Imitando uma missão espacial para Marte, usando o membro posterior descarga e carga parcial tendo em ratos

Extraterrestres alvos, incluindo a lua e Marte, representam o futuro da exploração espacial humana, mas ambos têm gravidade consideravelmente mais fraca do que a terra. Enquanto as consequências da falta de gravidade no sistema músculo-esquelético têm sido muito estudadas em astronautas^1,2,3,4,5 e em roedores^{6, 7 , 8 , 9}, este último graças a bem estabelecida membro posterior descarga (HLU) modelo¹⁰, muito pouco é conhecido sobre os efeitos da gravidade parcial. Gravidade de Marte é 38% da terra e este planeta tornou-se o foco de longo prazo de exploração¹¹; Portanto, é crucial entender as alterações musculares que podem ocorrer neste cenário. Para isso, desenvolvemos um sistema de rolamento (PWB) parcial de peso em ratos¹², baseado no trabalho anterior, feito em ratos^6,13, que foi validado usando os resultados de ambos os músculos e ossos. No entanto, a exploração de Marte será precedida por um período prolongado de microgravidade, que não foi abordada no nosso modelo descrito anteriormente¹². Portanto, neste estudo, alterou o nosso modelo para imitar uma viagem a Marte, composto de uma primeira fase de descarga total membro posterior e imediatamente seguido por uma segunda fase do rolamento de peso parcial em 40% de carregamento normal.

Ao contrário da maioria dos modelos HLU, optamos por utilizar um cinto pélvico (baseado no descrito por Costa et al.⁹) ao invés de uma suspensão pela cauda para melhorar o conforto dos animais e ser capaz de se mover sem problemas e sem esforço de HLU para PWB em questão de minutos. Em conjunto, usamos os dispositivos de suspensão que anteriormente desenvolvido e descrito extensivamente¹²e gaiolas. Além de fornecer dados confiáveis/consistente, demonstrámos também anteriormente que o ponto de fixação fixa do sistema de suspensão no centro da haste não impediu que os animais da movimentação, aliciamento, alimentar ou beber. Neste artigo, descreveremos como descarregar patas dos animais (totalmente e parcialmente), verificar seus níveis de gravidade alcançados, bem como avaliar funcionalmente as alterações musculares resultantes usando aperto força e molhado massa muscular. Esse modelo seria extremamente útil para investigadores que pretendam investigar as consequências da gravidade parcial (artificial ou extraterrestre) em um sistema músculo-esquelético já comprometido, permitindo-lhes para investigar como os organismos se adaptam a parcial de recarga e para o desenvolvimento de contramedidas que poderiam ser desenvolvidas para manter a saúde durante e após os voos espaciais tripulados.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) do Beth Israel Deaconess Medical Center e institucional Cuidado Animal sob o protocolo número 067-2016.

Nota: Macho Wistar ratos com idade de 14 semanas no início do estudo (dia 0) são utilizados. Ratos são alojados individualmente em gaiolas personalizadas 24 h antes da linha de base para permitir a aclimatação.

1. membro posterior descarga

Nota: O cinto pélvico pode ser colocado em animais anestesiados ou acordados. Aqui, a descrição do protocolo é dado em animais anestesiados. Utilize equipamento de protecção pessoal adequado (EPI) para lidar com animais.

1. Coloque o rato em uma caixa de anestesia com isoflurano 3,5% e um fluxo de oxigênio de 2 L/min.
   Nota: Anesthetization adequada é confirmado quando uma empresa pitada da pata traseira não provocar uma reação.
2. Uma vez que o animal é totalmente anestesiado, coloque o rato no banco com o gás anestésico, vindo de um cone de nariz com isoflurano 2% e um fluxo de oxigênio de 1,5 L/min.
3. Coloque o rato em posição e coloque o cinto pélvico em um movimento rostro-caudal.
4. Dobre o cinto pélvico para fornecer um confortável apto enquanto sendo cuidadoso não esprema suavemente os membros traseiros para evitar abrasões e desconforto.
5. Prenda a corrente de aço inoxidável com fecho giratório à parte superior do cinto pélvico, onde um gancho é anexado na base da cauda.
6. Remover o rato de anestesia e colocar o animal em uma gaiola personalizada com a cadeia estendida no seu máximo.
7. Uma vez que o rato está totalmente acordado e móvel, encurte a corrente usando o fecho superior giratória até membros posteriores já não pode alcançar o chão.
8. Observe o animal por alguns minutos avaliar o seu conforto e certifique-se que em todos os tempos, os dois membros posteriores permanecem completamente descarregada.

2. rolamento de peso parcial

Nota: Este passo pode ser realizado em animais acordados e anestesiados.

1. Converta o dispositivo de suspensão HLU em uma suspensão do PWB adicionando a parte em forma de triângulo, composta de correntes de aço inoxidável e uma vara de volta.
2. Anestesia o animal a seguir os mesmos procedimentos conforme detalhado para o HLU (passos 1.1 e 1.2).
3. Coloque um casaco de baraço de tamanho adequado sobre as patas dianteiras do rato (M para ratos de 400g ou inferior, L para ratos com peso acima de 400 g) e fechá-lo usando o extensor de trás do sutiã.
4. Anexe um fecho da parte em forma de triângulo para o gancho localizado na volta o extensor e o fecho oposto no gancho localizado sobre o cinto pélvico na base da cauda.
5. Permitir que o animal se recuperar da anestesia na gaiola. Quando acordado, verifique se que a suspensão é igual em ambos os membros dianteiros e os membros traseiros, encurtamento da cadeia e modificando a localização da fivela giratória inferior se necessário.
   Nota: Este passo pode também ser realizado usando uma placa de força para confirmar o carregamento igual em todos os membros.
6. Coloque o rato em cima da escala para registrar o peso do corpo "carregado", ou seja, o peso do animal e todo o aparelho, sem encurtamento da cadeia.
7. Encurtar a cadeia até a escala exibe 40% do peso de corpo "carregado" e recorde o alcançou nível de gravidade (expressado como a relação entre peso descarregado e carregado).
8. Observe o animal para certificar-se que o peso descarregado é estável e que o rato é igualmente carregado em todos os membros.
9. Retire todo o aparelho a escala utilizando a haste e coloque o rato de volta à sua jaula.

3. avaliação do membro posterior aderência força

1. Mantenha o rato com um tradicional sistema de retenção, colocando uma mão por baixo as patas dianteiras. Pressione cuidadosamente o rabo com o ponteiro dos segundos.
2. Aproximar o punho com as patas traseiras e certifique-se de que ambas as patas são totalmente descansando na barra.
   Nota: Se o rato não totalmente segurar a barra ou não exibir qualquer evidência de preensão voluntária, versão ligeiramente a contenção. Se isso tiver êxito, retornar o rato para sua gaiola e tente novamente depois de alguns minutos.
3. Puxe delicadamente o rato em linha reta até que ele libera seu aperto. Registro da força máxima exibida no transdutor.
4. Espere aproximadamente 30 s entre medições e repetir o teste 3 vezes.
5. Calcule a média das três medições para pontuar, a conta para a fadiga.

4. gravação do músculo molhar a massa

1. Coloque o rato em uma câmara de eutanásia CO₂ . Depois de esperar o momento apropriado de acordo com as diretrizes IACUC e AVMA, confirme a eutanásia por uma observação visual da falta de respiração.
2. Coloque o rato em cima da mesa de dissecação em posição e retire a pele e a pele por incisão perto do tornozelo com uma tesoura pequena dissecação. Use as mãos para retirar a camada de pele.
3. Usando uma tesoura pequena dissecação, suavemente quebrar a fáscia muscular e isolar o tendão calcâneo.
   Nota: O tendão calcâneo é o ponto de fixação dos músculos gastrocnêmio e o sóleo.
4. Enquanto segura o tendão calcâneo com um pequeno par de pinças, use a tesoura de dissecação para isolar os músculos gastrocnêmio e sóleo do bíceps femoral, localizado acima.
5. Uma vez isolado, corte o ponto de fixação dos músculos gastrocnêmio e sóleo na área poplítea.
6. Suavemente, puxe o sóleo longe do gastrocnêmio e desanexá-los cortando o tendão calcâneo.
7. Coloque o rato em uma posição supina. Retire a fáscia cuidadosamente e descasque o tibial anterior do tornozelo em um movimento ascendente.
8. Corte o tibial anterior no seu ponto de fixação superior.
9. Grave a massa molhada exacta de cada músculo extirpado utilizando uma balança de precisão tarada e um pesagem do barco.

Aproveitando-se das novas gaiolas que projetamos anteriormente e descrito em detalhe12, usamos um dispositivo de suspensão baseada em cadeia de aço inoxidável que é apropriado para a descarga de membro posterior (HLU, Figura 1) e parcial do peso-rolamento (PWB, Figura 2). A vantagem fundamental de nosso projeto é a capacidade de ir de um tipo de descarga para o outro em questão de minutos, mantendo um ambiente idêntico para os animais. Usamos um arnês pélvico sob medido (Figura 2A) anexado a uma cadeia única inox sob medida com um fecho giratório de cada lado para HLU. Para modificar este dispositivo de suspensão e alcançar o PWB, a adição de uma peça em forma de triângulo da cadeia do aço inoxidável que incorporou uma haste traseira inflexível, projetada para sentar-se logo acima da coluna (Figura 3) é a única exigência. Estas etapas podem ser executadas em animais anestesiados ou acordados.

Com o ambiente versátil fornecido neste experimento, podemos descarregar com sucesso o membro posterior de todos os nossos animais por 7 dias sem complicações e rapidamente, expô-las a uma gravidade parcial a 40% da sua carga normal (PWB40, média alcançada nível de gravidade de 0,4076 g ± 0,0036 g). Durante a primeira semana de total HLU, animais exibidos uma perda de peso significativa do corpo (Figura 4A:-7.19% ± 0,87%, n = 9, p < 0,001), que tem sido testemunhado em outros modelos de14e não difere significativamente o que observamos em ratos expostos no PWB40 para a mesma duração (-5.53% ± 1,44%, n = 10, p = 0,37). No entanto, animais continuaram perdendo peso ao longo do tempo enquanto posteriormente sendo exposto a PWB40 (-9.06% ± 1,35% da linha de base, p < 0,0001).

Força de preensão do membro posterior é uma medida padrão da função muscular que pode ser usada no sentido longitudinal (Figura 4B). Notamos que uma semana de total descarga levou a uma diminuição média da força de preensão de 50.16% ± 4,10% em relação à linha de base (p < 0,0001). Depois de uma semana subsequente de rolamento em 40% da carga normal de peso parcial, não percebemos qualquer mais mudança em relação a força de preensão (-44.29% ± 4,67% em relação à linha de base, p < 0,0001). Em todos os pontos de tempo, a mudança de porcentagem na pata traseira de força de preensão foi significativamente diferente dos controles idade de correspondência (p < 0,0001 para dia 7 e dia 14, n = 11). Além disso, observamos que, após a conclusão do estudo, os animais submetidos a descarga total seguido de rolamento (HLU-PWB40) de peso parcial exibido uma perda de força de aderência significativamente maior em comparação ao grupo PWB40 (p = 0,03).

Músculo massa molhada foi gravada no final do experimento e em comparação com dados obtidos após duas semanas de carregamento normal ou duas semanas de PWB40 (Figura 4) e dados anteriormente publicados por nosso grupo12. Nós achamos que os grupos PWB40 e HLU-PWB40 têm significativamente mais baixo molhar a massa do sóleo (S), gastrocnêmio (G), e tibial anterior (TA) músculos do que a idade-controles (PWB100). Na verdade, nós gravamos uma massa média sóleo de 0,1681 g ± 0,007 g para os nossos animais, que foi significativamente menor do que os ratos expostos a PWB100 por 2 semanas em nossas experiências anteriores (-24.60% ± 3,18%, p < 0,0001). Para o gastrocnêmio, nós gravamos uma massa molhada média de ± g 2,192 0,096 g (-10.55% ± 3,93%, p = 0,038 vs PWB100) e uma massa húmida de 0,759 g ± 0,029 g para o tibial anterior (-14.40% ± 3,27%, p = 0,009 vs PWB100). Enquanto nosso conjunto de dados destacou que os animais expostos a um análogo de missão a Marte (HLU-PWB100) tinham uma diminuição da massa molhada dos músculos sóleo e gastrocnêmio em comparação aos animais expostos a PWB40 por 2 semanas consecutivas (-8.75% ± 3,84% e-5.85% ± 4,14%, respectivamente), nós não observaram diferença significativa entre estes dois grupos.

Figura 1: descrição dos dispositivos de suspensão e como converter de HLU para PWB. (A) com base em nosso projeto anterior, usamos uma haste de alumínio em cima da gaiola para segurar uma suspensão estável dispositivo composto de um anel chave fixado no centro da haste (seta 1), uma corrente de aço inoxidável (seta 2), e dois giro fechos (setas 3). (B) para converter o dispositivo de suspensão para alcançar o PWB, uma estrutura em forma de triângulo é anexado usando o fecho de giro do fundo. Esta peça é composta por correntes de aço inoxidável e uma haste de volta de cloreto de polivinila (PVC) que fica acima da coluna do rato (seta 1). Em cada lado da haste traseira está localizado um fecho para prender o cinto e a jaqueta, respectivamente (seta 2). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: membro posterior descarga usando um cinto pélvico. (A) frontal e lateral, Ver os desenhos da estrutura arreios utilizados para apoiar as patas dos animais. (B) o cinto pélvico foi posicionado conforme descrito para caber snuggly em torno as patas do rato. O link do aço inoxidável é posicionado sobre a base da cauda e anexado para o fecho do giro. A localização exata e a forma do cinto de segurança podem variar entre animais mas ratos devem ser confortáveis e é necessário que seus membros posteriores nunca tocar o chão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: rolamento de peso parcial. A descarga parcial requer a adição de uma jaqueta para o animal, a fim de apoiar os membros da frente. O casaco é então fechado com um extensor de sutiã costas e um gancho é anexado para o extensor, situada entre as escápulas. Tanto a jaqueta e o cinto pélvico estão conectados para fechos localizados em cada extremidade da haste de volta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: exemplos de seguimento longitudinal em animais expostos a diferentes níveis de descarga. Peso de corpo (A) mudança (BW). Os animais foram pesados semanalmente sem o arnês ou jaquetas e peso corporal foi gravado. PWB100 = peso parcial tendo em carregamento normal; PWB40 = peso parcial tendo em 40% de carga normal; HLU-PWB40 = uma semana de membro posterior descarga seguido por uma semana de PWB40. Os resultados do teste post hoc de Tukey, seguindo uma ANOVA de 2 vias empilhada são apresentados como *: p < 0.05, * *: p < 0,01, * * *: p < 0,001, e * * *: p < 0,0001 vs PWB100. (B) mudança na força de preensão da pata traseira. Força de preensão da pata traseira, semanal foi medida e os resultados foram expressos em porcentagem mudança da linha de base para cada animal. Os resultados do teste post hoc de Tukey, seguindo uma ANOVA de 2 vias empilhada são apresentados como * * *: p < 0,001 e * * *: p < 0,0001 vs PWB100, α: p < 0.05 vs PWB40. (C) músculo molhado massa após 14 dias. Músculo massa molhada foi gravada em uma balança de precisão, imediatamente após o sacrifício em 14 dias. Os resultados são apresentados como por cento da massa molhada obtido no grupo de controle de idade de correspondência (PWB100). S = sóleo; G = gastrocnêmio; TA = tibial anterior. Os resultados do teste post hoc de Tukey, uma ANOVA One-Way a seguir são apresentados como *: p < 0.05, * *: p < 0,01, e * * *: p < 0,0001 vs PWB100. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm nada para divulgar.