Crescimento e caracterização de organóides irradiados de glândulas mamárias

Resumo

Organóides desenvolvidos a partir de glândulas mamárias do camundongo foram irradiados e caracterizados para avaliar características epiteliais e interações com células imunes. Os organóides irradiados podem ser usados para melhor avaliar as interações célula-célula que podem levar ao recrutamento de células tumorais em tecido normal irradiado.

Resumo

Os organóides derivados do tecido digerido são construções tridimensionais multicelulares (3D) que melhor recapitulam as condições in vivo do que as monolayers celulares. Embora não possam modelar completamente a complexidade in vivo, mantêm alguma funcionalidade do órgão original. Em modelos de câncer, os organóides são comumente usados para estudar a invasão de células tumorais. Este protocolo tem como objetivo desenvolver e caracterizar organóides do tecido mamário do camundongo normal e irradiado para avaliar a resposta à radiação em tecidos normais. Estes organoids podem ser aplicados aos estudos in vitro futuros do cancro para avaliar interações da pilha do tumor com organoids irradiados. As glândulas mamárias resected, irradiadas a 20 GY e digeridas em uma solução do colagenase VIII. Os organoids epithelial foram separados através da diferenciação centrífuga, e os organoids 3D foram desenvolvidos em microplates da baixo-adesão do 96-well. Os organoids expressaram o marcador epithelial característico Cytokeratin 14. A interação dos macrófagos com os organóides foi observada em experimentos de cocultura. Este modelo pode ser útil para o estudo de interações tumor-estromal, infiltração de células imunes e polarização de macrófagos dentro de um microambiente irradiado.

Introdução

Aproximadamente 60% dos pacientes com câncer de mama triplo negativo (TNBC) escolhem a terapia conservadora da mama (BCT) como forma de tratamento¹. Nesta modalidade do tratamento, o tumor que contem a parte do tecido do peito é removido, e o tecido normal circunvizinho é exposto à radiação ionizante para matar todas as pilhas residuais do tumor. O tratamento reduz a recorrência em grande parte da população de câncer de mama; Entretanto, aproximadamente 13,5% dos pacientes tratados com TNBC experimentam recidivas locoregionais². Portanto, estudar como a radiação pode recrutar células tumorais circulantes (CTCs) levará a ....

Protocolo

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos institucionais aprovados pela Comissão de cuidados e uso de animais institucionais da Universidade Vanderbilt.

1. preparação de camundongos e aquisição de células (adaptado de Nguyen-Ngoc et al.¹¹)

1. Sacrifique ratos de nu/nu atímicos (8-10 semanas velho) usando a asfixia de co₂ seguida pela deslocação cervical. Limpe a pele com 70% de etanol.
2. Resect glândulas mamárias abdominais e inguinais de camundongos usando tesouras pré-esterilizadas e fórceps. Remover linfonodos antes da ressecção. Enxaguar em soro fisi....

Resultados

Os organóides mamários epiteliais irradiados foram obtidos com sucesso de glândulas mamárias de camundongo, processadas e cultivadas em placas de baixa adesão (Figura 1). A produção de organóides foi testada por semeadura em diferentes ambientes de crescimento (Figura 2a-G). Semeando pilhas diretamente na cultura do tecido tratou 10 placas de pilha do cm rendeu um overgrowth de pilhas do fibroblasto. Fibroblastos foram identificados em microscopia de contraste de fase em ou .......

Discussão

Neste protocolo, desenvolvemos um método de crescimento reprodutível e caracterização de organóides mamários irradiados (Figura 1). Uma dose da irradiação de 20 GY foi aplicada para espelhar modelos in vivo precedentes do recrutamento da pilha do tumor⁵. A irradiação de glândulas mamárias ex vivo antes da formação organoide permitiu o isolamento de efeitos de dano de radiação sem uma infiltração correspondente de células imunes. O desenvolvimento de um modelo de tecid.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
10% Neutro Tamponado Formalina	VWR	16004-128
Anti-citoqueratina 14	abcam	ab181595	Lote: GR3200524-3
Albumina de soro bovino	Sigma	A1933-25G
Colágeno Tipo I	Corning	354236
Colagenase de Clostridium Histolyticum, Tipo VIII	Sigma	C2139
Collagenase I	Gibco	17018029
DMEM/F12	Thermofisher	11320-033
DNAse	Roche	10104159001
DPBS	Fisher	14190250
E-Caderina	Sinalização Celular	24E10	Lote: 13
FBS	Sigma	F0926
Gentamicina	Gibco	15750
Cabra anti-coelho secundário	abcam	ab150077	verde Lote: GR3203000-1
Cabra anti-coelho secundário	abcam	ab150080	vermelho Lote: GR3192711-1
Hoechst 33342	Fisher	62249	Lote: TG2611041
Insulina (10 mg/mL)	Sigma	I9278
Insulina-Transferrina-Selênio, 100x	Gibco	51500-056
Membrana basal Matrigel (membrana basal extraída do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm)	Corning	356237
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
Nuclon Sphera 96 placas de poços	Thermo	174927
PBS	VWR	10128-856
Caneta / estreptococo	Fisher
Faloidina	abcam	ab176757	Lote: GR3214582-16
Proteína de Junção Apertada 1	Novus	NBP1-85047	Lote: C115428
Triton X-100 (4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol)	Sigma	X100-100ML
Tripsina	Gibco	27250-018
Tween-20 (Polietilenoglicol sorbitano monolaurato)	Sigma	P1379-100ML

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