Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Resumo

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Resumo

Linfonodos (LNs) são órgãos espalhados dentro do corpo, onde as respostas imunes inatas podem se conectar com a imunidade adaptativa. Na verdade, os LNs são estrategicamente interpostos no caminho dos vasos linfáticos, permitindo o contato íntimo de antígenos de tecido com todas as células imunes residentes no LN. Assim, compreender a composição celular, a distribuição, a localização e a interação usando imagens de LN inteiras ex vivo acrescentarão ao conhecimento sobre como o corpo coordena as respostas imunes locais e sistêmicas. Este protocolo mostra uma estratégia ex vivo da imagem latente depois de uma administração in vivo de anticorpos fluorescente-etiquetados que permita uma metodologia muito reprodutível e fácil de executar usando microscópios confocal convencionais e reagentes do estoque. Através da injeção subcutânea de anticorpos, é possível rotular diferentes populações de células na drenagem de LNs sem afetar as estruturas teciduais que podem ser potencialmente danificadas por uma técnica de microscopia de imunofluorescência convencional.

Introdução

Os gânglios linfáticos (LNs) são órgãos em forma de ovóide amplamente presentes em todo o corpo com a função crucial de colmatar as respostas imunes inatas e adaptativas. Os LNs filtram a linfa a fim identificar partículas extrangeiras e pilhas cancerosas para montar uma resposta imune de encontro a elas¹. Células de apresentação de antígeno (APCs), células T e células B trabalham ao lado para gerar anticorpos antígeno-específicos (imunidade humoral) e linfócitos citotóxicos (imunidade celular) para eliminar as partículas estrangeiras e células cancerosas². Assim, compreender a dinâmica das células imunes presentes no si....

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Permanente de animais da faculdade de medicina de Harvard e do hospital Brigham and Women, protocolo 2016N000230.

1. camundongos utilizados para o experimento

1. Use ratos machos e fêmeas velhos de 8 semanas no fundo B6 para administrar a mistura do anticorpo.
2. Use camundongos CX3CR1^GFP/WTCCR2^RFP/WT para determinar se a imagem latente completa ex vivo de ln pode igualmente ser aplicada aos ratos do repórter sem administrar a mistura do anticorpo assim como para investigar a presença de pilhas mononucleares, incluindo o antígeno que apresenta células e fagócitos, e su....

Resultados

Este manuscrito mostra técnicas para remover linfonodos inguinal e poplítea sem prejudicar sua estrutura após a injeção de anticorpos fluorescentes rotulados para manchar populações de células específicas nesses órgãos (Figura 1 e Figura 2 ).

A combinação poderosa de Immunolabeling de pilhas de ln com BV421 anti-CD4 e BB515 a análise da imagem latente de CD19 e confocal definiu a localização de pilhas de T (CD4 +) e de pilhas de B (CD.......

Discussão

A combinação da imagem latente com outras técnicas, incluindo a biologia molecular e o imunofenotipagem dimensional elevado realçou nossa habilidade de investigar pilhas imunes em seu contexto nativo. Na verdade, enquanto outras abordagens podem requerer digestão tecidual e isolamento celular-o que pode levar à perda de integridade tecidual-o uso de imagens in vivo ou ex vivo concede uma grande vantagem na investigação de diferentes subtipos de células em uma forma geográfica^{3 ,}

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1,5; 0,2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0,2 mg mL-1
BB515 Rato IgG2a, κ Controle de isotipo	BD Horizon	564418	R35-95; 0,2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Controle de isotipo	BD Horizon	562603	R35-38 0,2 mg mL-1
Cellview placa de cultura	Greiner-Bio	627861	35x10 mm com fundo de vidro
Seringas de insulina	BD Plastipak-Insulin		U-100
Kimwipes	Marca Kimtech Science	7557	tamanho 21 x 20 cm / 100 folhas por caixa
Pinça curva de microcirurgia	Instrumentos cirúrgicos WEP	feitos sob medida	12,5 cm
Tesoura curva de microcirurgia	Instrumentos cirúrgicos WEP	feitos sob medida	11,5 cm
Agulha	BD PrecisionGlide-30		gauge × ½ polegadas
Nikon Eclipse Te + A1R cabeça confocal	Nikon	-	carregado com 4 linhas de laser principais (405, 488, 543 e 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0,2 mg mL-1
PE Rato IgG2a, κ Controle de isotipo	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0,2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 microscópio confocal	Zeiss-carregado		com 4 linhas principais de laser (405, 488, 543 e 647 nm)