Avaliação da lateralização do hemisfério com registro de potencial de campo local bilateral no córtex motor secundário de camundongos

A doença de Alzheimer (AD) é a forma mais comum de demência^1,2. A deposição de proteína beta-amilóide extracelular (proteína β-amiloide, aβ) e emaranhados neurofibrilares intracelulares (NFTS) são as principais características patológicas do anúncio^3,4,⁵, mas os mecanismos subjacentes ao AD a patogénese permanece em grande parte obscura. O córtex cerebral, uma estrutura-chave na cognição e memória, é prejudicado na AD⁶, e déficits motores como caminhada lenta, dificuldade em navegar pelo ambiente e distúrbios da marcha ocorrem com o avanço da idade⁷. O depósito de Aβ e os emaranhados neurofibrilary foram observados igualmente no córtice premotor (PMC) e na área motora suplementar (SMA) em pacientes de AD⁸ e em adultos mais velhos impactados cognitivamente⁹, indicando a participação de um motor danificado sistema na patogénese do AD.

O cérebro é formado por dois hemisférios cerebrais distintos que se dividem por uma fissura longitudinal. Um cérebro saudável exibe assimetrias estruturais e funcionais¹⁰, que é chamado de "lateralização", permitindo que o cérebro para lidar eficientemente com várias tarefas e atividades. O envelhecimento resulta em deterioração da cognição e locomoção, juntamente com a redução da lateralidade cerebral^11,12. As habilidades motoras do hemisfério esquerdo são prontamente aparentes no cérebro saudável¹³, mas na lateralidade aberrante do cérebro do anúncio ocorre como consequência da falha da dominância do hemisfério esquerdo associada à atrofia cortical esquerda^{14, 15,16}. Conseqüentemente, uma compreensão de uma alteração possível da lateralização do cérebro na patogénese do AD e nos mecanismos subjacentes pode fornecer introspecções novas na patogénese do AD e conduzir à identificação de biomarcadores potenciais para o tratamento.

A medida electrofisiológica é um método sensível e eficaz de avaliar mudanças nas atividades neuronal dos animais. A redução da assimetria hemisférica em idosos (HAROLD)¹⁷ tem sido documentada por pesquisa eletrofisiológica com tempo de transferência interhemisférico sincronizado, o que mostra enfraquecimento ou ausência de assimetria hemisférica para apresentação monauralmente estímulos de fala nos idosos¹⁸. Utilizando o app/ps1, um dos modelos de mouse de anúncios mais comumente usados¹⁹,^20,21,²², em combinação com a gravação extracelular bilateral in vivo de lfps no m2 esquerdo e direito, nós avaliaram possíveis déficits de lateralidade na AD. Além disso, com configurações de parâmetros simples, a função interna do software de análise de dados (veja a tabela de materiais) fornece uma maneira mais rápida e mais direta de analisar a sincronização de sinais elétricos do que matematicamente linguagem de programação complexa, que é amigável para iniciantes com eletrofisiologia in vivo .

Todos os animais foram emparelhados-alojados em condições padrão (12 h luz/escuro, ambiente de temperatura constante, livre acesso a alimentos e água) de acordo com o ministério chinês de ciência e tecnologia de laboratório animais diretrizes e experimentos foram aprovados pelo Comitê de ética local da Universidade de Guangzhou. Este é um procedimento de não-sobrevivência.

Nota: para os dados mostrados nos resultados representativos, o APP/PS1 (B6C3-TG (APPswe, PSEN1dE9) 85Dbo/J) camundongos duplos transgênicos e os controles Wild-Type (WT) de littermate aos 3-5 meses de idade foram utilizados para gravações (n = 10, por grupo).

1. anestesia animal e cirurgia

1. Pesar e anestesiizar o mouse pelo seu regime de anestesia aprovado de seu Comitê de cuidados com animais locais.
2. Realize um aperto da cauda ou do dedo do pé com fórceps para confirmar a anestesia profunda antes da cirurgia.
3. Posicione o mouse em um aparelho estereotódico e fixar a cabeça.
4. Aplique pomada ocular em ambos os olhos para manter úmido. Siga suas diretrizes de cuidados com animais locais em relação à analgesia pré e pós-operatória.
5. Depilar o cabelo usando cortadores cirúrgicos. Faça uma pequena incisão (12-15 mm) no meio da área cirúrgica exposta com tesouras. Usando fórceps, puxe suavemente o couro cabeludo para longe da linha média.
6. Separe a pele suavemente e retire o tecido residual. Limpe o crânio usando botões de algodão revestidos com peróxido de hidrogênio.
7. Perfure dois pequenos furos de raios 1,0-1,5 mm em ambos os lados esquerdo e direito do crânio para permitir a inserção dos microeletrodos de gravação nas regiões m2 um estereomicroscópio (Figura 1a).
   Nota: locais Estereotóricos de m2 bilaterais: 1,94 mm anterior à Bregma, 1,0 mm lateral à linha média e 0,8-1,1 mm ventral à dura-máter.
8. Retire a dura-máter cuidadosamente com uma agulha de tungstênio.
9. Puxe Micropipetas de borosilicato de vidro (diâmetro externo: 1,0 mm) como microeletrodos de gravação com resistência de 1-2 MΩ.
10. Insira dois microeletrodos de gravação separados preenchidos com 0,5 M de NaCl nos furos usando Micromanipuladores mecânicos (a 60 °, Figura 1B).

2. LFP gravações em m2 bilaterais de camundongos

1. Abaixe os eletrodos de vidro esquerdo e direito lentamente em coordenadas apropriadas de m2 bilaterais (Figura 1C).
2. Para o controle de qualidade, teste a resistência de cada eletrodo usando o amplificador diferencial antes de capturar LFPs.
3. Definir o processo de gravação em 0,1 Hz High-Pass e 1.000 Hz low-pass com 1, 000x amplificação.
4. Colete dados de LFP RAW digitalizados de pelo menos 60 s atividades espontâneas em estado estável, com camundongos respirando uniformemente a uma taxa respiratória de 2 respirações por segundo anestesia.
5. Após a gravação, levante lentamente os eletrodos para fora do cérebro, em seguida, eutanizar os camundongos por luxação cervical rápida.
6. Salve os dados e analise offline.

3. análise de correlação cruzada

1. Clique em análise-correlação de forma de onda no software de análise e importe os dados.
2. Configurações de parâmetro
   1. Defina um sinal de canal de forma de onda como o primeiro canal e o outro como a referência. Defina A largura como 2 e offset como 1 (Figura 2A).
   2. Defina a duração de ambos os LFPs para 100 s selecionando a hora de início e a hora de término. Pressione o botão process para realizar a análise de correlação cruzada (Figura 2B).
      Nota: os sinais bilaterais simultâneos com tais durações seriam longos bastante mostrar atividades espontâneas neuronal, revelando desse modo as propriedades básicas da sincronização.
3. Clique em arquivo-exportar comoe, em seguida, salve os resultados de correlação cruzada correspondentes ao gráfico pop-up resultante no formato. txt.
4. Abra o arquivo. txt (Figura 2C), remova os valores de correlação em intervalos de tempo variou 0 ± 0, 1 s (uma vez que duas ondas gama contínuas têm pelo menos 0, 1 s intervalo), em seguida, a média do resto dos dados de correlação cruzada na parte de atraso de tempo negativo ou média o resto dos dados de correlação cruzada na parte de retardo de tempo positiva.

4. análise da coerência

1. Importe e execute os dados no software de análise.
2. Atribua os dois sinais LFP para ser o primeiro e segundo canais de forma de onda separadamente. Em seguida, defina o valor do tamanho do bloco (Figura 3a).
   Nota: o tamanho do bloco significa o número de pontos de dados utilizados no FFT. Quanto maior o tamanho do bloco, melhor a resolução de freqüência. Aqui recomendamos configurá-lo como 4096.
3. Mova as linhas pontilhadas manualmente para garantir que a precisão de tempo dos sinais em ambos os canais esteja sendo definida como o mesmo período (Figura 3B). Pressione o botão Adicionar área para carregar a área e executar a análise de coerência.
4. Clique em arquivo -salvar como para salvar os resultados de coerência correspondentes ao gráfico de pop-up resultante no formato. txt (Figura 3B).

Para verificar se a patologia precoce do AD prejudica a capacidade de lateralização do hemisfério, realizamos gravações de LFP extracelulares bilaterais no m2 esquerdo e direito de camundongos APP/PS1 e controles de WT (com idade de 3-5 meses), e analisamos a correlação cruzada destes LFPs direito. Nos camundongos WT, os resultados demonstraram que a correlação média entre os LFPs esquerdo e direito nos atrasos de tempo positivos diferiu significativamente do que nos atrasos de tempo negativos, implicando a existência de assimetrias hemisféricas em áreas m2 de controles de WT (Figura 4 C; WT-positivo, 0, 8161 ± 0, 1246; PESO negativo, 0, 206 ± 0, 1218; p = 4.74531 E-4 < 0, 1 por um teste tde duas amostras). Em comparação, os LFPs esquerdo e direito dos camundongos APP/PS1 apresentaram maior sincronia no domínio temporal, sugerindo uma redução da assimetria entre o m2 esquerdo e direito (Figura 4C; APP/PS1-positivo, 0,13336 ± 0, 105 APP/PS1-negativo, 0,12635 ± 0, 1066; p = 0,64157 > 0, 5 por um teste tde duas amostras).

Em seguida, filtramos as oscilações gama dos LFPs (Figura 5a) e realizamos uma análise de coerência conforme descrito no protocolo para medir a similaridade de sinais elétricos na faixa de frequência gama. O resultado mostrou que a coerência gama entre m2 esquerdo e direito no APP/PS1 foi significativamente maior do que nos camundongos WT (Figura 5B, C; WT, 0,13267 ± 0, 598; APP/PS1, 0,17078 ± 0, 72; p = 0, 550 < 0, 1 por dois teste tde amostra), indicando uma maior sincronização e, consequentemente, redução da lateralização, entre m2 esquerdo e direito em camundongos app/ps1.

Figura 1 : Diagrama do procedimento de gravação simultâneo de LFP. (A) rato estereotódico com crânio exposto e dura-máter removida para a gravação bilateral in vivo de lfps no m2 esquerdo e direito. (B) dois microeletrodos de vidro em contato com a superfície cortical no furo perfurado simultaneamente. (C) gravação de microeletrodos juntamente com os fios Ag/AgCl como eletrodos de referência posicionados em locais apropriados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Ilustração da análise da Cruz-correlação. (A) configurações para a caixa de diálogo de correlação de forma de onda. Isso fornece opções para escolher qual canal de forma de onda é a referência e para analisar a correlação de dois sinais. (B) a caixa de diálogo processo. Isso fornece opções para definir o comprimento de tempo da forma de onda de referência e a duração de outra forma de onda será acrescentada. A análise só é feita para regiões de dados em que ambos os canais de forma de onda existem. (C) o arquivo example. txt com valores de correlação cruzada em intervalos de tempo negativos e positivos varia separadamente para as estatísticas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Ilustração da análise da coerência. (A) parâmetros para a caixa de diálogo de coerência. O tamanho do bloco determina o número de pontos de dados usados na análise e a resolução de frequência. (B) as linhas pontilhadas são ajustáveis para que o operador mova-se manualmente a fim ajustar a duração dos sinais para analisar. (C) depois que o software tiver criado um gráfico, clique em arquivo-salvar como para salvar os resultados de coerência como um arquivo com uma extensão de nome. txt. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : A correlação cruzada indica a lateralização do hemisfério recusada entre m2 esquerdo e direito de camundongos app/ps1. (A) traços brutos representativos de lfps gravados simultaneamente em m2 bilaterais de camundongos WT e app/ps1 utilizando o método de gravação extracelular (L: m2 esquerdo; R: m2 direito). (B) a curva de correlação cruzada mostra a correlação de sinais bilaterais de LFP em diferentes tempos de atraso. (C) entre m2 esquerdo e direito, os controles de WT mostraram um valor de correlação cruzada significativamente maior em intervalos de retardo de tempo positivos do que os negativos. Em contrapartida, o valor de correlação cruzada de camundongos APP/PS1 tem uma semelhança, indicando um declínio da assimetria (n = 10, por grupo). O valor representa a média ± erro padrão da média. p < 0, 1; teste tde duas amostras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Coerência das oscilações gama entre m2 esquerdo e direito de camundongos WT e app/ps1. (A) traços representativos de oscilações gama filtradas a partir de lfps no m2 esquerdo e direito. B) distribuição da coerência entre os lfps simultaneamente registados em m2 bilaterais. Os ratos APP/PS1 diferem em grande parte dos controlos WT na gama de frequências gama. C) a coerência entre as oscilações gama de m2 bilaterais em
Os mouses APP/PS1 são significativamente mais altos que os controles WT (n = 10, por grupo). O valor representa a média ± erro padrão da média. * *, p < 0, 1; teste tde duas amostras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada a revelar.