Os progenitores endoteliais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC-EPs) têm potencial para revolucionar os tratamentos de doenças cardiovasculares e possibilitar a criação de modelos de doenças cardiovasculares mais fiéis. Nisto, o encapsulamento de iPSC-EPs em microambientes tridimensionais do colagénio (3D) e uma análise quantitativa do potencial vasculogenic destas pilhas são descritos.
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Artigo de método
Modelo in vitro 3D e pipeline computacional para quantificar o potencial Vasculogênico de progenitores endoteliais derivados de iPSC
Neste artigo
Resumo
Resumo
As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são uma fonte de células proliferativa, específica do paciente, que pode se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. Os progenitores endothelial bipotentes (EPs), que podem diferenciar-se nos tipos da pilha necessários para montar o vasculature maduro, funcional, foram derivados das pilhas de haste pluripotentes embrionárias e induzidas. Entretanto, estas pilhas não foram avaliadas rigorosa em ambientes tridimensionais, e uma medida quantitativa de seu potencial vasculogenic permanece indescritível. Aqui, a geração e a isolação de iPSC-EPs através da classificação fluorescente-ativada da pilha são esboçadas primeiramente, seguidas por uma descrição do encapsulamento e da cultura de iPSC-EPs em hydrogels do colagénio. Esta matriz extracelular (ECM)-mimicking microambiente incentiva uma resposta vasculogênica robusta; redes vasculares formam-se após uma semana de cultura. A criação de um pipeline computacional que utiliza software de código aberto para quantificar essa resposta vasculogênica é delineada. Este pipeline é projetado especificamente para preservar a arquitetura 3D do plexo capilar para identificar de forma robusta o número de ramificações, pontos de ramificação e o comprimento total da rede com a entrada mínima do usuário.
Introdução
Células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e outros tipos de células endoteliais primárias têm sido utilizadas há duas décadas para modelar a germinação e o desenvolvimento de vasos sanguíneos in vitro1. Tais plataformas vasculares prometem iluminar mecanismos de nível molecular e tecidual de doenças cardiovasculares e podem apresentar uma visão fisiológica do desenvolvimento de redes vasculares primitivas2,3. Embora o campo da modelagem vascular tenha testemunhado avanços significativos, um ensaio "padrão-ouro" que pode modelar quantitativamente e avaliar o desenvolvimento v....
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Protocolo
1. preparação de meios de cultura e soluções de revestimento
- Para preparar a solução de revestimento de vitronectina, diluir a vitronectina 1:100 em soro fisiológico tamponado com tampão fosfato de Dulbecco (DPBS).
Cuidado: uma vez diluído, não é recomendável armazenar esta solução para uso futuro. - Ao receber fenol vermelho-livre, fator de crescimento-mistura de proteína gelatinosa reduzida (ver tabela de materiais) do fabricante, descongelar no gelo a 4 ° c até que a mistura é transparente e fluido. Mantendo a mistura no gelo em uma capa do fluxo laminar, pipeta 75 μL da mistura em um tubo do microcentrifugador de 1,8 mL e cong....
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Resultados
Após a diferenciação (Figura 1), FACS e encapsulamento de IPSC-EPS em hidrogéis de colágeno, as células geralmente permanecem arredondadas por 24 h antes de começar a migrar e formar Lúmens iniciais. Após cerca de 6 dias de cultura, um plexo capilar primitivo será visível no hidrogel quando visualizado com microscopia brightfield (Figura 2). Após a imagem os hidrogéis fixados, manchados pilha-carregados em um microscópio confocal.......
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Discussão
Este protocolo envolve a cultura a longo prazo das pilhas em três tipos de meios da cultura de pilha: E8, LaSR basal, e EGM-2. Portanto, grande cuidado deve ser tomado para esterilizar adequadamente todos os materiais. Adicionalmente, os revestimentos do laboratório e as luvas etanol-limpas devem sempre ser desgastados ao trabalhar na capa do fluxo laminar do laboratório. Recomenda-se freqüentemente testar para a contaminação do Mycoplasma; se uma grande quantidade de detritos é observada durante a cultura iPSC ou uma qu.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Associação Americana de coração (Grant Number 15SDG25740035, concedido a J.Z.), o Instituto Nacional de imagiologia biomédica e bioengenharia (NIBIB) dos institutos nacionais de saúde (número de subvenção EB007507, concedido a C.C.), e a Aliança para a pesquisa de reabilitação regenerativa & formação (AR3T, concessão número 1 P2C HD086843-01, concedida a J.Z.). Gostaríamos de reconhecer o Prof. Jeanne Stachowiak (a Universidade do Texas em Austin) por seu aconselhamento técnico sobre microscopia confocal. Estamos também gratos por discussões com Samuel Mihelic (a Universidade do Texas em Austin), Dr. Alicia Allen (a Universidade do Texas....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | Uma placa de cultura de tecidos plana, com fundo de vidro, com paredes laterais permite uma imagem de imagem confocal fácil |
| 96 bem, fundo redondo, microplaca de fixação ultrabaixa, estéril | Corning | 7007 | Impede a ligação de hidrogéis de colágeno carregados de células à placa de cultura de células |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Solução suave de descolamento celular; não degrada epítopos extracelulares vitais para FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | A mídia base para diferenciação iPSC-EP. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Sistema de purificação de água; outros podem ser prontamente substituídos Solução de |
| albumina de soro bovino, 7,5% em DPBS, filtrada estéril, BioXtra, adequada para cultura de células | Fisher Scientific | A8412 | Para preservar a viabilidade celular quando os FACs classificam |
| CD34-PE, humano (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Anticorpo usado para isolamento de FACs de iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induz a formação de mesoderma a partir de células estaminais pluripotentes |
| Colagénio I Cauda de Rato Alta Proteína 100 mg | VWR | 354249 | Componente principal do microambiente 3D |
| Tubos de centrífuga cónicos (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Utilizado para armazenar e misturar volumes relativamente grandes de reagentes e meios |
| de cultura celularDAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindo, Dicloridrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Para contracolorir e visualizar núcleos celulares |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | Para diluição de Matrigel e descongelamento de células-tronco pluripotentes |
| Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | Para lavar culturas de monocamada |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | Para a passagem de colônias de células-tronco pluripotentes e para prevenir a agregação celular quando a classificação de FACs |
| Meio de Crescimento de Células Endoteliais 2 | PromoCell | C-22011 | Promove a viabilidade e proliferação de células endoteliais |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Para manutenção de células-tronco pluripotentes |
| Glicina, BioUltra, para biologia molecular, > = 99,0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutraliza o detergente restante |
| Ácido L-ascórbico 2-fosfato sesquimagnésio sal hidratado, > = 95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Componente do meio de diferenciação iPSC-EP |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Ambiente de computação numérica multiparadigma (disponível gratuitamente na maioria das instituições acadêmicas) |
| Matriz Matrigel GFR FenolRF Camundongo 10 mL (mistura de proteínas gelatinosas) | Fisher Scientific | 356231 | Diluído em DMEM/F12 para revestir placas para diferenciação iPSC-EP |
| Médio-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Usado para equilibrar a osmolaridade final do hidrogel e |
| o pH Tubos de microcentrífuga (1,7 mL) | VWR | 87003-294 | Armazena pequenos volumes de reagentes |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | O principal ingrediente das soluções de imunocoloração |
| Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiótico usado após a classificação para remover possível contaminação do instrumento FACS |
| Proteína VEGF 165 humana recombinante | R& D Systems | 293-VE | Mitógeno que estimula a proliferação de células endoteliais e a tubulogênese |
| Faloidina da rodamina | Themo Fisher Scientific | R415 | Para identificar a deposição de F-actina e, portanto, delinear as bordas das redes vasculares |
| Triton X-100 (surfactante não iônico) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergente usado para permeabilizar suavemente as células |
| Tween-20 (reagente emulsificante) | Fisher Scientific | BP337 | Aumenta a especificidade de ligação dos anticorpos adicionados |
| VE-Caderina (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | Identificar o lúmen endotelial 3D em hidrogéis de colágeno |
| Vitronectina | ThermoFisher | A14700 | Para manutenção de células-tronco pluripotentes |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserva a viabilidade de células-tronco pluripotentes e iPSC-EP quando dissociadas e re-semeadas |
Referências
- Wang, K., Lin, R. -Z., Melero-Martin, J. M. Bioengineering human vascular networks: trends and directions in endothelial and perivascular cell sources. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-19 (2018).
- Kant, R. J., Coulombe, K. L. K.
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Reimpressões e permissões
Etiquetas
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