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Artigo de método

Um modelo de câncer endometrial ortotópico com linfadenopatia retroperitoneal feita a partir de in vivo propagadas e cultivadas VX2 células

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DOI:

10.3791/59340

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12 de setembro de 2019

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1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 3Guided Therapeutics Laboratory, TECHNA Institute, University Health Network, 4Department of Pathology, Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 5Department of Medical Biophysics, University of Toronto, 6Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 7Techna Institute, University Health Network, 8Department of Surgery, University of Toronto, 9Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, University of Toronto, 10Division of Gynecologic Oncology, University of Toronto /Princess Margaret Cancer Center, University Health Network, 11Princess Margaret Cancer Center, University Health Network

Neste artigo

Resumo

Este protocolo apresenta um método estandardizado para crescer VX2 pilhas na cultura e para criar um modelo VX2 transplantação orthotopic do do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal nos coelhos. Os modelos do cancro endometrial de orthotopic são importantes para o estudo pré-clínico de modalidades novas da imagem latente para o diagnóstico de metástases de nó de linfa.

Resumo

O cancro endometrial é a malignidade gynecologic a mais comum em America do Norte e a incidência está levantando-se no mundo inteiro. O tratamento consiste em cirurgia com ou sem terapia adjuvante, dependendo da participação do linfonodo, conforme determinado pela linfadenectomia. Lymphadenectomy é um procedimento mórbido, que não seja mostrado para ter um benefício terapêutico em muitos pacientes, e assim um método novo para diagnosticar metástases de nó de linfa é exigido. Para testar os agentes novos da imagem latente, um modelo de confiança do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal é necessário. O modelo VX2 do cancro endometrial foi descrito freqüentemente na literatura; no entanto, existe uma variação significativa no que diz respeito ao método de estabelecimento de modelo. Além disso, nenhum estudo relatou sobre o uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo, pois apenas as células propagadas in vivo têm sido utilizadas anteriormente. Neste estudo, apresentamos um método cirúrgico padronizado e um método de monitorização pós-operatória para o estabelecimento do modelo de câncer endometrial VX2 e relato do primeiro uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo.

Introdução

O cancro endometrial, ou o cancro do forro do útero, são a segunda malignidade gynecologic a mais comum no mundo inteiro e a malignidade a mais comum em nações desenvolvidas1. A incidência de câncer de endométrio tem aumentado constantemente, elevando-se em 2,3% ao ano entre 2005-2013 com um aumento correspondente de 2,2% na mortalidade1,2,3. O diagnóstico das metástases linfonodais é primordial, pois a presença de linfonodos positivos é um forte preditor negativo desobrevida4,5,6,7e pode orientar a administração de terapia adjuvante8,9,10,11,12,13. As metástases de nó de linfa são diagnosticadas cirurgicamente removendo o tecido linfático que sobrejacente os vasos sanguíneos principais na pelve e no abdômen. Este procedimento, conhecido como lymphadenectomy, é controverso devido aos dados conflitantes da sobrevivência de dois testes grandes14,15,16,17,18 e o conhecido risco de15,19,20 e morbidade pós-operatória21,22,23. Como as modalidades não invasoras atuais da imagem latente não têm a sensibilidade e a especificidade exigidas para substituir a dissecção do nó de linfa24, houve um impulso para desenvolver técnicas diagnósticas novas da imagem latente. Para testar estas técnicas novas em um ajuste pre-Clinical, um modelo de confiança do cancro endometrial com metástases de nó de linfa retroperitoneal é exigido.

O modelo do tumor do coelho VX2 é um modelo bem estabelecido que seja usado extensivamente para estudar tumores contínuos humanos múltiplos do órgão25 que incluem o pulmão26, a cabeça e a garganta27,28, fígado29, rim30, osso31,32, cérebro33, pâncreas34 e útero35,36,37. O modelo VX2 foi originalmente desenvolvido em 1940 por Kidd e Rous38 ao transplantar com sucesso um vírus de papiloma de coelho de algodão descoberto por Shope em 193339. Desde aquela época, o modelo VX2 foi mantido in vivo, exigindo passagem serial no músculo quadríceps de coelhos brancos da Nova Zelândia40. Mais recentemente entretanto, os grupos múltiplos cresceram com sucesso VX2 pilhas in vitro40,41,42 e demonstraram o tumorigenecity retido da linha de pilha cultivada31, 42,43. Os tumores VX2 são definidos histològica como carcinomas de pilha Squamous Anaplastic44 e contêm as características glandular que se assemelham ao adenocarcinoma26. Os tumores são caracterizados pela facilidade da implantação, pelo crescimento rápido e pelo Hyper-vascularity44,pelo45 e por metastasize confiantemente, o mais geralmente aos nós de linfa regionais e distantes45. Similaridades na anatomia vascular e linfática uterine46 assim como o local transplantação orthotopic do do crescimento asseguram-se de que o teste padrão metastático da carcinoma VX2 do coelho imita aquele do cancro endometrial humano, fazendo ao modelo VX2 um modelo de confiança para estudar o ser humano doença metastática. Além disso, as características histologic tais como a proliferação microvascular anormal47 , assim como48 imunológicos e similaridades genéticas49,50 entre seres humanos e coelhos sugerem que o tumor microambiente pode refletir o de câncer de endométrio humano.

Os grupos múltiplos relataram no uso de VX2 para criar um modelo do cancro endometrial com metástases retroperitoneal com uma taxa relatada elevada do sucesso36,51,52; no entanto, existe uma variação significativa na literatura atual com respeito ao método de criação do modelo. As doses da suspensão da pilha tão baixas quanto 4 x 105 pilhas/chifre uterine51 e tão altamente quanto 5 x 109 pilhas/chifre uterine37,53 foram relatados sem o consenso padrão na dose celular exigida VX2. Também, uma variedade de métodos da inoculação foi relatada que inclui a implantação microcirúrgica do tumor no miométrio uterine36, injeção da suspensão VX2 da pilha37,44,52 , 53 e, em alguns casos, a adição de chifre uterino suturando antes da inoculação52. Finalmente, nenhum grupo relatou o uso de células VX2 cultivadas para criar esse modelo. Assim, a finalidade deste estudo é demonstrar um método padronizado bem sucedido da criação do modelo VX2 e relatar o primeiro uso de pilhas VX2 cultivadas para criar um modelo do cancro endometrial com metástases retroperitoneal em um coelho.

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Protocolo

Fechamento da parede abdominal profunda: identifique o ápice da incisão peritoneal e segure o peritônio, músculo reto e fáscia com fórceps tecidual. Todos os estudos em animais foram conduzidos em instalações aprovadas pelo centro de recursos animais (ARC) da rede de saúde universitária e de acordo com os protocolos de uso e cuidado de animais aprovados (AUP #3994/#4299). A linha celular VX2 foi obtida do laboratório do Dr. Aken na rede de saúde da Universidade.

1. criação de linha celular in vitro VX2

  1. Colha o tumor de VX2 do músculo do alongamento do coelho e do crescimento no flanco do rato.
    1. Descongelar blocos de tumor VX2 congelados (1 cm x 1 cm), picar em uma placa de cultura usando uma lâmina de bisturi e estirpe através de um filtro de 70 μm, adicionando pequenas quantidades de Hanks solução de sal balanceada (HBSS) sequencialmente para garantir que todas as células são tensas para um volume final de 1 mL.
    2. Células de contagem e diluir com 0,9% solução salina tamponada com fosfato para uma concentração de 1 x 107/ml e colocar no gelo em um tubo estéril.
      Nota: os blocos tumorais foram obtidos de um colaborador do laboratório da propagação precedente de tumores VX2 em músculos do quadríceps do coelho.
    3. Anestesie um coelho branco fêmea de Nova Zelândia (peso 2,5-3,5 kg) com 2-5% de isoflurano inalado, retire a pele sobrejacente do local da injecção e limpe o local da injecção com solução de iodo-povidona. Injetar 500 μL da suspensão da célula VX2 preparada (5 x 106 células/ml) no músculo quadríceps do coelho. Monitore o coelho clìnica para o crescimento do tumor que começa no dia 10.
    4. Eutanizar os coelhos depois que os tumores alcangam 1-1.5 cm no diâmetro (medido externamente com calipers) usando um método aprovado veterinário. Confirme a eutanásia verificando sinais vitais, incluindo frequência cardíaca e frequência respiratória. Extirpar o tumor usando instrumentos estéreis após a limpeza da área com solução de Betadine.
    5. Em um armário biológico da segurança usando instrumentos estéreis, mince o tumor dentro às partes pequenas (0,2 cm) em um prato da cultura do tecido de 10 cm usando uma lâmina do bisturi. Passe os fragmentos tumorais através de um filtro de células de 70 μm usando 1 mL de HBSS, conforme descrito na etapa 1.1.1. Contagem de células e diluir usando 0,9% solução salina para obter 7,5 x 105 células em 200 μl.
    6. Anestesiar camundongos da gama scid macho NOD (peso 25 g) utilizando isoflurano a 4% a 1 L/min e manter a anestesia utilizando isoflurano a 2%. Uma vez que os ratos são anestesiados, injete 200 μL da solução da etapa 1.1.5 no tecido subcutâneo do flanco do mouse usando uma agulha calibre 27.
  2. Colheita e de de células VX2 in vitro
    1. Monitore o crescimento do xenograft clinicamente duas vezes por semana até que os tumores alcancem 1 cm no diâmetro usando calipers.
    2. Eutanizar camundongos colocando em uma câmara de CO2 ou realizando luxação cervical após anestesia com gás isoflurano a 4%. Os tumores do imposto condições estéreis em um armário de segurança biológico.
    3. Mince tumores com um bisturi em 1-2 mm peças em um 6 cm tecido cultura prato contendo 3 mL de Dulbecco ' s modificado Eagle Medium (DMEM)/Ham ' s F12 + 10% soro bovino fetal (FBS) Media.
    4. Deixe os fragmentos do tumor não perturbados em uma incubadora de 37 ° c com 5% CO2 por dois dias até que as pilhas comecem a crescer para fora das partes do tumor. Subseqüentemente, verific placas cultivadas diariamente pela fotomicroscopia para a confluência da pilha. Ao atingir 70% de confluência, Trypsinize células adicionando 1 mL de 0, 5% de tripsina ao balão e colocando de volta na incubadora de 37 ° c por 5 min.
    5. Neutralize a tripsina com 6 mL de DMEM/Ham ' s F12 + 10% FBS médio, colete células e Centrifuguea 4 ° c por 5 min a 300 x g. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em 3,5 mL da nova mídia F12 + 10% FBS da DMEM/Ham. Semente fresca do colagénio de 6 cm eu revestiu placas com 1,6 x 106 pilhas por a placa para conseguir a densidade de propagação da pilha de aproximadamente 50%.
      Nota: 50% densidade celular refere-se às células que tomam até 50% da área de superfície da placa quando anexado.
    6. Passaging precoce: Repita o processo acima (trypsinizing, semeando) até que as pilhas estiveram é 5 vezes e avalie então a pureza da linha celular com o PCR usando um ensaio quantitativo do PCR para distinguir o ADN genomic do coelho do ADN genomic do rato (veja a etapa 1.3.1-1.3.4).
      Nota: após 8 passagens, as células podem ser propagadas em placas de cultura de tecidos aderentes regulares não revestidas de colágeno.
    7. Passagem, Trypsinize e congelar alíquotas de células em DMEM/HAM F12 + 30% FBS + 10% DMSO em uma concentração de 2 x 106 por frasco. Armazene as células em nitrogênio líquido até que seja necessário para experimentos.
  3. Confirmação da origem VX2 de células sobreviventes:
    1. Crie uma cura padrão de DNA genómico purificado e ADN de coelho (Step 1.3.2 e Step 1.3.3). Use iniciadores que segmentem sequências específicas de espécies dentro do segundo quadro de leitura aberto do elemento Retrotransposão line-1.
      Nota: as sequências de primer para CRPV E6 são: 5 '-GATCCTGGACCCAACCAGTGand 5 '-CCTGCCGGTCCCTGATTTAT. Os elementos da linha 1 Retrotransposão foram utilizados. As sequências de primer para Rabbit LINE-1 são: 5 '-TCAGGAAACCCCAGAAAGTATGC e 5 '-TTTGATTTCTTGAATGACCCAGTGT primer sequências para mouse LINE-1 são: 5 '-AATGGAAAGCCAACATTCACGTG e 5 '-CCTTCCTTGACCAAGGTATCATTG
    2. Para criar uma curva padrão para crpv E6, purificar VX2 o lisado da pilha do tumor (etapa 1.1.1) usando um jogo comercial que segue o protocolo do fabricante. Quantificar este DNA usando um ensaio comercial. Realize 6 diluições seriais de 225 PG/μL para 0,925 PG/μL em baixo tampão EDTA-TE. Para criar uma curva padrão para DNA genómico do camundongo, diluir 100 μg de DNA genómico de camundongo comercial em baixo tampão EDTA-TE em 5 diluições de 125 PG/μL até 0, 125 PG/μL.
    3. Coloc 4 μL de cada solução diluída das amostras da etapa 1.3.2 nos poços e execute amostras em um thermocycler do PCR. Use os valores de CQ de cada execução juntamente com as quantidades de DNA por poço para calcular uma curva padrão usando as configurações de limite automático do software termociclorador.
    4. Use procedimentos padrão de qPCR para executar o PCR com 40 ciclos do ciclagem de 2 etapas (° c 98 e 60 ° c) em um thermocycler. Estabeleça valores de limiar e defina valores Delta CT em > 35 para garantir que haja uma contaminação mínima do mouse na linha celular coelho VX2. O volume total de cada reação foi de 10 μL, consistindo de 5 μL de 2x MasterMix, 1 μL de primers de avanço + reverso com concentração final de primer em reação a 250 nM e 4 μL de amostra de DNA.
      Nota: Veja por favor referências54,55 para detalhes em executar o PCR. Os valores de limiar são estabelecidos, e os valores do CT do Delta são ajustados em > 35 para assegurar-se de que haja uma contaminação mínima do rato na linha celular do coelho VX2. O nível recomendado de DNA VX2 para detecção confiável por qPCR é 1-10 PG.

cultura da pilha 2. VX2 e criação da suspensão da pilha

  1. Descongelar os frascos contendo VX2 células (congeladas na etapa 1.2.7) em um banho de água a 37 ° c por 1 minuto e transferir células para um tubo de centrífuga cônico com 10 mL de meio de cultura (1:1 DMEM/F-12 + 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina). Centrifugador por 8 min a 107 x g, descarte o sobrenadante e resuspenda o pellet celular em 9 ml de mídia.
  2. Transfira as células resuspensas para um balão de cultura grande. Incubar células sem agitação a 37 ° c. Verifique as células diariamente para confluência usando microscopia de luz e mude a mídia de cultura a cada três dias.
  3. Criação de VX2 de suspensão de células cultivadas para injecção
    1. Trypsinize pilhas adicionando 3 ml de tripsina de 0,25% ao frasco uma vez que as pilhas alcangaram 80% confluência. Coloque a garrafa na incubadora (37 ° c) por 5 min. solução de transferência para um tubo de centrífuga cônico e centrífuga para 8 min em 107 x g e, em seguida, remover sobrenadante.
    2. Lave as pastilhas de células 3 vezes com 9 mL de fosfato salina tamponado, centrífuga e remover sobrenadante como acima. Contar as células e diluir com 0,9% de fosfato solução salina tamponada para uma concentração de 4 x 107 células/ml e coloque em um tubo de centrífuga estéril cônico no gelo.
  4. Criação de suspensão de célula VX2 in vivo propagada para injeção
    1. Descongelar blocos de tumor VX2 congelados (1 cm x 1 cm), picar em uma placa de cultura usando uma lâmina de bisturi e Coe através de um filtro de 70 μm como na etapa 1.1.1. Adicione pequenas quantidades de HBSS sequencialmente para garantir que todas as células estejam tensas para um volume final de 1 mL. Contagem de células e diluir com 0,9% fosfato tampão salina a uma concentração de 1 X107/ml e colocar no gelo em um tubo estéril.
      Nota: os blocos tumorais foram obtidos de um colaborador do laboratório da propagação precedente de tumores VX2 em músculos do quadríceps do coelho.

3. estabelecimento modelo cirúrgico

  1. Estabelecimento de anestesia cirúrgica e preparo pré-operatório
    1. Pré-Medicate fêmeas brancas coelhos da Nova Zelândia (2,5-3,5 kg) 1 h antes do procedimento cirúrgico planejado usando injeções de acepromazina (1 mg/kg IM) e meloxicam (0,2 mg/kg SQ). Anestesie um coelho branco fêmea de Nova Zelândia (peso 2,5-3,5 kg) com 2-5% de isoflurano inalado, retire a pele sobrejacente do local da injecção e limpe o local da injecção com solução de iodo-povidona.
    2. Intubate os coelhos anestesiados utilizando uma máscara laríngea (LMA) e seguro no local com fita adesiva, mantendo anestesia profunda por titular a dose de isoflurano inalatória entre 2-5%. Monitorar a anestesia cirúrgica regularmente durante todo o procedimento, verificando sinais vitais (frequência respiratória, recarga capilar, saturação de oxigênio, se disponível) e monitoramento de sinais sugestivos de dor (movimento, retirada de estímulos, ruídos) ou luz anestesia (movimento, mastigação no tubo de LMA).
      Nota: isto deve ser feito por alguém com a experiência que monitora a anestesia cirúrgica.
    3. Coloc um cateter da orelha-veia do calibre 22 na veia dorsal marginal. Administrar cefazolina (20 mg/kg) intravenosamente 10 min antes da incisão cirúrgica da pele.
    4. Grampo de cabelo sobre a pélvis e abdômen antes de colocar o coelho na mesa de operação, em seguida, coloque os coelhos em uma posição dorsal na mesa de operação. Limpe o campo cirúrgico usando uma preparação cirúrgica da pele de 3 etapas (sabão do Betadine, solução do clorexidina, solução do Betadine). Drape o campo cirúrgico com laparotomia drapeja após a terra-marcando a parte superior do osso Púnico, deixando uma área de 5 cm x de 5 cm do abdômen mais baixo expor.
  2. Criação da incisão laparotomia e identificação dos chifres uterinos
    1. Coloque um tampão cirúrgico e máscara facial. Esfregue as mãos usando clorexidina ou solução de esfrega cirúrgica Betadine. Usando a técnica estéril, põr sobre um vestido estéril e umas luvas cirúrgicas estéreis.
    2. Usando um bisturi de lâmina # 11, faça uma incisão de 2,5 cm de comprimento 1 cm craniana ao púbis da sínfise através da pele e do tecido subcutaneous do abdômen do coelho. Incise a fáscia do reto e dissecar os músculos do músculo reto lateralmente para expor o peritoneum subjacente. Entre no peritônio acentuadamente depois de garantir que a superfície inferior é clara do intestino ou outros órgãos abdominais.
    3. Localize os chifres uterinos identificando a bexiga urinária e varrendo um dedo gloved superiormente, posterior e lateralmente sobre o ápice da bexiga.
      Nota: se necessário, a bexiga cheia pode ser esvaziada usando a pressão digital. Uma vez localizado, trazer os chifres uterinos através da incisão abdominal para descansar na parede abdominal.
    4. Usando uma sutura absorvível trançada 3-0, realize uma única ligadura da sutura de cada chifre uterine aproximadamente 1.5-2.0 cm longe do ponto de origem aos cervices. Coloque a sutura apenas medial para as artérias uterinas, que correm ao longo do aspecto lateral de cada chifre. Amarrar as suturas confortavelmente para oclusos dos chifres uterinos distais (Figura 1).
  3. Inoculação VX2 miometrial
    1. Usando uma agulha de calibre 27, injete 0,5 mL da suspensão da célula VX2 previamente preparada a partir de qualquer etapa 2.3.2 (para o modelo VX2 cultivado) ou 2,4 (para o modelo in vivo propagado VX2) para o miometrium de cada chifre uterino proximal ao local da sutura (entre o local de sutura e o colo do útero). Injete mais de 1 minuto e assegure-se de que as células não sejam injetadas na cavidade uterina subjacente. Anestesiam animais utilizando isoflurano inalatório (2-5%) e uma máquina anestésica com um circuito Bain.
    2. Aplique pressão no local de injeção miometrial por 30 s após a injeção para minimizar o vazamento de células. Inspecione os locais de injeção e sutura para hemostasia e coloque os chifres uterinos de volta no abdômen.
  4. Fechando a incisão cirúrgica
    1. Fechamento da parede abdominal profunda: identifique o ápice da incisão peritoneal e segure o peritônio, músculo reto e fáscia com fórceps tecidual.
      1. Para fazer isso, ancorar a sutura em um ápice da incisão, suturando superficial para profundamente em um lado da incisão e profunda a superficial do outro. Amarre um nó. Usando a sutura anexada, fazer pontos de corrida perpendicular à incisão através das camadas da parede abdominal trabalhando passo-sábio ao longo da incisão de lado a lado. Amarre a sutura e corte.
    2. Fechamento superficial da parede abdominal: identifique o vértice da incisão da pele e suturar a pele abdominal usando a sutura subcutticular 3-0 absorvível do poli-filamento do funcionamento enterrado. Aplique cola cirúrgica na incisão fechada para se opor às bordas da pele.
      1. Para isso, ancorar a sutura em um ápice da incisão, suturando profundamente a superficial de um lado da incisão e superficial até o fundo do outro. Amarre um nó. Usando as suturas anexadas, fazer pontos em execução na camada dérmica paralela à incisão de trabalho passo-sábio ao longo da incisão de lado a lado. Amarre a sutura e corte.
  5. Cuidados pós-operatórios
    1. Despertando da anestesia: Desligue o isoflurano uma vez que a incisão é fechada e deixe o oxigênio da respiração do coelho pela máscara ao monitorar para sinais do despertar (por exemplo, movimentos espontâneos, abertura do olho e movimentos de mastigação na via aérea laríngea da máscara). Extubato o coelho uma vez que estes sinais são anotados e forneça o oxigênio pela máscara e por um cobertor morno até que os coelhos estejam alertas e possam sentar-se independente.
    2. Monitorização pós-operatória: monitorizar coelhos duas vezes por dia durante 4 dias e diariamente durante um período adicional de 10 dias após a cirurgia. Para monitorar, avaliar sua condição geral, sua ingestão de alimentos e água, urina e saída fecal, avaliação da dor, peso, sinais vitais (frequência cardíaca, taxa de respiração) e seu local cirúrgico à procura de inchaço, eritema, secreção ou deiscência.
    3. Controle da dor pós-operatória: administrar Meloxicam diariamente (0,2 mg/kg SQ) para 48 h no pós-operatório e, em seguida, conforme necessário, com base na avaliação da dor. Administrar buprenorfina imediatamente no pós-operatório e a cada 12 h (0,01-0,05 mg/kg SQ) por 24 h e, em seguida, conforme necessário, com base na avaliação da dor
    4. Os antibióticos (enrofloxacina 5mg/kg IM) podem ser administrados diariamente durante sete dias no pós-operatório para prevenir a infecção da ferida, conforme recomendado pelo seu veterinário. Administrar fluidos subcutâneos (15 mL de SQ) duas vezes por dia, conforme necessário para a desidratação e alimentos macios ou outros suplementos dietéticos são fornecidos diariamente, conforme necessário para perda de peso.

4. monitorização do crescimento tumoral

  1. Monitorização clínica: monitorizar coelhos a cada 2 dias para sinais clínicos de crescimento tumoral a partir do dia pós-operatório 14. Os sinais clínicos de crescimento tumoral podem incluir diminuição da ingestão oral, letargia, sensibilidade abdominal, massa abdominal palpável e perda de cecotroféu.
  2. Imagem latente e monitoração invasora
    1. Imagem latente do CT: no dia pós-operatório 21-28, pre-Medicate, anestesiar, e entubar coelhos como descrito previamente em 3.1.1-3.1.2. Posicione os coelhos em posição dorsal em um TC pré-clínico e obtenha imagens da pélvis e do abdome após administrar 10 mL de agente de contraste iohexol intravenoso.
    2. Monitoração cirúrgica: Transfira coelhos à sala de operação após a imagem latente quando ainda o anestésico geral. Posicione, prepare e Drape coelhos como descrito previamente na etapa 3.1.4 e realize uma incisão da laparotomia da repetição aproximadamente 1,5 cm do comprimento através da incisão precedente. Identifique o e os chifres uterine e examine com cuidado para o tumor. Feche a incisão e forneça cuidados pós-operatórios como descrito anteriormente na etapa 3.5.2-3.5.4.
    3. Uso do modelo do coelho: se os coelhos forem encontrados para ter tumores na altura da monitoração cirúrgica, use modelos do cancro endometrial do coelho para experimentos planeados. Use coelhos criados a partir de células in vivo propagadas para experimentos adicionais em 4 semanas após a inoculação e use modelos de coelho criados a partir de células VX2 cultivadas em aproximadamente 5-6 semanas após a inoculação para dar conta do crescimento tumoral mais lento. Eutanizar os coelhos depois que os tumores alcangam 1-1.5 cm no diâmetro (medido externamente com calipers) usando um método aprovado veterinário. Confirme a eutanásia verificando sinais vitais, incluindo frequência cardíaca e frequência respiratória. Extirpar o tumor usando instrumentos estéreis após a limpeza da área com solução de Betadine.

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Resultados

Vinte e oito coelhos foram utilizados para a criação do modelo de câncer endometrial. Os coelhos apresentaram um peso médio de 2,83 kg (2,71-40, 5kg) no momento do experimento. Os tumores uterine cresceram com sucesso em 21 coelhos para uma taxa de sucesso total do modelo de 75%. Antes da inclusão da sutura uterina no protocolo, a taxa de sucesso foi de 57% em relação a 81% após a sutura uterina ser adicionada. A sutura uterina foi adicionada ao protocolo após o 7º coelho em re...

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Discussão

Nisto, nós relatamos um método cirúrgico estandardizado para o estabelecimento de um modelo endometrial do cancro de VX2 e relatado no primeiro uso de pilhas VX2 cultivadas para criar este modelo. O tumor toma a taxa de 75% é mais baixo do que a taxa de 100% por cento relatada previamente na literatura35,37,53,56; Entretanto, a taxa de THW 90% de metástases de nó de linfa patològica confirmadas...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo Terry Fox Research Institute (PPG # 1075), o Instituto canadense de pesquisa em saúde (Fundação Grant #154326), o Instituto canadense de pesquisa da sociedade do câncer (704718), ciências naturais e Conselho de pesquisa de engenharia do Canadá, Fundação сanada para a inovação e a Princesa Margaret Cancer Foundation.

Gostaria de agradecer ao Dr. Marguerite Akens por fornecer as células VX2 iniciais para o estabelecimento do modelo inicial de VX2 e os blocos de tumor VX2 congelados. Gostaria de agradecer a Marco DiGrappa por ajudar a realizar experimentos iniciais de cultura de células VX2 e Lili Ding para ajudar na cultura de células VX2.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bisturi de 11 lâminas, Estéril, DescartávelAspen Surgical (VWR)80094-086
Cateter de veias da orelha de 22 gaguesCDMV14332
Sutura de polifilamento absorvível absorvível absorvível absorvível 3-0 3-0 (Polysorb
)Filtrode células Covidien 356718
70uM, Embalado individualmente, NylonFalcon352350
Acepromazina (Atravet)CDMV1047
Sabonete Betadine (iodo de poviodona 7,5%)Solução de CDMV4363
Betadine (iodo de poviodona 10%)Lojas UHN457955
BuprenorfinaUniversidade McGill
CefazolinaUHN farmácia de internaçãoNo Cat # Necessário
Solução de clorexidinaCDMV119872
Corning BioCoatCellware, Colágeno Tipo I, placas de 100 mmCorning354450marca não importante
Corning BioCoatCellware, Colágeno Tipo I, placas de 24 poçosCorning354408marca não importante
Corning BioCoatCellware, Colágeno Tipo I, placas de 6 poçosCorning354400marca não importante
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, *sem LDEV, 10 mLCorning354234
DMEM/HAM F12 1:1Life Technologies11320marca não importante
DMSOCaledon Lab Chem1/10/4100
Enrofloxacina (injetável Baytril)CDMV11242
Falcon TubeCorning Centri-Star430828
Soro Fetal Bovino, Qualificado, Origem Canadense, 500mlde 12483020Life Technologiesnão é importante
IsofluranoUHN farmácia hospitalarNão Cat # Necessário
contraste de isohexolGE Healthcare407141210
Meloxicam (Metacam 0,5%)CDMV104674
Normal SalinoCasa Marca (UofT Medstore)1011
PBSMulticell ou Sigma331-010-CL ou D8537-500mL
Penicilina / Estreptomicina (100mL; 10000U Penicilina, 10000ug Estreptomicina)Corning-CellgroCA45000-652
Solução Salinal Balanceada Estéril Hanks (-Ca ++, -Mg ++, -Vermelho de Fenol)TCMF (Dr. Bristow)28-Jan-11
Cola Cirúrgica (Adesivo de Tecido)3M Vetbond14695B
Tripsina (0,25%), Grau ProteômicoSigmaT-6567-5X20UG
Tripsina-EDTA, 0,05%, 100mlWisent Inc325-542-ELmarca não importante
356718 Marca / fonte

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