Este trabalho apresenta um método cirúrgico para dissecando Drosophila pupal retina juntamente com protocolos para o processamento de tecido para extração de RNA, análise ocidental e imuno-histoquímica.
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Artigo de método
Dissecação da Retina Pupal drosófila para imuno-histoquímica, análise ocidental e isolamento de RNA
Neste artigo
Resumo
Resumo
A retina pupal Drosophila fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de processos morfogenéticas durante o desenvolvimento. Neste trabalho, apresentamos um protocolo confiável para a dissecação da retina pupal Drosophila delicada. Nossa abordagem cirúrgica utiliza ferramentas prontamente disponíveis microdissection para abrir pupas e extrair precisamente complexos de olho-cérebro. Estas podem ser fixas, submetidas a imuno-histoquímica e retinas então montadas em corrediças do microscópio e fotografadas se o objetivo é detectar estruturas celulares ou subcelulares. Alternativamente, as retinas não fixadas podem ser isoladas do tecido cerebral, lysed em buffers apropriadas e utilizadas para proteína gel de electroforese ou mRNA extração (avaliar a expressão de proteínas ou gene, respectivamente). Paciência e prática significativa podem ser necessária para dominar o microdissection protocolo descrito, mas uma vez dominado, o protocolo permite isolamento relativamente rápido da retina principalmente sem danos.
Introdução
A retina de Drosophila é composta de aproximadamente 750 omatídeos, rodeados por células de pigmento, dispostas em um favo de mel lattice1,2,3,4. Cada omatídeo contém oito neurônios fotoreceptor, quatro células cone secretoras de lente e duas células primárias de pigmento. Ao redor cada omatídeo são células produtoras de pigmento do retículo e grupos de cerdas sensoriais. Devido à sua natureza pós mitótica e estereotipado arranjo hexagonal, Drosophila pupal retina fornece um sistema de excelente modelo para o estudo de proc....
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Protocolo
1. tecido preparação
- Configurar Drosophila cruza (conforme descrito anteriormente20) ou cultura específicas cepas de drosófila para obter pupas do genótipo desejado. Para garantir que um grande número de pupas emerge coincidentemente, estabelecer essas culturas voar em duplicado na mídia de alimentos ricos em nutrientes ou padrão alimentar mídia generosamente suplementadas com levedura-colar.
- Manter as culturas de Drosophila , a 25 ° C. Para cruzamentos utilizando o sistema de UAS-GAL4, GMR-GAL4 é um condutor ideal expressado nas células do disco olho larval posteriores ao sulco morfogenét....
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Resultados
O olho pupal é um tecido facilmente acessível que serve como um excelente modelo para investigar os processos de desenvolvimento que morfogênese da unidade. Aqui, podemos ter dissecado as retinas e usado a imunofluorescência para detectar as junções adherens apical (Figura 3A, C) ou a caspase Dcp-1 (Figura 3D) que é ativada durante a apoptose (Figura 3)25. Essas abordagens permitem observar c.......
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Discussão
O método de dissecação de olho pupal drosófila descrito aqui permite o isolamento de 6 a 10 complexos de olho-cérebro dentro de 10 a 15 min. No entanto, paciência e prática são essenciais para dominar a técnica de dissecação e melhorar a qualidade e a velocidade de dissecações. Desta vez de dissecação curto garante que cada olho é aproximadamente mesmo fase de desenvolvimento, reduzindo a variabilidade na expressão do fenótipo ou gene de retina em um conjunto de dados. Enquanto protocolos alternativos podem exig.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos a Zack tambor e nossos revisores para comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela R15GM114729.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adobe Photoshop | Software de processamento de imagem | Adobe | |
| Talas de bambu, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Beta mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Fosfato de beta-glicerol | Sigma-Aldrich | 50020 | |
| Prato | Prato de Petri de vidro preenchido até a borda com SYLG170 ou SYLG184 (colorido de preto com pó de carvão finamente moído). Deixe em temperatura ambiente por 24-48 h para polimerizar. | ||
| Porta-lâminas | Fine Science Tools | 10053 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| comprimidos de coquetel inibidores de protease completos e sem EDTA Microscópio | Roche | 4693132001 | |
| (Zeiss LSM 501) | Carl Zeiss | ou microscópio similar | |
| Dietilpirocarbonato (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 | |
| Fita dupla face | 3M | 665 | |
| Drosophila meio alimentar, rico em nutrientes | 7,5% de sacarose, 15% de glicose, 2,5% de ágar, 20% de levedura de cerveja, 5% de peptona, 0,125% de MgSO4,7H2O, 0,125% de CaCl2,2H20 | ||
| Drosophila meios alimentares, receita padrão de | fubá do centro de estoque de Bloomington Drosophila. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) | ||
| Ácido etilenodiaminotetracético | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Solução | 4% formadeído em PBS, pH 7,4. | ||
| Microscópio de fluorescência (microscópio TCS SP5 DM) | Leica Microsystems | ou microscópio similar | |
| Fórceps | Ferramentas de ciência fina | 91150-20 | A pinça deve ser afiada com frequência. |
| Formaldeído | Thermo Scientific | 28908 | |
| Pratos de vidro com 9 poços | Corning | 7220-85 | Também conhecido como pratos de 9 poços |
| Lamínulas de vidro (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Lâminas de microscópio de vidro (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Placa de Petri de vidro | Corning | 3160-100BO | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Software Image Studio versão 5.2.5 | LI-COR Biosciences | Software de processamento de imagens para quantificação de Western blots. | |
| Tampão de amostra Laemmli | Bio-Rad | 161-0737 | 2X tampão de amostra de proteína concentrada, suplemento com beta mercaptoetanol de acordo com as instruções do fabricante. |
| Marcador de pista reduzindo o buffer de amostra | Tampão de amostra de proteína concentrada | ThermoFisher Scientific | 39000 |
| Tubos de microcentrigura | Axygen | MCT-175-C | |
| Ferramentas de Ciência Fina | 15000-03 | ||
| Bandejas de Micropoços (72 x 10 µ Poços L) | Nunc | 438733 | |
| Meios | 0,5% N-propilgalato e 80% glicerol em PBS | ||
| N-propilgalato | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| PBS livre de nuclease (PBS em 0,1% DEPC, pH 7,4) | Adicione o volume apropriado de DEPC ao PBS, misture bem e incube durante a noite em temperatura ambiente com agitação constante. Autoclave por pelo menos 20 minutos. Armazene a 4° C | ||
| PBS (solução salina tamponada com fosfato pH 7,4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare de acordo com as instruções do fabricante |
| PBS+pi (PBS mais inibidores de protease e fosfatase) | 10mM NaF, 1mM beta-glicerol fosfato e 1mM Na3VO4 em PBS, pH 7,4. | ||
| PBT | 0,15% TritonX e 0,5% de albumina de soro bovino em PBS, pH 7,4 | ||
| Suporte de pinos | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Anticorpo primário: cabra anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | Para Western blotting. Usado a 1:3000 |
| Anticorpo primário: Dcp-1 de coelho anticlivado | Sinalização celular | 9578S | Para imunofluorescência. Usado a 1:100 |
| Anticorpo primário: anti-DEcad de rato | Estudos de Desenvolvimento Banco de Hibridoma | DCAD2 | Para imunofluorescência. Usado a 1:20 |
| Anticorpo primário: rato anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Presente de Tadashi Uemura. Usado em 1:100. |
| Kit de extração de RNA: Relia Prep RNA tissue Miniprep kit | Reagente | Z6110 | |
| Rnase (RNase Away) | Molecular BioProducts | 7002 | |
| Lâminas de bisturi | Fine Science Tools | 10050 | Quebre um pequeno pedaço de lâmina de escape e prenda no suporte da lâmina. |
| Anticorpo secundário: IgG anti-rato de burro conjugado com 488 (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | Para imunofluorescência. Usado a 1:200 |
| Anticorpo secundário: IgG anti-coelho de cabra conjugada com cy3 (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | Para imunofluorescência. Usado a 1:100 |
| Anticorpo secundário: Tecnologia de sinalização celular anti-rato IgG (H+L) de cabra conjugada com HRP | 7077 | Para Western blotting. Usado a 1:3000 | |
| Anticorpo secundário: IgG anti-cabra de coelho conjugado com HRP (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | Para Western blotting. Usado a 1:3000 |
| Cloreto de Sódio | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fluoreto de Sódio | Sigma-Aldrich | 215309 | |
| Vanadato de Sódio | Espectrofotômetro Sigma-Aldrich | 50860 | |
| (NanoDrop) | ThermoFisher Scientific | 2000c | |
| Microscópio de dissecação estéreo (M60 ou M80) | Leica Microsystems | ou microscópio similar | |
| Sylgard (preto) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparente) | Dow Corning | SYLG184 | Cor preta com pó de carvão finamente moído |
| Tecido: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trizma hydrochloride pH7.5 | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Agulha de tungstênio, fina | Fine Science Tools | 10130-10 | Insira no suporte do pino |
| Agulha de tungstênio, resistente | Fine Science Tools | 10130-20 | Insira no suporte do pino |
| WTLB (tampão de lise de tecido ocidental) | NaCl 150mM, Triton X-100 a 1,5%, EDTA 1mM, glicerol a 20%, NaF 10mM, fosfato de betaglicerol 1mM e Na3VO4 1mM em Tris-HCl 50mM (pH 7,5). Suplemento com uma mesa de coquetel de protease completa por 10 mL de solução. | ||
| Pasta de levedura | (supermercado local) | Aproximadamente 2 colheres de sopa de levedura ActiveDry de Fleischmann (ou similar) dissolvida em ~20 mL de H2O destilada |
Referências
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Developmental biology. 136 (2), 346-362 (1989).
- Wolff, T., Ready, D. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview. 1277-1325 (1993).
- Carthew, R. W.
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Reimpressões e permissões
