

19 de abril de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Gastroenterology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo estabelece um novo método de isolamento de gotículas lipídicas e purificação do fígado de rato, usando um kit de isolamento bem-estabelecida retículo endoplasmático.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gotículas lipídicas (LDs) são bioativas organelas encontradas no citosol do mais eucarióticas e algumas células procarióticas. LDs é composto de lipídios neutros, envolvidos por uma monocamada de fosfolipídios e proteínas. Lipídios de LD hepáticos, tais como as ceramidas e as proteínas estão implicados em várias doenças que causam esteatose hepática. Embora métodos anteriores tenham sido estabelecidos para isolamento de LD, exigem uma preparação demorada dos reagentes e não são projetados para o isolamento de vários compartimentos subcellular. Procuramos estabelecer um novo protocolo para permitir o isolamento de LDs, retículo endoplasmático (ER) e lisossomos de um fígado de rato único.

Além disso, todos os reagentes utilizados no protocolo aqui apresentado estão disponíveis comercialmente e exigem preparação do reagente mínima sem sacrificar a pureza de LD. Aqui nós apresentamos dados comparando este novo protocolo para um protocolo de gradiente de sacarose padrão, demonstrando rendimento, morfologia e pureza comparável. Além disso, podemos isolar ER e lisossomos usando a mesma amostra, fornecendo uma visão detalhada para a formação e o fluxo intracelular de lipídios e suas proteínas associadas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDs são bioativas organelas encontradas no citosol de células eucarióticas mais e algumas células procarióticas1,2,3. O núcleo de LD é composto de lipídios neutros como triglicérides (TG) e ésteres de colesterol. Eles também contêm ceramidas, lipídios bioativos envolvidos em vias sinalização celular4,5. LDs estão rodeados por uma monocamada de fosfolípidos e revestidos com proteínas, incluindo a perilipin de proteínas perilipin 2 (PLIN2) e 3 (PLIN3)1,5,6. Também presentes estão as enzimas lipogénicos, lipases e proteínas de membrana de tráfico que têm sido associadas a várias doenças steatotic hepáticas, incluindo doença hepática gordurosa não alcoólica, doença hepática alcoólica e hepatite C3,5 ,6,7,8,9,10.

LDs é pensado para formar a membrana exterior do PS e conter recentemente sintetizada TG proveniente de ácidos graxos livres de ER-derivado11. No entanto, continua a ser desconhecido se os lipídios em pool Brote, permanecem conectados, ou são extirpado da ER6,11, fazendo o isolamento do LDs livre de ER tecnicamente desafiador. Ácidos graxos livres podem ser liberto de LDs pela ação de lipases superfície para fornecer para a produção de energia ou síntese de membrana. Além disso, LDs pode ser degradado através de lipophagy como um mecanismo regulatório e para a produção de ácidos graxos livres12.

Além do ER e lisossomos, existem outras organelas — tais como endossomos, mitocôndrias, peroxissomos e a membrana plasmática — que são encontrados dentro de estreita associação de LDs11. Esta poligamia apertada dificulta a realizar uma extração LD pura. No entanto, densidade de baixo inata dos lípidos neutros pode ser aproveitada através de de centrifugação5.

Tradicionalmente, LDs têm sido isolado usando um sacarose densidade gradiente1,5,13. No entanto, estes métodos não foram concebidos para isolar outras organelas. Além disso, eles exigem a demorada preparação dos reagentes. Este protocolo se adapta a um isolamento de ER comercialmente disponível kit (veja a Tabela de materiais) para permitir o isolamento de LD. Nós usamos o buffer de extração fornecido pelo kit, adicionando uma etapa de isolamento de LD. Além disso, o protocolo também pode ser usado para ER e isolamento dos lisossomos, usando as mesmas amostras, permitindo uma imagem mais abrangente do ciclo de vida do LDs. Para validar este novo método, nós do ensaio rendimento LD, morfologia, tamanho e pureza. Comparamos os resultados aqui apresentados aos obtidos com um protocolo amplamente usado, utilizando um gradiente de sacarose para isolamento de LD.

Usamos um 10 de 12-semanas, 20 g feminino C57BL/6 rato jejuou por 16 h (remoção de comida às 17:00 por um tempo de isolamento do LD de 09:00), com livre acesso à água. O rendimento típico de TG é de 0,6 mg/g fígado, e por proteínas de LD, é 0,25 mg/g fígado. Isto fornece material suficiente para ~ 10 immunoblots por SDS PAGE. O protocolo abaixo detalha os reagentes usados e um protocolo apropriado para um fígado único 1G. O protocolo de isolamento gradiente de sacarose é adaptado do Sato14 e Wu15.

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Protocolo

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Todos os experimentos foram realizados em uma bancada de laboratório com equipamento de proteção pessoal apropriado para o nível de biossegurança 1, incluindo um jaleco, luvas e óculos de segurança. Experimentos foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade da Pensilvânia. Foram envidados todos os esforços para minimizar o desconforto do animal, e os animais foram tratados com crueldade.

1. isolamento de LD usando um kit de isolamento de ER

  1. Preparação
    Nota: Os valores listados são adequados para um fígado de rato único 1G.
    1. Prepare-se 10 mL de 1 x isotónica solução tampão (buffer de IE, do kit de isolamento de ER) diluindo-se 2 mL de tampão de IE x 5 com 8 mL de água ultrapura. Legal o buffer, colocando-o no gelo.
    2. Prepare 100 mL de tampão fosfato salino (PBS) de 1x diluindo-se 10 mL de PBS de x 10 em 90 mL de água ultrapura. Calma, colocando-o no gelo.
    3. Prepare-se 10 mL de 5% polietileno glicol p-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)-fenil éter (PGPE) diluição 500 µ l do PGPE em 9,5 mL de água ultrapura. Use uma seringa de 1 mL para medir PGPE como é viscoso. Calma, colocando-o no gelo.
    4. Legal todos os tubos, colocando-os no gelo: 1,7 mL microcentrifuge tubos, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL e tubos de se de 13 mL.
    5. Legal todas as centrífugas de 4 ° c: microcentrifuga, uma centrífuga de alta capacidade para 15 mL de tubos, uma centrífuga de alta velocidade para tubos de 50 mL e um se.
    6. Esterilize a tesoura pinça e dissecação em autoclave.
  2. Preparação do tecido
    1. Eutanásia o mouse, colocando-o em uma câmara cheia de 100% de CO2 por 10 min. Confirm eutanásia realizando deslocamento cervical.
    2. Usando Pinças esterilizadas e tesoura de dissecação, cortar as camadas de pele e músculo do abdome no eixo posterior/anterior para expor o fígado.
    3. Corte os ligamentos conectando o fígado ao diafragma e intestino. Use pinça para puxar o intestino longe do fígado, em direção posterior, para expor os ligamentos.
    4. Corte entre o fígado e a caixa torácica dorsal, movendo-se do anterior posterior até o fígado é libertado.
    5. Transferi o fígado a um frio 5 cm placa de Petri com 10 mL de PBS 1x frio.
    6. Lave o fígado 2 x em uma plataforma de balanço em 10 mL de PBS 1x fria por 5 min a 4 ° C, na prato de Petri de 5 cm. Despeje 1X PBS após a lavagem final.
    7. Use uma lâmina cirúrgica estéril de tamanho-10 (consulte a Tabela de materiais) para cortar o fígado em pedaços de 3 a 5 mm na 5cm de Petri (figura 1A).
    8. Lave o fígado picado 2 x com 10 mL de PBS 1x fria por 5 min a 4 ° C, na prato de Petri de 5 cm.
      Nota: Para o isolamento do lisossoma, transferir 0,5 g de fígado de um homogeneizador de 45ml limpo e siga as instruções fornecidas pela extração lisossoma kit (veja a Tabela de materiais).
    9. Decantar 1X PBS e transfira os pedaços de fígado picados para o frio 45 mL homogenizacao homogenizador. Certifique-se de todas as peças vão ao fundo do homogenizador.
    10. Adicionar 7 mL de tampão de IE frio 1x (do kit de isolamento de ER) e homogeneizar no gelo, movendo o pilão e descer 20 x. Certifique-se de que o pilão vai ao fundo do homogenizador durante cada braçada.
    11. Transferi o homogeneizado (figura 1B) para um tubo de centrífuga 15ml frio.
    12. Enxágue o homogenizador com 1 mL de frio 1x buffer de IE (do kit de isolamento de ER) e adicione isto ao resto do homogeneizado.
  3. Isolamento de LD
    1. Remova núcleos por centrifugação o homogeneizado em uma centrífuga de alta capacidade a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C (Figura 1).
    2. Transferi o sobrenadante pós-nucleares (PNS) para um tubo de centrífuga de 50ml novo, frio. Para evitar a perda de LD, certifique-se de que qualquer lipídico reuniram-se na parte superior do tubo 15ml é resuspended antes de transferir o PNS.
    3. Levar um 100 µ l alíquota do PNS para análise de pureza e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL. Coloque-a em gelo.
    4. Para remover as mitocôndrias, centrifugar a amostra PNS, não a alíquota, numa centrifugadora refrigerada de alta velocidade a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
      1. Opcional: para isolados de LD (CLD) bruto (com contaminação do citosol e membrana celular), recolher a camada lipídica superior utilizando uma pipeta de vidro e transferi-lo para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL. Continue a secção 1.4.
    5. Transferi o sobrenadante postmitochondrial (PMS) para um tubo de se. Para evitar a perda de LD, certifique-se de que qualquer lipídico reuniram-se na parte superior é resuspended antes de transferir o PMS.
    6. Levar um 100 µ l alíquota das POM para análise de pureza e colocá-lo em um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL. Coloque-a em gelo.
    7. Encha um tubo se até a borda com frio 1x buffer de IE para evitar que o tubo em colapso durante a ultracentrifugação.
    8. Equilibrar as amostras e centrifugue-los em um se a 100.000 x g durante 60 min a 4 ° C (Figura 1).
    9. Para remover a camada de LD, incline o tubo em um ângulo de 45° e usar uma pipeta de vidro para aspirar. Transferi o sedimento para um tubo de microcentrifugadora frio 1,7 mL.
      Nota: A pelota contém ER isolada. Use esta fração a jusante para isolamento de ER.
    10. Colete 100 µ l do sobrenadante post-ER (PER) sob a camada lipídica para análise de pureza.
  4. Lavagem de LD
    1. Adicione a fração LD coletada em um tubo de microcentrifugadora 1.7, para um volume total de 1,3 mL 1X PBS.
    2. A amostra de vórtice.
    3. Centrifugue em microcentrifuga em alta velocidade por 5 min a 4 ° C para quaisquer detritos de célula de Pelotas. Aquecer o tubo delicadamente com as mãos para ajudar Ressuspender a camada de LD. Transferi o sobrenadante, incluindo a camada lipídica, para um novo tubo de microcentrifuga 1,7 mL.
    4. Repita as etapas 1.4.1–1.4.3 2 x x-3, até que o sedimento não é mais visível.
    5. Adicione o LD da pelota-livre sobrenadante para um volume final de 1,5 mL 1X PBS. Lavagem da fração lipídica por centrifugação em microcentrifuga em alta velocidade por 5 min a 4 ° C.
    6. Retire 1 mL de 1X PBS (por baixo da camada lipídica) com uma pipeta de vidro sem perturbar a camada lipídica.
    7. Repita as etapas 1.4.5 e 1.4.6 4 x x-5, até o PBS 1x é visualmente transparente com nenhuma turbidez.
    8. Remover todos os 1X PBS abaixo da camada de lipídios, usando uma pipeta de vidro (Figura 1E).
    9. Use o resultado, uma fração LD puro, para análise a jusante.
  5. Quantificação de proteína LD por ensaio de ácido bicinchoninic
    Nota: Não utilize um ensaio de ácido bicinchoninic (BCA) se LD morfologia é para ser avaliado.
    1. Resuspenda o LD em 500 μL de PGPE 5%.
    2. Ferva por 5 min a 95 ° C, as amostras de vórtice-los e incubar as amostras à temperatura ambiente por 5 min esfriar.
    3. Repita a etapa 1.5.2 um adicional x 2.
    4. Proceda à sonicação das amostras por 5 min com um 30 s ligar/desligar o ciclo, a intensidade média.
    5. Normalize as amostras por medir a concentração de proteína em todas as amostras de análise de pureza e na fração LD por ensaio BCA.

2. isolamento de LD usando gradiente de densidade de sacarose

  1. Preparação
    1. Fazer 200 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCl [pH 7,4], 1 mM EDTA [pH 8.0]). Calma, colocando-o no gelo.
    2. Fazer 100 mL de solução de sacarose de 60% (p/v) em tampão TE dissolvendo-se 60 g de sacarose em tampão TE, trazendo o volume final de 100 mL. Calma, colocando-o no gelo.
    3. Fazer 6 mL de solução de sacarose de 40% (p/v) adicionando-se 4 mL de 60% de sacarose para 2 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.
    4. Fazer 6 mL de solução de sacarose de 25% (p/v) adicionando 2,5 mL de 60% de sacarose para 3,5 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.
    5. Fazer 4 mL de solução de sacarose 10% (p/v) adicionando 0,7 mL de 60% de sacarose para 3,3 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.
    6. Fazer 10 mL da solução de inibidor de protease e fosfatase adicionando um comprimido de inibidores de protease e fosfatase para 10 mL de tampão TE.
    7. Prepare o buffer de homogeneizado de tecido, acrescentando 4 mL de solução de inibidor de protease e fosfatase a 50 mL de solução de sacarose a 60%. Calma, colocando-o no gelo.
    8. Prepare o buffer de sobreposição, acrescentando 2 mL de solução de inibidor de protease e fosfatase para 50 mL de tampão TE. Calma, colocando-o no gelo.
    9. Prepare 100 mL de 1X PBS diluindo-se 10 mL de PBS de x 10 em 90 mL de água ultrapura. Calma, colocando-o no gelo.
    10. Prepare-se 10 mL de 5% PGPE por diluição 500 µ l do PGPE em 9,5 mL de água ultrapura. Use uma seringa de 1 mL para medir PGPE como é viscoso. Calma, colocando-o no gelo.
    11. Legal os seguintes tubos de centrífuga, colocando-os no gelo: 1,7 mL microcentrifuge tubos, tubos de centrífuga de 15 mL, tubos de centrífuga de alta velocidade de 50 mL e tubos de se de 13 mL.
    12. Legal os centrifugadores exigidos para 4 ° c: um microcentrifuga, uma centrífuga de alta capacidade (para tubos de 15 mL), uma centrífuga de alta velocidade (para tubos de 50 mL) e uma se.
  2. Preparação do tecido
    1. Use 1.2.1–1.2.9 de passos para preparar o tecido para homogeneização.
    2. Adicionar 7 mL de tampão de homogeneizado de tecido frio e homogeneizá-lo no gelo, movendo o pilão e descer 20 x. Durante os primeiros cinco traços, certifique-se do que pilão vai para o fundo do homogenizador.
    3. Transferi o homogeneizado para um tubo de centrífuga 15ml frio.
    4. Enxágue o homogenizador com 1 mL de tampão de homogeneizado de tecido frio e transferir para tubo de centrífuga 15ml utilizado anteriormente.
    5. Trazer o volume do homogeneizado até 10 mL com tampão de homogeneizado de tecido.
    6. Centrifugar a amostra em uma centrífuga de alta capacidade a 1.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    7. Transferência 8 mL do sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 mL.
    8. Transferi 100 µ l do sobrenadante restante como amostra PNS para análise de pureza.
  3. Gradiente de sacarose
    1. Incline o tubo de centrifugação de 50 mL contendo o 8mL de PNS em um ângulo de 45°. Cuidadosamente, adicione 6 mL de solução de 40% de sacarose, garantindo que as duas fases fiquem separadas.
    2. De forma semelhante, lentamente adicione 6 mL de solução de sacarose de 25%; em seguida, adicione 4 mL de solução de sacarose 10%; Finalmente, adicione 8 mL de tampão de sobreposição.
    3. Centrifugar a amostra em uma centrífuga de alta velocidade a 30.000 x g a 4 ° C por 30 min.
    4. Transferi a camada superior que contém o LDs para um tubo de microcentrifugadora 1,7 mL.
    5. Para lavagem de LD, siga os passos na secção 1.4.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nós temos realizado o isolamento LD com o kit de ER em aproximadamente 30 ratos e comparados os resultados com aqueles que seguem o protocolo de isolamento de sacarose em aproximadamente 40 ratos. Os resultados relatados são típicos para ambos os protocolos. Os ratos foram jejuou durante a noite com livre acesso à água, para aumentar o rendimento de LD. Isolamento de LD, usando um gradiente de sacarose foi executado em paralelo com o kit de ER protocolo de isolamento de LD. Amostras de PN...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hepática biologia LD está cada vez mais sendo reconhecida como um regulador crítico da fisiologia hepatocelular na saúde e na doença. Como organelas de boa-fé, LDs são dinâmico, interagem com outras estruturas celulares e conter dentro os componentes bioativos envolvidos na homeostase lipídica e a glicose. O gradiente de sacarose é usado rotineiramente para isolamento de LD e permite que os investigadores estudar a estrutura da LD, mas os obriga a fazer vários buffers. Nós demonstramos que o uso de um kit de isolamento E...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Carr recebe apoio de pesquisa Pharmaceuticals interceptar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a família Abramson Cancer Research Institute. Este trabalho é apoiado por subsídios seguintes: NIH/tinham R01 AA026302-01, NIH/tinham K08-AA021424, Fundação Robert Wood Johnson, Harold Amos Medical faculdade desenvolvimento Award, 7158, IDOM RDC piloto prêmio P30 DK019525 (R.M.C.); NIH/TINHAM F32-AA024347 (JC). Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH P30-DK050306 e programa de concessão de suas instalações de núcleo (Patologia Molecular e Imaging Core, núcleo de expressão de Gene/Biologia Molecular e celular núcleo de cultura) e o seu piloto. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Misturador de vórtice BioExpressGeneMateS-3200-1Centrífuga misturadora de vórtice
54242 REppendorf54242 RMicrocentrífuga de balcão refrigerado
Rotor: FA-45-24-11
Centrífuga Sorvall RC6 +Thermo ScientificRC6+Centrífuga refrigerada de alta velocidade
Rotor: Centrífuga F21S-8x50y
Sorvall Legend RT+Thermo ScientificLegend RT+Centrífuga Refrigerada de Alta Capacidade
Rotor: 75006445 Balde: 75006441
Inibidor de Protease Completo CoquetelSigma Aldrich04 693 116 001Comprimidos Inibidores de Protease
Diagenode Bioruptur UCD-200Sistema de SonicaçãoDiagenodeUCD-200
Moedor de Tecidos Dounce (45 mL)Wheaton357546Uso Pilão
soltoKit deCorning21-031-CM
Sigma AldrichER0100Para kit de ER Extração:
Contém:
Tampão de Extração Isotônica 5X 100 mL
Tampão de Extração Hipotônica 10 mL
Cloreto de cálcio, solução 2,5 M 5 mL
OptiPrep Gradiente de Densidade Meio 100 mL
Agulha de Ponta Cega 1 ea.
Fonte de luz externa para excitação fluorescenteLeicaLeica EL6000
Ácido clorídricoSigma AldrichH1758Ácido clorídrico
ImageJSoftware de análise de imagem
Microscópio de contraste de modulação invertidaLeica LeicaDM IRB
Kit de enriquecimento de lisossomo para tecidos e células cultivadasThermo Fisher Scientific89839Para Microscópio de Isolamento de Lisossomo
CâmeraQimagingQICAM fast 1394
Optima XL-100K UltracentrifugeBeckman-CoulterXL-100KUltracentrifuge
Rotor: SW41Ti
Pipetas PasteurFisher Scientific22-042817
Placa de Petri 5 cmFisher ScientificFB0875713A
Kit de Ensaio de Proteína BCA PierceThermo Fisher Scientific23225
PhosSTOPSigma Aldrich04 906 845 001Comprimidos Inibidores de Fosfatase
Estéril Lâmina Cirúrgica #10PioneerS2646
SucroseFisher ScientificS5-500Cristalino/Certificado ACS
Triglicerídeo Liquicolor KitStanbio 2200-225Base colorimétrica Tris
BaseTris Fisher ScientificBP152-1Para tampão TE
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151-1005%, Polietilenoglicol p- (1,1,3,3-tetrametilbutil) -éter fenílico, Reagente de Lise
de Proteína UltraPure EDTA (0,5M, pH 8,0)Thermo Fisher Scientific15575-038Para tampão TE
Isolamento de Retículo Endoplasmático Tampão Tampão com Fosfato da Dulbecco

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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