Estudando efeitos de radiação tecidual normais usando Hydrogels de matriz extracelular

Summary

Este protocolo apresenta um método para a decelularização e a formação subseqüente do hidrogel de almofadas gordas mamária murino que seguem a irradiação ex vivo.

Abstract

A radiação é uma terapia para pacientes com câncer de mama triplo negativo. O efeito da radiação na matriz extracelular (ECM) do tecido saudável do peito e de seu papel no retorno local no local preliminar do tumor é desconhecido. Aqui nós apresentamos um método para o decellularization, o lyophilization, e a fabricação de hidrogéis do ECM derivados das almofadas gordas mamária murino. Os resultados são apresentados sobre a efetividade do processo de descelularização, e os parâmetros reológicos foram avaliados. As células de câncer de mama com rótulo de GFP e luciferase encapsuladas nos hidrogéis demonstraram um aumento na proliferação de hidrogéis irradiados. Finalmente, a mancha do conjugado do faloidina foi empregada para visualizar a organização do citoesqueleto de pilhas encapsuladas do tumor. Nosso objetivo é apresentar um método para fabricar hidrogéis para estudo in vitro que imitam o ambiente do tecido mamário in vivo e sua resposta à radiação, a fim de estudar o comportamento das células tumorais.

Introduction

O câncer é caracterizado por excesso de proliferação de células que podem evadir a apoptose e também metastasizar para locais distantes¹. O câncer de mama é uma das formas mais comuns entre as fêmeas nos EUA, com uma estimativa de 266.000 novos casos e 40.000 mortes em 2018². Um subtipo particularmente agressivo e difícil de tratar é o cancro da mama triplo negativo (TNBC), que carece de receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (RP), e fator de crescimento epidérmico humano (HER2). A radioterapia é comumente usada no câncer de mama para eliminar células tumorais residuais após a lumpectomia, mas mais de 13% ....

Protocol

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos institucionais aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Vanderbilt.

1. preparação e irradiação ex vivo de MFPs

1. Sacrifique camundongos de nu/nu camundongos (8 – 10 semanas) usando o asfixia do co₂ seguido pela deslocação cervical.
2. Limpe a pele usando 70% de etanol.
3. Colete almofadas de gordura mamárias (MFPs) de camundongos sacrificados usando tesouras pré-esterilizadas e fórceps em um tubo cônico de 15 mL contendo meios completos de RPMI (RPMI suplementado com 1% de penicilina-estrep....

Results

Os MFPs foram descelularizados depois da irradiação usando o procedimento mostrado na Figura 1a. As MFPs pré-descelularizadas (Figura 1b) e pós-descelularização (Figura 1C) são mostradas. A descelularização foi confirmada com coloração de hematoxilina e eosina (H & E), e a coloração de 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naftol foi utilizada para avaliar o teor lipídico (Figura,2). As propriedades reológicas dos hidrogéis .......

Discussion

Este método de formação de hidrogel é em grande parte dependente da quantidade de tecido inicial. Os MFPs murinos são pequenos, e o processo de descelularização resulta em uma redução significativa do material (tabela 1). O processo pode ser repetido com mais MFPs para aumentar o rendimento final. O fresamento é outro passo importante que pode levar à perda de material. Outros mostraram sucesso com um moinho criogênico, mas este protocolo é baseado na moagem através de uma argamassa de mão e broca elétri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formalina tamponada neutra a 10%, cubo com torneira	VWR	16004-128-2-metilbutano
	Alfa Aesar	19387-AR
2000ex Reômetro	TA Instruments	10D4335	reômetro
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A1933-25G-calceína
acetoximetil (calceína AM)	Molecular Probes, Inc.	C1430-D-Luciferina
Firefly, sal de potássio	Biosynth Química & Biologia	L-8820	(S) -4,5-Dihidro-2- (6-hidroxi-2-benzotiazolil) -4-ácido tiazolecarboxílico sal
de potássio DPX Mountant para Histologia	Sigma-Aldrich	06522-500ML-Dulbecco's
solução salina tamponada com fosfato	Gibco	14040133-Eosina-Y
com Phloxine	Richard-Allan Scientific	71304	homodímero
	de etídio eosinaSondas Moleculares, Inc.	E1169	homodímero de etídio-1 (EthD-1)
Soro bovino fetal	Sigma-Aldrich	F0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. Composto	Fisher Scientific	23-730-571	meio de incorporação de criostato
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	meio de montagem à base de água
FreeZone 4.5	Labconco	7751020	liofilizador
Hoechst 33342 Solução (20 mM)	Thermo Scientific	62249	corante fluorescente azul
Ácido clorídrico	Sigma-Aldrich	258148-500ML-IVIS
Lumina III	PerkinElmer	Sistema de imagem de	bioluminescência
Kimtech Science Kimwipes	Kimberly Clark		lenços
de tarefas delicadasn-Propanol (Livre de Peróxido/Sequenciamento), Fisher BioReagents	Fisher Scientific	BP1130-500-Oil
Red O	Sigma-Aldrich	O0625-25G	1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinder	OPS Diagnostics, LLC	CG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4	Quality Biological, Inc.	119-069-151	salina tamponada com fosfato
	Gibco	15140-122-Pepsina
da mucosa gástrica suína	Sigma-Aldrich	P6887-5G	pepsina
Ácido peracético	Sigma-Aldrich	77240-100ML-Faloidina-iFluor
594 Reagente (ab176757)	abcam	ab176757	conjugado
de faloidinaPropilenoglicol	Sigma-Aldrich	W294004-1KG-K-Richard-Allan
Reagente azulado da série da assinatura científica	Richard-Allan Scientific	7301L	Agente azulado
da série da assinatura da Richard-Allan Scientific Hematoxilina 7211	Richard-Allan Scientific	7211-RPMI
Medium 1640	Gibco	11875-093-Desoxicolato	de
sódio, 98%	Frontier Scientific	JK559522	ácido desoxicólico
Sacarose	Sigma-Aldrich	S5016-Triton
x-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML	em>t-Octylphenoxypolyetoxyethanol
Trypsin-EDTA (0,25%), fenol vermelho	Gibco	25200-056-Whatman
papel de filtro qualitativo, Grau 4	Whatman	1004-110	papel de filtro qualitativo de grau 4
Xilenos (ACS certificado), Fisher Chemical	Fisher Scientific	X5-4	-