Processamento de imagem protocolo para análise de difusão e o tamanho do Cluster de receptores de membrana por microscopia de fluorescência

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para acompanhamento de análise de imagem que permite a avaliação quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de tamanhos de cluster e o movimento de partículas único detectados por microscopia de fluorescência de partícula única.

Abstract

Acompanhamento em uma sequência de vídeo e a análise posterior de suas trajetórias de partículas hoje em dia é uma operação comum em muitos estudos biológicos. Usando a análise dos receptores de membrana celular de clusters como modelo, apresentamos um protocolo detalhado para esta tarefa de análise de imagem usando Fiji (ImageJ) e rotinas de Matlab para: 1), definir as regiões de interesse e projetar máscaras adaptadas a estas regiões; 2) acompanhar as partículas em vídeos de microscopia de fluorescência; 3) analise as características de difusão e intensidade de faixas selecionadas. A análise quantitativa dos coeficientes de difusão, tipos de movimento e o tamanho do cluster obtidas por microscopia de fluorescência e processamento de imagem fornece uma ferramenta valiosa para determinar objetivamente a dinâmica da partícula e as consequências de modificar condições ambientais. Neste artigo apresentamos protocolos detalhados para a análise desses recursos. O método descrito aqui não só permite a detecção de rastreamento único-molécula, mas também automatiza a estimativa dos parâmetros de difusão lateral na membrana celular, classifica o tipo de trajetória e permite a análise completa, assim, superar a dificuldades em quantificar o tamanho de ponto ao longo de sua trajetória inteira na membrana celular.

Introduction

Proteínas de membrana incorporadas a bicamada lipídica estão em contínuo movimento devido à difusão térmica. Sua dinâmica é essencial para regular as respostas celulares, como interações intermoleculares permitem a formação de complexos que variam em tamanho de monômeros de oligômeros e influenciam a estabilidade de complexos de sinalização. Elucidar os mecanismos para controlar a dinâmica da proteína é, portanto, um novo desafio em biologia celular, necessária para compreender as vias de transdução de sinal e para identificar as funções da célula imprevistos.

Foram desenvolvidos alguns métodos ópticos para estudar essas interações na vida,....

Protocol

1. preparação de amostras biológicas

1. Desenvolvem-se células Jurkat em RPMI 1640 suplementado com 10% de FCS, NaPyr e L-glutamina (RPMI completa). Células Electroporate Jurkat (20 x 10⁶ células/400 µ l de RPMI 1640 com 10% de FCS) com um vetor de receptor do chemokine monomérica com rótulo GFP (CXCR4-AcGFP, 20 μg) para permitir que sua detecção usando microscopia de fluorescência.
   Nota: É possível usar outras proteínas monoméricas fluorescentes como mCherry, mScarlet, etc.
2. 24 h após a transfeccao analisar as células em um citômetro de fluxo para determinar tanto a viabilidade celular e a expressão do CXCR4-AcGFP.
....

Results

O uso deste protocolo permite o monitoramento automatizado de partículas detectada em filmes de microscopia de fluorescência e a análise de suas características dinâmicas. Inicialmente, as células são transfected com a proteína fluorescente acoplados a serem controladas. O nível adequado de receptores presentes na superfície das células, o que permite que o SPT é obtido por célula de triagem (Figura 1). Células selecionadas são analisadas por microscopia TIRF.......

Discussion

O método descrito é fácil de executar mesmo sem ter qualquer experiência anterior com Matlab. No entanto, rotinas Matlab extremamente exigem precisão com a nomenclatura dos diferentes comandos e a localização das diferentes pastas utilizadas pelo programa. No acompanhamento de rotina de análise (etapa 3), vários parâmetros podem ser modificados. A janela "Configuração Gaussian-mistura modelo encaixe" (passo 3.8) controla como U-faixa irá detectar partículas única no vídeo. Isso é feito colocando-se um modelo de mistura g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Células Jurkat humanas	ATCC	CRL-10915	Linha celular T humana. Qualquer outro tipo de célula pode ser analisado com este software
pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP	Clontech	632469	Diferentes proteínas fluorescentes podem ser seguidas e analisadas com este eletroporador de célula X de pulso de gene de rotina
	BioRad		Usamos 280 V, 975 mF, para células Jurkat.  Use o método de transfecção melhor trabalhando em suas mãos.
Citômetro de fluxo Cytomics FC 500	da Beckman Coulter
	Beckman Coulter		Dependendo do nível de transfecção, a classificação de células pode não ser necessária. Você também pode empregar células com expressão estável de níveis adequados do receptor de interesse.
Dako Qifikit	DakoCytomation	K0078	Usado para quantificar o número de receptores na superfície celular.
Placas de micropoços com fundo de vidro	MatTek corporation	P35G-1.5-10-C
Fibronectina humana de plasma	Sigma-Aldrich	F0895
CXCL12 humano recombinante	PeproTech	300928A
Leica AM TIRF invertido	Câmera Leica
EM-CCD	Andor	DU 885-CSO-#10-VP
MATLAB	O software MathWorks, Natick, MA
U-Track2	Danuser Laboratory
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
FiJi	FiJI		https://imagej.net/Fiji)
u-Track2 software			Ferramenta Matlab.  Para instalar, baixe .zip arquivo da página da web (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) e descompacte o arquivo em um diretório de sua escolha
Software GraphPad Prism	GraphPad