Avaliação da lateralização do hemisfério com registro de potencial de campo local bilateral no córtex motor secundário de camundongos

Summary

Nós apresentamos in vivo a gravação eletrofisiológicos do potencial local do campo (LFP) no córtice de motor secundário bilateral (m2) dos ratos, que podem ser aplicados para avaliar o lateralization do hemisfério. O estudo revelou níveis alterados de sincronização entre o m2 esquerdo e direito em camundongos APP/PS1 comparados aos controles de WT.

Abstract

Este artigo demonstra procedimentos completos e detalhados para o registro bilateral in vivo e a análise do potencial de campo local (LFP) nas áreas corticais de camundongos, que são úteis para avaliar possíveis déficits de lateralidade, bem como para avaliando a conectividade cerebral e o acoplamento de atividades de rede neural em roedores. Os mecanismos patológicos subjacentes à doença de Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa comum, permanecem em grande parte desconhecidos. A lateralidade alterada do cérebro foi demonstrada em pessoas envelhecendo, mas se a lateralização anormal é um dos primeiros sinais de AD não foi determinada. Para investigar isso, registramos LFPs bilaterais em camundongos modelo AD de 3-5 meses de idade, APP/PS1, juntamente com controles de tipo selvagem (WT) de littermate. Os LFPs do córtex motor secundário esquerdo e direito (m2), especificamente na banda gama, foram mais sincronizados em camundongos APP/PS1 do que nos controles de WT, sugerindo uma assimetria hemisférica declinada de m2 bilaterais neste modelo de mouse AD. Notavelmente, os processos de gravação e análise de dados são flexíveis e fáceis de realizar, e também podem ser aplicados a outras vias cerebrais ao realizar experimentos que se concentram em circuitos neuronais.

Introduction

A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência^1,2. A deposição de proteína beta-amilóide extracelular (proteína β-amiloide, aβ) e emaranhados neurofibrilares intracelulares (NFTS) são as principais características patológicas do anúncio^3,4,⁵, mas os mecanismos subjacentes ao AD a patogénese permanece em grande parte obscura. O córtex cerebral, uma estrutura-chave na cognição e memória, é prejudicado na AD⁶, e déficits motores como caminhada lenta, dificuldade em navegar pelo ambiente e distúrbios da marcha ocorrem com o avanço da idade⁷. O depósito de Aβ e os emaranhados neurofibrilary foram observados igualmente no córtice premotor (PMC) e na área motora suplementar (SMA) em pacientes de AD⁸ e em adultos mais velhos impactados cognitivamente⁹, indicando a participação de um motor danificado sistema na patogénese do AD.

O cérebro é formado por dois hemisférios cerebrais distintos que se dividem por uma fissura longitudinal. Um cérebro saudável exibe assimetrias estruturais e funcionais¹⁰, que é chamado de "lateralização", permitindo que o cérebro para lidar eficientemente com várias tarefas e atividades. O envelhecimento resulta em deterioração da cognição e locomoção, juntamente com a redução da lateralidade cerebral^11,12. As habilidades motoras do hemisfério esquerdo são prontamente aparentes no cérebro saudável¹³, mas na lateralidade aberrante do cérebro do anúncio ocorre como consequência da falha da dominância do hemisfério esquerdo associada à atrofia cortical esquerda^{14, 15,16}. Conseqüentemente, uma compreensão de uma alteração possível da lateralização do cérebro na patogénese do AD e nos mecanismos subjacentes pode fornecer introspecções novas na patogénese do AD e conduzir à identificação de biomarcadores potenciais para o tratamento.

A medida electrofisiológica é um método sensível e eficaz de avaliar mudanças nas atividades neuronal dos animais. A redução da assimetria hemisférica em idosos (HAROLD)¹⁷ tem sido documentada por pesquisa eletrofisiológica com tempo de transferência interhemisférico sincronizado, o que mostra enfraquecimento ou ausência de assimetria hemisférica para apresentação monauralmente estímulos de fala nos idosos¹⁸. Utilizando o app/ps1, um dos modelos de mouse de anúncios mais comumente usados¹⁹,^20,21,²², em combinação com a gravação extracelular bilateral in vivo de lfps no m2 esquerdo e direito, nós avaliaram possíveis déficits de lateralidade na AD. Além disso, com configurações de parâmetros simples, a função interna do software de análise de dados (veja a tabela de materiais) fornece uma maneira mais rápida e mais direta de analisar a sincronização de sinais elétricos do que matematicamente linguagem de programação complexa, que é amigável para iniciantes com eletrofisiologia in vivo .

Protocol

Todos os animais foram emparelhados-alojados em condições padrão (12 h luz/escuro, ambiente de temperatura constante, livre acesso a alimentos e água) de acordo com o ministério chinês de ciência e tecnologia de laboratório animais diretrizes e experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local da Universidade de Guangzhou. Este é um procedimento de não-sobrevivência.

Nota: para os dados mostrados nos resultados representativos, o APP/PS1 (B6C3-TG (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) camundongos duplos transgênicos e os controles Wild-Type (WT) de littermate aos 3-5 meses de idade foram utilizados para gravações (n = 10, por grupo).

1. anestesia animal e cirurgia

1. Pesar e anestesiizar o mouse pelo seu regime de anestesia aprovado de seu Comitê de cuidados com animais locais.
2. Realize um aperto da cauda ou do dedo do pé com fórceps para confirmar a anestesia profunda antes da cirurgia.
3. Posicione o mouse em um aparelho estereotódico e fixar a cabeça.
4. Aplique pomada ocular em ambos os olhos para manter úmido. Siga suas diretrizes de cuidados com animais locais em relação à analgesia pré e pós-operatória.
5. Depilar o cabelo usando cortadores cirúrgicos. Faça uma pequena incisão (12-15 mm) no meio da área cirúrgica exposta com tesouras. Usando fórceps, puxe suavemente o couro cabeludo para longe da linha média.
6. Separe a pele suavemente e retire o tecido residual. Limpe o crânio usando botões de algodão revestidos com peróxido de hidrogênio.
7. Perfure dois pequenos furos de raios 1,0-1,5 mm em ambos os lados esquerdo e direito do crânio para permitir a inserção dos microeletrodos de gravação nas regiões m2 um estereomicroscópio (Figura 1a).
   Nota: locais Estereotóricos de m2 bilaterais: 1,94 mm anterior à Bregma, 1,0 mm lateral à linha média e 0,8-1,1 mm ventral à dura-máter.
8. Retire a dura-máter cuidadosamente com uma agulha de tungstênio.
9. Puxe Micropipetas de borosilicato de vidro (diâmetro externo: 1,0 mm) como microeletrodos de gravação com resistência de 1-2 MΩ.
10. Insira dois microeletrodos de gravação separados preenchidos com 0,5 M de NaCl nos furos usando Micromanipuladores mecânicos (a 60 °, Figura 1B).

2. LFP gravações em m2 bilaterais de camundongos

1. Abaixe os eletrodos de vidro esquerdo e direito lentamente em coordenadas apropriadas de m2 bilaterais (Figura 1C).
2. Para o controle de qualidade, teste a resistência de cada eletrodo usando o amplificador diferencial antes de capturar LFPs.
3. Definir o processo de gravação em 0,1 Hz High-Pass e 1.000 Hz low-pass com 1, 000x amplificação.
4. Colete dados de LFP RAW digitalizados de pelo menos 60 s atividades espontâneas em estado estável, com camundongos respirando uniformemente a uma taxa respiratória de 2 respirações por segundo anestesia.
5. Após a gravação, levante lentamente os eletrodos para fora do cérebro, em seguida, eutanizar os camundongos por luxação cervical rápida.
6. Salve os dados e analise offline.

3. análise de correlação cruzada

1. Clique em análise-correlação de forma de onda no software de análise e importe os dados.
2. Configurações de parâmetro
   1. Defina um sinal de canal de forma de onda como o primeiro canal e o outro como a referência. Defina A largura como 2 e offset como 1 (Figura 2A).
   2. Defina a duração de ambos os LFPs para 100 s selecionando a hora de início e a hora de término. Pressione o botão process para realizar a análise de correlação cruzada (Figura 2B).
      Nota: os sinais bilaterais simultâneos com tais durações seriam longos bastante mostrar atividades espontâneas neuronal, revelando desse modo as propriedades básicas da sincronização.
3. Clique em arquivo-exportar comoe, em seguida, salve os resultados de correlação cruzada correspondentes ao gráfico pop-up resultante no formato. txt.
4. Abra o arquivo. txt (Figura 2C), remova os valores de correlação em intervalos de tempo variou 0 ± 0, 1 s (uma vez que duas ondas gama contínuas têm pelo menos 0, 1 s intervalo), em seguida, a média do resto dos dados de correlação cruzada na parte de atraso de tempo negativo ou média o resto dos dados de correlação cruzada na parte de retardo de tempo positiva.

4. análise da coerência

1. Importe e execute os dados no software de análise.
2. Atribua os dois sinais LFP para ser o primeiro e segundo canais de forma de onda separadamente. Em seguida, defina o valor do tamanho do bloco (Figura 3a).
   Nota: o tamanho do bloco significa o número de pontos de dados utilizados no FFT. Quanto maior o tamanho do bloco, melhor a resolução de freqüência. Aqui recomendamos configurá-lo como 4096.
3. Mova as linhas pontilhadas manualmente para garantir que a precisão de tempo dos sinais em ambos os canais esteja sendo definida como o mesmo período (Figura 3B). Pressione o botão Adicionar área para carregar a área e executar a análise de coerência.
4. Clique em arquivo -salvar como para salvar os resultados de coerência correspondentes ao gráfico de pop-up resultante no formato. txt (Figura 3B).

Results

Para verificar se a patologia precoce do AD prejudica a capacidade de lateralização do hemisfério, realizamos gravações de LFP extracelulares bilaterais no m2 esquerdo e direito de camundongos APP/PS1 e controles de WT (com idade de 3-5 meses), e analisamos a correlação cruzada destes LFPs direito. Nos camundongos WT, os resultados demonstraram que a correlação média entre os LFPs esquerdo e direito nos atrasos de tempo positivos diferiu significativamente do que nos atrasos de tempo negativos, implicando a existência de...

Discussion

Nós relatamos aqui o procedimento para a gravação extracelular in vivo bilateral, junto com analisar a sincronização de sinais da duplo-região LFP, que é flexível e fácil conduzir para estimar o lateralization do hemisfério do cérebro, assim como o conectividade, direcionalidade ou acoplamento entre as atividades neurais de duas áreas cerebrais. Isso pode ser amplamente utilizado para revelar não só as atividades grupo-neuronais, mas também algumas propriedades básicas da eletrofisiologia inter-regional, especia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplificador diferencial AC/DC	A-M Systems	Modelo 3000
Conversor digital analógico	Cambridge Electronic Design Ltd.	Micro1401
Micropipetas de vidro de borosilicato	Nanjing primavera ensinando empresa de equipamentos experimentais	161230	Diâmetro externo: 1,0 mm
Extrator de microeletrodo	Narishige	PC-10
NaCl	Guangzhou Fábrica de reagentes químicos	7647-14-5
Suporte de microeletrodo de pinos	World Precision Instruments, INC.
Spike2	Cambridge Design Eletrônico Ltda.
Estereomicroscópio	Zeiss	435064-9020-000
Aparelho estereotáxico	RWD Ciências da Vida	68045
Uretano	Sigma-Aldrich	94300