Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC

Summary

Os progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-EPs) têm potencial para revolucionar os tratamentos de doenças cardiovasculares e possibilitar a criação de modelos de doenças cardiovasculares mais fiéis. Nisto, o encapsulamento de iPSC-EPs em microambientes tridimensionais do colagénio (3D) e uma análise quantitativa do potencial vasculogenic destas pilhas são descritos.

Abstract

As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. Os progenitores endothelial bipotentes (EPs), que podem diferenciar-se nos tipos da pilha necessários para montar o vasculature maduro, funcional, foram derivados das pilhas de haste pluripotentes embrionárias e induzidas. Entretanto, estas pilhas não foram avaliadas rigorosa em ambientes tridimensionais, e uma medida quantitativa de seu potencial vasculogenic permanece indescritível. Aqui, a geração e a isolação de iPSC-EPs através da classificação fluorescente-ativada da pilha são esboçadas primeiramente, seguidas por uma descrição do encapsulamento e da cultura de iPSC-EPs em hydrogels do colagénio. Esta matriz extracelular (ECM)-mimicking microambiente incentiva uma resposta vasculogênica robusta; redes vasculares formam-se após uma semana de cultura. A criação de um pipeline computacional que utiliza software de código aberto para quantificar essa resposta vasculogênica é delineada. Este pipeline é projetado especificamente para preservar a arquitetura 3D do plexo capilar para identificar de forma robusta o número de ramificações, pontos de ramificação e o comprimento total da rede com a entrada mínima do usuário.

Introduction

Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e outros tipos de células endoteliais primárias têm sido utilizadas há duas décadas para modelar a germinação e o desenvolvimento de vasos sanguíneos in vitro¹. Tais plataformas vasculares prometem iluminar mecanismos de nível molecular e tecidual de doenças cardiovasculares e podem apresentar uma visão fisiológica do desenvolvimento de redes vasculares primitivas^2,3. Embora o campo da modelagem vascular tenha testemunhado avanços significativos, um ensaio "padrão-ouro" que pode modelar quantitativamente e avaliar o desenvolvimento v....

Protocol

1. preparação de meios de cultura e soluções de revestimento

1. Para preparar a solução de revestimento de vitronectina, diluir a vitronectina 1:100 em soro fisiológico tamponado com tampão fosfato de Dulbecco (DPBS).
   Cuidado: uma vez diluído, não é recomendável armazenar esta solução para uso futuro.
2. Ao receber fenol vermelho-livre, fator de crescimento-mistura de proteína gelatinosa reduzida (ver tabela de materiais) do fabricante, descongelar no gelo a 4 ° c até que a mistura é transparente e fluido. Mantendo a mistura no gelo em uma capa do fluxo laminar, pipeta 75 μL da mistura em um tubo do microcentrifugador de 1,8 mL e cong....

Results

Após a diferenciação (Figura 1), FACS e encapsulamento de IPSC-EPS em hidrogéis de colágeno, as células geralmente permanecem arredondadas por 24 h antes de começar a migrar e formar Lúmens iniciais. Após cerca de 6 dias de cultura, um plexo capilar primitivo será visível no hidrogel quando visualizado com microscopia brightfield (Figura 2). Após a imagem os hidrogéis fixados, manchados pilha-carregados em um microscópio confocal.......

Discussion

Este protocolo envolve a cultura a longo prazo das pilhas em três tipos de meios da cultura de pilha: E8, LaSR basal, e EGM-2. Portanto, grande cuidado deve ser tomado para esterilizar adequadamente todos os materiais. Adicionalmente, os revestimentos do laboratório e as luvas etanol-limpas devem sempre ser desgastados ao trabalhar na capa do fluxo laminar do laboratório. Recomenda-se freqüentemente testar para a contaminação do Mycoplasma; se uma grande quantidade de detritos é observada durante a cultura iPSC ou uma qu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	N/A	Uma placa de cultura de tecidos plana, com fundo de vidro, com paredes laterais permite uma imagem de imagem confocal fácil
96 bem, fundo redondo, microplaca de fixação ultrabaixa, estéril	Corning	7007	Impede a ligação de hidrogéis de colágeno carregados de células à placa de cultura de células
Accutase	STEMCELL Technologies	7920	Solução suave de descolamento celular; não degrada epítopos extracelulares vitais para FACS
Advanced DMEM/F12	Thermo Scientific	12634010	A mídia base para diferenciação iPSC-EP.
Barnstead GenPure xCAD Plus	Thermo Fisher Scientific	50136165	Sistema de purificação de água; outros podem ser prontamente substituídos Solução de
albumina de soro bovino, 7,5% em DPBS, filtrada estéril, BioXtra, adequada para cultura de células	Fisher Scientific	A8412	Para preservar a viabilidade celular quando os FACs classificam
CD34-PE, humano (clone: AC136)	Miltenyi Biotec	130-098-140	Anticorpo usado para isolamento de FACs de iPSC-EPs
CHIR99021	LC Laboratories	C-6556	Induz a formação de mesoderma a partir de células estaminais pluripotentes
Colagénio I Cauda de Rato Alta Proteína 100 mg	VWR	354249	Componente principal do microambiente 3D
Tubos de centrífuga cónicos (15/50 mL)	Fisher Scientific	14-959-49D/A	Utilizado para armazenar e misturar volumes relativamente grandes de reagentes e meios
de cultura celularDAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato)	Thermo Fisher Scientific	D1306	Para contracolorir e visualizar núcleos celulares
DMEM/F12	Thermo Fisher Scientific	11320-082	Para diluição de Matrigel e descongelamento de células-tronco pluripotentes
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS)	ThermoFisher	14190-250	Para lavar culturas de monocamada
EDTA	Sigma-Aldrich	E8008	Para a passagem de colônias de células-tronco pluripotentes e para prevenir a agregação celular quando a classificação de FACs
Meio de Crescimento de Células Endoteliais 2	PromoCell	C-22011	Promove a viabilidade e proliferação de células endoteliais
Essential 8 Medium	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Para manutenção de células-tronco pluripotentes
Glicina, BioUltra, para biologia molecular, > = 99,0% (NT)	Sigma-Aldrich	50046	Neutraliza o detergente restante
Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidratado, > = 95%	Sigma-Aldrich	A8960	Componente do meio de diferenciação iPSC-EP
MATLAB	MathWorks	1.8.0_152	Ambiente de computação numérica multiparadigma (disponível gratuitamente na maioria das instituições acadêmicas)
Matriz Matrigel GFR FenolRF Camundongo 10 mL (mistura de proteínas gelatinosas)	Fisher Scientific	356231	Diluído em DMEM/F12 para revestir placas para diferenciação iPSC-EP
Médio-199 10X	Thermo Fisher Scientific	1825015	Usado para equilibrar a osmolaridade final do hidrogel e
o pH Tubos de microcentrífuga (1,7 mL)	VWR	87003-294	Armazena pequenos volumes de reagentes
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P3813	O principal ingrediente das soluções de imunocoloração
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Antibiótico usado após a classificação para remover possível contaminação do instrumento FACS
Proteína VEGF 165 humana recombinante	R& D Systems	293-VE	Mitógeno que estimula a proliferação de células endoteliais e a tubulogênese
Faloidina da rodamina	Themo Fisher Scientific	R415	Para identificar a deposição de F-actina e, portanto, delinear as bordas das redes vasculares
Triton X-100 (surfactante não iônico)	Sigma-Aldrich	X-100	Detergente usado para permeabilizar suavemente as células
Tween-20 (reagente emulsificante)	Fisher Scientific	BP337	Aumenta a especificidade de ligação dos anticorpos adicionados
VE-Caderina (F-8)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9989	Identificar o lúmen endotelial 3D em hidrogéis de colágeno
Vitronectina	ThermoFisher	A14700	Para manutenção de células-tronco pluripotentes
Y-27632	Selleck Chemicals	S1049	Preserva a viabilidade de células-tronco pluripotentes e iPSC-EP quando dissociadas e re-semeadas