Method Article

Estudando efeitos de radiação tecidual normais usando Hydrogels de matriz extracelular

DOI:

10.3791/59304

⸱

July 24th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 2Department of Radiation Oncology, Stanford University, 3Depattment of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 4Department of Radiation Oncology, Vanderbilt University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo apresenta um método para a decelularização e a formação subseqüente do hidrogel de almofadas gordas mamária murino que seguem a irradiação ex vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A radiação é uma terapia para pacientes com câncer de mama triplo negativo. O efeito da radiação na matriz extracelular (ECM) do tecido saudável do peito e de seu papel no retorno local no local preliminar do tumor é desconhecido. Aqui nós apresentamos um método para o decellularization, o lyophilization, e a fabricação de hidrogéis do ECM derivados das almofadas gordas mamária murino. Os resultados são apresentados sobre a efetividade do processo de descelularização, e os parâmetros reológicos foram avaliados. As células de câncer de mama com rótulo de GFP e luciferase encapsuladas nos hidrogéis demonstraram um aumento na proliferação de hidrogéis irradiados. Finalmente, a mancha do conjugado do faloidina foi empregada para visualizar a organização do citoesqueleto de pilhas encapsuladas do tumor. Nosso objetivo é apresentar um método para fabricar hidrogéis para estudo in vitro que imitam o ambiente do tecido mamário in vivo e sua resposta à radiação, a fim de estudar o comportamento das células tumorais.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O câncer é caracterizado por excesso de proliferação de células que podem evadir a apoptose e também metastasizar para locais distantes1. O câncer de mama é uma das formas mais comuns entre as fêmeas nos EUA, com uma estimativa de 266.000 novos casos e 40.000 mortes em 20182. Um subtipo particularmente agressivo e difícil de tratar é o cancro da mama triplo negativo (TNBC), que carece de receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (RP), e fator de crescimento epidérmico humano (HER2). A radioterapia é comumente usada no câncer de mama para eliminar células tumorais residuais após a lumpectomia, mas mais de 13% dos pacientes com TNBC ainda experimentam recidiva no sítio primário do tumor3.

Sabe-se que a radioterapia é efetiva na mitigação da metástase e recorrência, pois a combinação de lumpectomia e radiação resulta na mesma sobrevida em longo prazo que a mastectomia4. Entretanto, tem-se mostrado recentemente que o tratamento de radiação é associado com o retorno local ao local preliminar do tumor em ajustes imunocomprometidos5,6. Além disso, é bem sabido que a radiação modifica a matriz extracelular (ECM) do tecido normal induzindo fibrose7. Conseqüentemente, é importante compreender o papel de mudanças radiação-induzidas do ECM em diating o comportamento da pilha do tumor.

Os tecidos decelularizados têm sido utilizados como modelos in vitro para o estudo da doença8,9. Estes tecidos decelularizados preservam a composição do ECM e recapitulam o complexo ECM in vivo. Este ECM descelularizados do tecido pode mais ser processado e digerido para dar forma a hidrogéis reconstituídos do ECM que podem ser usados para estudar o crescimento da pilha e a função10,11. Por exemplo, os hidrogéis injetáveis derivados do lipoaspirado humano decelularizado e do tecido miocárdico serviram como métodos não invasivos de engenharia tecidual, e um hidrogel derivado do tecido pulmonar porcino foi utilizado como método in vitro de teste fixação e viabilidade de células-tronco mesenquimais12,13,14. O efeito de dano normal da radiação do tecido em Propriedades do ECM, entretanto, não foi investigado.

Os hidrogéis derivados do ECM têm o maior potencial para o estudo in vitro de fenômenos in vivo. Vários outros materiais foram estudados, incluindo colágeno, fibrina e matrigel, mas é difícil recapitular sinteticamente a composição do ECM13. Uma vantagem do uso de hidrogéis derivados de ECM é que o ECM contém as proteínas e fatores de crescimento necessários para um determinado tecido14,15. A irradiação do tecido normal durante lumpectomy causa mudanças significativas ao ECM, e os hidrogéis ECM-derivados podem ser usados para estudar este efeito in vitro. Este método poderia conduzir a uns modelos in vitro mais complexos e mais exatos da doença.

Neste estudo, nós sujeitamos almofadas gordas mamária murino (MFPs) à radiação ex vivo. Os MFPs foram descelularizados e feito na solução do pre-gel. Os hydrogels foram dados forma com as pilhas 4T1 encaixadas, uma linha celular murino de TNBC. As propriedades reológicas do material do hidrogel foram examinadas, e a dinâmica da pilha do tumor foi avaliada dentro dos hydrogels. Hidrogéis fabricados a partir de MFPs irradiados reforçada proliferação de células tumorais. Os estudos futuros incorporarão outros tipos da pilha para estudar interações da pilha-pilha no contexto do retorno do cancro depois da terapia.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e protocolos institucionais aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Vanderbilt.

1. preparação e irradiação ex vivo de MFPs

  1. Sacrifique camundongos de nu/nu camundongos (8 – 10 semanas) usando o asfixia do co2 seguido pela deslocação cervical.
  2. Limpe a pele usando 70% de etanol.
  3. Colete almofadas de gordura mamárias (MFPs) de camundongos sacrificados usando tesouras pré-esterilizadas e fórceps em um tubo cônico de 15 mL contendo meios completos de RPMI (RPMI suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina e 10% de soro bovino fetal) (ver a tabela de materiais ).
  4. Irradiar amostras para 20 GY usando uma fonte de césio.
  5. Traga os MFPs irradiados e complete a mídia RPMI em um gabinete de biossegurança. A mídia será dependente da linha celular a ser cultivada no hidrogel final. Encha os pratos de 6 cm ou 10 cm com mídia suficiente para submergir os MFPs. Para pratos de 6 cm, use 8 mL de mídia, e para pratos de 10 cm, use 20 mL de mídia.
  6. Incubar em uma incubadora de 37 ° c/5% CO2 por dois dias. O período de tempo na incubadora pode ser ajustado.
  7. Enxague os tecidos em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), limpe o excesso de umidade e coloque MFPs em tubos cônicos de 15 mL para armazenamento a-80 ° c até a decelularização. Esta etapa de congelamento auxilia a etapa de decelularização e a amostra deve ser congelada mesmo que os próximos passos estejam de outra forma prontos.

2. decellularization (adaptado das referências12,16,17)

Nota: este procedimento foi adaptado de métodos previamente publicados com foco na decelularização adiposa, que incluiu o detergente iônico de desoxicolato de sódio em vez de sulfato de sódio para remover o DNA eficientemente12,16 , a 17.

  1. No dia 1, remova MFPs congelados de-80 ° c e descongele à temperatura ambiente.
  2. Uma vez descongelados, MFPs secos brevemente em uma tarefa delicada limpe. Pesar os MFPs usando uma escala analítica.
  3. Usando um par de fórceps com tesouras ou um bisturi, divida o tecido acima em 3 milímetros x 3 milímetros x 3 milímetros de amostras para o estudo do ECM intacto e do tecido restante para a produção do hidrogel.
    Observação: o número de amostras depende do número de métodos de teste, por exemplo, a coleta de duas amostras é descrita abaixo: uma para incorporação de parafina (etapa 2,5) e outra para congelamento no meio de incorporação de criostat, se desejado (ver a tabela de materiais e passo 2,6).
  4. Pesar os tecidos. Se a incorporação em parafina para o corte, continue a etapa 2,5. Se o congelamento em meio de incorporação de criostat para corte, continue a etapa 2,6.
  5. Em uma capa química, mergulhe o tecido em formalina tamponada neutra de 10% (NBF) (veja a tabela de materiais) por 24 h a 4 ° c. Lave 3 vezes em PBS por 5 min cada. Submergir o tecido em 30% de sacarose por 48 h a 4 ° c.
    1. Pesar o tecido agora que esta peça foi removida. Continue para a etapa 2,6.
  6. Em um capuz químico, coloque peças MFP em uma gaveta rotulada preparada com meio de incorporação de criostat. Adicione mais meio de incorporação de criostat para cobrir o tecido.
    1. Coloque a fita em uma taça de 2-metilbutano (ver a tabela de materiais) que é pré-arrefecida com nitrogênio líquido. O béquer deve ter 2-metilbutano suficiente para cobrir o fundo, mas não o suficiente para submergir a gaveta porque o meio de incorporação de criostat não deve tocar o 2-metilbutano. Deixe a gaveta sentar-se no 2-methylbutane até que o criostato que encaixa o meio congele e se torne opaco.
    2. Enrole o (s) Cassette (es) em folha, etiqueta e deixe-o a-80 ° c até ser utilizado para o corte.
      Nota: os tecidos colocados imediatamente no meio de incorporação do criostat foram seccionados a 5 μm, enquanto os tecidos incubados em sacarose foram seccionados a 30 μm para reter a morfologia adipocitada.
  7. Use fórceps para massagear manualmente o tecido remanescente.
    Nota: as peças de tecido também podem ser colocadas em 10% NBF por 24 – 48 h, enxaguadas em PBS, e deixadas em etanol a 70% até a incorporação em parafina. Após a incorporação, podem ser utilizadas secções de 5 μm para coloração de hematoxilina e eosina (H & E) (ver secção 7 abaixo).
  8. Coloque os MFPs em pratos de 6 cm com 5 mL de solução de 0, 2% de tripsina/0,05% de EDTA. Incubar a 37 ° c por 1 h. Pulverize e limpe os pratos com 70% de etanol antes de colocar na incubadora.
  9. Use os filtros de 0,7 milímetros para lavar os MFPs com água deionizada (di) derramando a água sobre o tecido três vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre as lavas.
  10. Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Coloque os tecidos em uma taça pré-esterilizada contendo uma barra de agitação apropriadamente dimensionada. Cubra os tecidos com 60 mL de 3% t-octylphenoxypolyethoxyethanol (veja a tabela de materiais) por 1 g de tecido e mexa por 1 h à temperatura ambiente. Use um mínimo de 20 mL.
  11. Despejar tecido e conteúdo em um filtro. Enxague o copo com água DI e despeje sobre os tecidos. Repita mais duas vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre enxaguos.
  12. Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Coloque os tecidos e mexa as barras de volta nos mesmos copos e cubra com 60 mL de ácido desoxicólico a 4% por 1 g de tecido. Mexa por 1 h à temperatura ambiente. Use um mínimo de 20 mL.
  13. Despeje o tecido e o conteúdo em um filtro de malha. Enxague o copo com água DI e despeje sobre os tecidos. Repita mais duas vezes. Use fórceps para massagear manualmente o tecido entre enxaguos.
  14. Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa.
  15. Coloque os tecidos na mesma taça com água fresca de DI suplementada com 1% de penicilina-estreptomicina. Cubra firmemente com película de parafina. Deixe durante a noite a 4 ° c.
  16. Lave os filtros e os copos para uso no dia seguinte.
  17. No dia 2, drenar o conteúdo da Taça em um filtro. Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa.
  18. Coloque MFPs no mesmo copo com uma barra de agitação apropriadamente dimensionada. Cubra com 60 mL de solução de ácido peracético a 4% de etanol/0,1% por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 2 h à temperatura ambiente.
  19. Despeje o tecido e o conteúdo em um filtro de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta no copo. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de 1X PBS por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min à temperatura ambiente. Repita uma vez.
  20. Despeje o tecido e o conteúdo em um filtro de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido. Coloque o conteúdo de volta em taça. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL DI de água por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min à temperatura ambiente. Repita uma vez.
  21. Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Despejar tecido e conteúdo em um filtro. Use fórceps para massagear manualmente o tecido.
  22. Coloque o conteúdo de volta em taça. Cubra os tecidos com 60 mL de 100% n-propanol por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 1 h à temperatura ambiente.
  23. Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Despeje o tecido e o conteúdo em um filtro de 0,7 mm. Use fórceps para massagear manualmente o tecido.
  24. Coloque o conteúdo de volta em taça. Lave o tecido cobrindo-o com 60 mL de água de DI por 1 g de tecido. Use um mínimo de 20 mL. Mexa por 15 min à temperatura ambiente. Repita três vezes.
  25. Despejar tecido e conteúdo em um filtro. Repita as etapas 2.3 – 2.6 para coletar pedaços de tecido para incubação de sacarose e congelamento no meio de incorporação de criostat.
  26. Momentaneamente o tecido seco em uma tarefa delicada limpa e pesa. Coloque em um tubo de 15 mL rotulado. Congelar a-80 ° c durante a noite.

3. liofilização

  1. Retire os tubos de 15 mL de-80 ° c e coloque no gelo seco. Mantenha as amostras congeladas em gelo seco até o liofililizante.
  2. Retire as tampas. Use uma faixa de borracha para prender uma tarefa delicada Limpe à parte superior para cobrir a abertura. Coloque amostras no liofililizante durante pelo menos 2 dias.
  3. Retire as amostras do liofililizante e coloque os tubos em gelo seco. Remova as limpezas delicadas da tarefa pesam cada amostra em uma escala analítica. Anexar tampas e colocar em-80 ° c durante a noite.

4. Fresamento

  1. Encha um recipiente raso com nitrogênio líquido. Retire as amostras do congelador-80 ° c. Pesar cada MFP liofilizado.
  2. Coloque uma amostra no almofariz. Use uma luva criogênica para segurar o almofariz no nitrogênio líquido.
  3. Use um pilão anexado a uma broca portátil para moer a amostra. Moinho em intervalos de 1 min para verificar o progresso e remover a mão gloved do nitrogênio líquido. Moinho para um mínimo de 5 min.
  4. Repita para todas as amostras. Pulverize e limpe o almofariz e o pilão com etanol entre cada amostra.
  5. Armazene amostras pulverizadas em tubos de 15 mL a-80 ° c até estar pronto para uso.
    Nota: as amostras podem ser usadas imediatamente ou armazenadas durante a noite.

5. formação de hidrogel

  1. Se armazenado em-80 ° c durante a noite, retire e descongele à temperatura ambiente. Enquanto descongelar, calcule o peso necessário de pepsina (ver tabela de materiais) e volume de ácido clorídrico (HCL) necessário para cada amostra que resulta em uma solução com 1% w/v pó de amostra e 0,1% w/v pepsina em 0, 1 M HCL. Adicione a pepsina à HCL para formar uma solução de Pepsin-HCl.
  2. Adicione o pó da amostra e a solução de Pepsin-HCl a um tubo de 15 mL. Adicione uma pequena barra de agitação, e mexa para 48 h.
  3. Coloque os tubos no gelo por 5 min. calcule o volume necessário de PBS 10x necessário para cada amostra que resulte em uma solução com uma concentração de 1X PBS. Adicione o volume apropriado de 10x PBS a cada tubo.
  4. Adicionar 10% v/v 0,1 M NaOH a cada solução para atingir o pH 7,4. Use um papel de pH para testar individualmente.
    Nota: a solução de gel pode ser armazenada a 4 ° c durante uma semana.

6. encapsulando células em hidrogéis

  1. Usando células rotuladas por GFP e luciferase
    1. Usando a solução do gel do pH 7,4, Ressuspender GFP-e células 4T1 luciferase-etiquetadas a uma concentração de 500.000 ou de 1 milhão pilhas/mL da solução do gel. Adicione 16 μL da solução da gel-pilha a cada poço de uma corrediça da câmara de 16 poços. Incubar por 30 min a 37 ° c.
    2. Adicione 100 μL de mídia RPMI completa a cada poço. Continue a incubação para 48 h em 37 ° c. As células GFP-e luciferase-etiquetadas podem ser visualizadas usando a microscopia de fluorescência em 0 horas, 24 horas, e 48 horas após a gelação.
      Nota: a proliferação celular pode ser medida para as células 4T1 rotuladas por GFP e luciferase, usadas aqui, adicionando (S)-4, 5-dihidro-2-(6-hidroxi-2-benzothiazolyl)-sal de potássio ácido tiazolecarboxílico (ver a tabela de materiais) aos poços por 10 min e realizando a imagem de bioluminescência usando um sistema de imagem de bioluminescência (ver tabela de materiais). Após a imagem de bioluminescência, o citoesqueleto pode ser visualizado (ver secção 10).
  2. Usando células sem rótulo
    1. Usando a solução do gel do pH 7,4, Ressuspender células 4T1 sem rótulo peletizada a uma concentração de 500.000 ou 1 milhão Cells/ml da solução do gel. Adicione 16 μL da solução da gel-pilha a cada poço de uma corrediça da câmara de 16 poços e de uma placa 96-well. Incubar por 30 min a 37 ° c.
    2. Adicione 100 μL de mídia a cada poço. Continue a incubação para 48 h em 37 ° c.
      Nota: a viabilidade celular pode ser medida (ver secção 11). A corrediça da câmara de 16 poços pode ser usada para a imagem latente, e a placa 96-well pode ser usada para a quantificação.

7. coloração de H & E

  1. Para o tecido fixado em formalina, parafina-encaixado, as corrediças de submergir que contêm seções de 5 μm duas vezes em 100% xileno (5 – 10 minutos) para o de-paraffinization. Rehidrate submergindo em 100%, 95%, 85% e 70% etanol por 5 min cada seguido por água DI por 5 min. continue a etapa 7,6.
  2. Para seções de tecido congelado, tomar seções imediatamente do congelador e submergir-los em 10% NBF por 10 min. Lave em 1X PBS três vezes por 5 min cada. Enxaguar em água durante 5 min.
  3. Núcleos de mancha com hematoxilina por 3 min. Enxague em água corrente da torneira.
  4. Diferencie-se mergulhando 1 – 2 vezes em álcool ácido 0,3% (0,3% HCl em 70% etanol). Enxágüe em água corrente da torneira durante 5 min.
  5. Adicione o agente bluing por 30 s. enxágüe em água corrente da torneira por 5 min. Mergulhe em etanol a 95% por 30 s.
  6. Incubar com eosina para 90 s à temperatura ambiente. Desidrata em 3 alterações de 100% de etanol por 5 min cada.
  7. Submerge duas vezes em 100% de xileno por 5 min cada. Adicionar distyrene-plastificante-xileno (DPX0 montagem de mídia para o slide e adicionar uma lamínula. Deixe-a curar durante a noite antes da imagem.

8.1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol coloração

  1. Prepare 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol solução.
    1. Adicionar 0,5 g de 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol pó para um copo com 100 mL de propilenoglicol. Aqueça a 95 – 100 ° c enquanto mexendo durante pelo menos 30 min. Evite que a temperatura exceda 100 ° c.
    2. Retire o copo do lume e deixe arrefecer ligeiramente. Derrame a solução através do papel de filtro qualitativo da classe 4 para remover todas as partículas residuais.
      Nota: a solução pode ser armazenada à temperatura ambiente e deve ser filtrada através de um filtro de seringa de 0,45 μm imediatamente antes da coloração.
  2. Mancha congelados seções de tecido.
    1. Retire as lâminas do congelador-80 ° c e seque por 30 min. pre-Cool 10% NBF a-20 ° c por 30 min em um frasco de Coplin. Fixar os slides à temperatura ambiente durante 10 min. Lave em água de DI 3 vezes por 5 min cada.
    2. Retire o excesso de água usando uma delicada tarefa limpe antes de mergulhar em propilenoglicol 2 vezes por 5 min cada. Retire as lâminas do propilenoglicol. Não enxague.
    3. Coloque as lâminas em seringa filtrada óleo vermelho O solução de coloração para 3 h à temperatura ambiente.
    4. Diferenciar colocando slides em 85% propilenoglicol por 5 min. Enxágüe amostras em PBS duas vezes por 5 min cada.
    5. Amostras de mancha com hematoxilina por 30 s. Lave na água da torneira running por 5 minutos e coloc então as corrediças na água do DI.
    6. Monte amostras usando o meio de montagem baseado aquosa e permita que os meios seque durante a noite antes da imagem latente.

9. reologia

  1. Traga soluções pré-gel do passo 5,4 para o Reômetro no gelo.
  2. Fixe um braço e uma placa de 25 mm ao Reômetro. Abra o software de reologia no computador conectado ao Reômetro.
  3. Realize o mapeamento rotacional e determine a lacuna zero. Levante o braço quando terminar.
  4. Pipeta 500 μL de pré-gel na placa. Abaixe o braço até que a solução do pre-gel ocupe completamente a abertura entre a placa e o braço. Seja conservador porque abaixar o braço após este ponto conduzirá à solução do pre-gel que derrama fora do lado.
  5. Realize uma varredura da freqüência na solução do pre-gel de 0.1-100 Hertz depois que permaneceu no ° c 37 por 30 minutos.
  6. Levante o braço do Reômetro quando completo. Limpe o líquido com uma limpeza delicada da tarefa. Enxague com água DI e limpe com uma delicada limpeza de tarefas. Repita os passos 9.4 – 9.6 com amostras adicionais.

10. coloração conjugada com Phalloidin de F-Actina

  1. Traga a solução conjugada de faloidina à temperatura ambiente. Centrifugue momentaneamente em uma baixa velocidade antes da abertura. Aliquot suficiente solução para o ensaio, e armazenar o resto em-20 ° c.
  2. Diluir a solução de ações conjugadas de 1000x faloidina para uma solução de trabalho 1x adicionando 1 μL de solução de estoque a 1 ml 1X PBS + 1% de albumina sérica bovina (BSA). Isto faz bastante para 10 poços (100 μL/poço).
    Nota: um pode usar Plain 1X PBS, mas 1X PBS + BSA é preferível para evitar faloidina conjugado de furar ao tubo. Não guarde esta solução após o ensaio. 1 μL de corante fluorescente azul (ver a tabela de materiais) a solução de trabalho pode ser adicionada à mancha para núcleos. A solução de trabalho pode ser feita misturando 1 μL de corante fluorescente azul de 20 mM com 11,3 μL 1X PBS.
  3. Aspirar suportes de poços (passo 6,1). Enxaguar poços com 1X PBS.
  4. Adicionar 10% NBF. Incubar poços com 10% de NBF por 20 min à temperatura ambiente. Remover sobrenadante. Lave 3 vezes com PBS durante 5 min de cada vez.
  5. Adicionar 0,1% t-octylphenoxypolyethoxyethanol em PBS por 5 min. aspirar e lavar 3 vezes com PBS por 5 min de cada vez.
  6. Adicione 100 μL de solução de trabalho da etapa 10,2 a cada poço. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Aspirar e lavar 3 vezes com PBS por 5 min de cada vez. Deixar em PBS a 4 ° c.
  7. Aspirar e remover os poços da junta na corrediça da câmara. Use a pinça do nariz da agulha para remover a junta do slide. Amostras de montagem e de lamínula com meio de montagem aquosa. Permitir a cura (5 min).
  8. Observe as células um microscópio de fluorescência na excitação/emissão de 590/618 nm.

11. ensaio de viabilidade

  1. Enxágüe as pilhas com o PBS de Dulbecco (DPBS). Adicionar 100 μl de dpbs contendo 1 μm de calceina am e 2 μm de etídio homodímero a cada poço. Incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
  2. Imagem a corrediça da câmara de 16 poços pela microscopia de fluorescência. Calceina acetoxymethyl (calcein AM) pode ser observada na excitação/emissão = 494/517 nm. O homodímero de ethidium pode ser observado na excitação/emissão = 528/645 nanômetro.
  3. Leia a placa 96-well em um leitor da placa usando os mesmos comprimentos de onda na etapa 11,2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os MFPs foram descelularizados depois da irradiação usando o procedimento mostrado na Figura 1a. As MFPs pré-descelularizadas (Figura 1b) e pós-descelularização (Figura 1C) são mostradas. A descelularização foi confirmada com coloração de hematoxilina e eosina (H & E), e a coloração de 1-([4-(Xylylazo) xylyl] azo)-2-naftol foi utilizada para avaliar o teor lipídico (Figura,2). As propriedades reológicas dos hidrogéis ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este método de formação de hidrogel é em grande parte dependente da quantidade de tecido inicial. Os MFPs murinos são pequenos, e o processo de descelularização resulta em uma redução significativa do material (tabela 1). O processo pode ser repetido com mais MFPs para aumentar o rendimento final. O fresamento é outro passo importante que pode levar à perda de material. Outros mostraram sucesso com um moinho criogênico, mas este protocolo é baseado na moagem através de uma argamassa de mão e broca elétri...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores agradecem ao Dr. Laura L. Bronsart por fornecer as células GFP-e luciferase-4T1, Dr. Edward l. lagory para o Conselho em 1-([4-(xylylazo) xylyl] azo)-2-naphthol que mancha, Dr. Craig L. Duvall para ivis e uso do Liofilizador, e Dr. Scott A. guelcher para o Reômetro Usar. Esta pesquisa foi apoiada financeiramente pela concessão de NIH #R00CA201304.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Formalina tamponada neutra a 10%, cubo com torneiraVWR16004-128-2-metilbutano
Alfa Aesar19387-AR
2000ex ReômetroTA Instruments10D4335reômetro
Albumina de soro bovinoSigma-AldrichA1933-25G-calceína
acetoximetil (calceína AM)Molecular Probes, Inc.C1430-D-Luciferina
Firefly, sal de potássioBiosynth Química & BiologiaL-8820(S) -4,5-Dihidro-2- (6-hidroxi-2-benzotiazolil) -4-ácido tiazolecarboxílico sal
de potássio DPX Mountant para HistologiaSigma-Aldrich06522-500ML-Dulbecco's
solução salina tamponada com fosfatoGibco14040133-Eosina-Y
com PhloxineRichard-Allan Scientific71304homodímero
de etídio eosinaSondas Moleculares, Inc.E1169homodímero de etídio-1 (EthD-1)
Soro bovino fetalSigma-AldrichF0926-500ML-Fisher
Healthcare Tissue-Plus O.C.T. CompostoFisher Scientific23-730-571meio de incorporação de criostato
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01meio de montagem à base de água
FreeZone 4.5Labconco7751020liofilizador
Hoechst 33342 Solução (20 mM)Thermo Scientific62249corante fluorescente azul
Ácido clorídricoSigma-Aldrich258148-500ML-IVIS
Lumina IIIPerkinElmerSistema de imagem debioluminescência
Kimtech Science KimwipesKimberly Clarklenços
de tarefas delicadasn-Propanol (Livre de Peróxido/Sequenciamento), Fisher BioReagentsFisher ScientificBP1130-500-Oil
Red OSigma-AldrichO0625-25G1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naphthol
OPS Diagnostics CryoGrinderOPS Diagnostics, LLCCG-08-02-PBS
(10X), pH 7.4Quality Biological, Inc.119-069-151salina tamponada com fosfato
Gibco15140-122-Pepsina
da mucosa gástrica suínaSigma-AldrichP6887-5Gpepsina
Ácido peracéticoSigma-Aldrich77240-100ML-Faloidina-iFluor
594 Reagente (ab176757)abcamab176757conjugado
de faloidinaPropilenoglicolSigma-AldrichW294004-1KG-K-Richard-Allan
Reagente azulado da série da assinatura científicaRichard-Allan Scientific7301LAgente azulado
da série da assinatura da Richard-Allan Scientific Hematoxilina 7211Richard-Allan Scientific7211-RPMI
Medium 1640Gibco11875-093-Desoxicolatode
sódio, 98%Frontier ScientificJK559522ácido desoxicólico
SacaroseSigma-AldrichS5016-Triton
x-100Sigma-AldrichX100-100MLem>t-Octylphenoxypolyetoxyethanol
Trypsin-EDTA (0,25%), fenol vermelhoGibco25200-056-Whatman
papel de filtro qualitativo, Grau 4Whatman1004-110papel de filtro qualitativo de grau 4
Xilenos (ACS certificado), Fisher ChemicalFisher ScientificX5-4-
CLS136334 Penicilina-estreptomicina <

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. The hallmarks of cancer. Cell. 100 (1), 57-70 (2000).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. Lowery, A. J., Kell, M. R., Glynn, R. W., Kerin, M. J., Sweeney, K. J. Locoregional recurrence after breast cancer surgery: a systematic review by receptor phenotype. Breast Cancer Research and Treatment. 133 (3), 831-841 (2012).
  4. Miller, K. D., et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2016. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (4), 271-289 (2016).
  5. Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy. Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).
  6. Rafat, M., Aguilera, T. A., Vilalta, M., Bronsart, L. L., Soto, L. A., von Eyben, R., Golla, M. A., Ahrari, Y., Melemenidis, S., Afghahi, A., Jenkins, M. J., Kurian, A. W., Horst, K. C., Giaccia, A. J., Graves, E. E. Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence Following Radiation Therapy in Immunosuppressed Patients. Cancer Res. 75 (15), 4241-4252 (2018).
  7. Haubner, F., Ohmann, E., Pohl, F., Strutz, J., Gassner, H. G. Wound healing after radiation therapy: Review of the literature. Radiation Oncology. 7 (1), 1-9 (2012).
  8. Beachley, V. Z., et al. Tissue matrix arrays for high throughput screening and systems analysis of cell function. Nature Methods. 12 (12), 1197-1204 (2015).
  9. Tian, X., et al. Organ-specific metastases obtained by culturing colorectal cancer cells on tissue-specific decellularized scaffolds. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 443-452 (2018).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Hinderer, S., Layland, S. L., Schenke-Layland, K. ECM and ECM-like materials — Biomaterials for applications in regenerative medicine and cancer therapy. Advanced Drug Delivery Reviews. 97, 260-269 (2016).
  12. Young, D. A., Ibrahim, D. O., Hu, D., Christman, K. L. Injectable hydrogel scaffold from decellularized human lipoaspirate. Acta Biomaterialia. 7 (3), 1040-1049 (2011).
  13. Singelyn, J. M., Christman, K. L., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30 (29), 5409-5416 (2009).
  14. Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
  15. Bonvillain, R. W., et al. A Nonhuman Primate Model of Lung Regeneration: Detergent-Mediated Decellularization and Initial In Vitro Recellularization with Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 18 (23-24), 2437-2452 (2012).
  16. Brown, B. N., et al. Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods. 17 (4), 411-421 (2011).
  17. Link, P. A., Pouliot, R. A., Mikhaiel, N. S., Young, B. M., Heise, R. L. Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (119), 1-9 (2017).
  18. Massensini, A. R., et al. Concentration-dependent rheological properties of ECM hydrogel for intracerebral delivery to a stroke cavity. Acta Biomaterialia. 27, 116-130 (2015).
  19. Mierke, C. T., Frey, B., Fellner, M., Herrmann, M., Fabry, B. Integrin 5 1 facilitates cancer cell invasion through enhanced contractile forces. Journal of Cell Science. 124 (3), 369-383 (2011).
  20. Ahmadzadeh, H., et al. Modeling the two-way feedback between contractility and matrix realignment reveals a nonlinear mode of cancer cell invasion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), E1617-E1626 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Matrix HydrogelsRadiation EffectsDecellularization ProcessMurine Mammary Fat PadHydrogel FabricationRheological PropertiesCell Proliferation AssayPhalloidin Conjugate StainingFluorescence MicroscopyScanning Electron Microscopy

Related Articles