Artigo de método

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

DOI:

10.3791/59353

⸱

9 de maio de 2019

 , 
1Department of Dermatology and Charles C. Gates Center for Regenerative Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo descreve como isolar os queratinócitos da pele dos modelos do rato, manchar com os anticorpos metal-etiquetados, e analisar pilhas manchadas pela citometria maciça a fim examinar o teste padrão da expressão das proteínas do interesse nas fases diferentes do ciclo de pilha.

Resumo

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O objetivo deste protocolo é detectar e quantificar mudanças da expressão da proteína em uma maneira ciclo-dependente da pilha usando únicas pilhas isoladas da epiderme da pele do rato. Há sete etapas importantes: separação da epiderme da derme, digestão da epiderme, coloração das populações de células epidérmicas com cisplatina, amostra de Barcoding, coloração com anticorpos marcados com metal para marcadores de ciclo celular e proteínas de interesse, deteção de anticorpos metal-etiquetados pela citometria maciça, e a análise da expressão nas várias fases do ciclo de pilha. A vantagem desta aproximação sobre métodos histológicos é o potencial para ensaiar o teste padrão da expressão de > 40 marcadores diferentes em uma única pilha em fases diferentes do ciclo da pilha. Essa abordagem também permite a análise de correlação multivariada da expressão protéica que é mais quantificável do que os métodos histológicos/de imagem. A desvantagem deste protocolo é que uma suspensão de células individuais é necessária, o que resulta na perda de informações de localização fornecidas pela coloração de seções de tecido. Essa abordagem também pode requerer a inclusão de marcadores adicionais para identificar diferentes tipos de células em suspensões de células brutas. A aplicação deste protocolo é evidente na análise de modelos hyperplastic da doença de pele. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para a análise do subtipo específico de pilhas (por exemplo, pilhas de haste) pela adição de anticorpos linhagem-específicos. Este protocolo também pode ser adaptado para a análise de células cutâneas em outras espécies experimentais.

Introdução

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A correlação da expressão gênica com os estágios do ciclo celular continua sendo um desafio na análise de modelos animais de doenças hiperplásicas como o câncer. Parte deste desafio é a codetecção de proteínas de interesse (POI) com marcadores de proliferação. Células proliferativas podem ser encontradas em várias fases do ciclo celular, incluindo G1, S, G2 e M. o 67 é um dos marcadores mais comumente usados de proliferação e é expressa em todas as fases do ciclo celular. Tem sido amplamente utilizado na análise dos tecidos humanos e do camundongo1,2,3. No entanto, como outros marcadores de proliferação geral, o 67 não discernir as fases individuais do ciclo celular. Uma aproximação mais precisa usa a incorporação de análogos do nucleotide do timidina como bromodeoxyuridine (BrdU) em pilhas que estão replicando ativamente seu genoma (isto é, S-fase)4,5. Uma desvantagem para o uso de análogos de nucleotídeo é a necessidade de administrá-los a animais vivos horas antes da análise. O 67 e o BrdU são comumente detectados em seções de tecidos fixos pelo uso de anticorpos. Uma vantagem desta aproximação é que a posição dos POIs pode ser verificada dentro da arquitetura do tecido (por exemplo, a camada básica de epiderme da pele). Esta aproximação igualmente não exige a dissociação do tecido que pode conduzir às mudanças na expressão de Gene. Uma desvantagem é que a fixação do tecido ou o processamento do tecido para OCT congelado ou corte de parafina podem oclusos alvos de anticorpos (ou seja, antígenos). A recuperação de antígenos normalmente requer digestão de calor ou tecido. A quantificação das intensidades de coloração também pode ser desafiadora. Isto é devido às variações na mancha, na espessura de seção, na deteção do sinal, e no viés do experimentador. Além disso, um número limitado de marcadores pode ser detectado simultaneamente na maioria das configurações de laboratório típicas. No entanto, novas abordagens de coloração multiplex prometem superar essas limitações; exemplos são citometria de massa por imagem e amplificação de sinaldetiramida6,7.

A citometria de fluxo é outra tecnologia poderosa para detectar células proliferantes. Permite a deteção multiplex dos marcadores nas mesmas pilhas mas exige a dissociação do tecido para a maioria de tipos não-hematopoietic da pilha. A análise de células proliferantes é feita rotineiramente pelo uso de corantes que ligam o DNA (por exemplo, iodeto de Propiídio (PI))8. A citometria de fluxo também permite uma determinação mais precisa das fases do ciclo celular quando associada à detecção da incorporação de BrdU9. Embora uma abordagem poderosa, a citometria de fluxo de BrdU/PI tem suas desvantagens. Não é possível resolver as fases G2/M e G0/G1 sem a inclusão de anticorpos específicos da fase. No entanto, o número de anticorpos que podem ser utilizados é limitado por autofluorescência celular, derrame espectral de emissões de fluoróforo, e o uso de controles de compensação. Essa limitação a marca mais desafiadora e trabalhosa para codetectar a expressão de marcadores de ciclo celular com pis. Uma aproximação mais facile é usar a citometria maciça10,11. Esta tecnologia usa anticorpos conjugados metálicos que têm um espectro de detecção mais estreito. Uma vez que as pilhas são manchadas com os anticorpos metal-etiquetados, são vaporizado, e os metais detectados pela espectrometria maciça do tempo--vôo da citometria (CyTOF). Devido a essas propriedades, a citometria de massa possibilita a detecção multiplex de > 40 marcadores diferentes utilizando as plataformas existentes10,11. Além disso, é possível amostras de código de barras com metais que resultam na poupança de anticorpos preciosos, reduzindo a variabilidade da amostra para a amostra de coloração. Por outro lado, a citometria de massas tem várias desvantagens. Há um número limitado de anticorpos metal-etiquetados comercialmente disponíveis para as pilhas não derivadas do sangue. A quantificação do conteúdo de DNA é menos sensível em comparação com o uso de corantes fluorescentes de DNA e a citometria de massa tem uma faixa dinâmica reduzida de detecção de sinal em comparação com a citometria de fluxo de fluorescência.

O protocolo descrito aqui foi projetado analisar a dinâmica do ciclo de pilha dos queratinócitos recentemente isolados (KCS) da pele do rato e caracterizar a expressão específica da proteína do ciclo de pilha nestas pilhas usando a citometria maciça. Este protocolo também pode ser usado com células cultivadas ou adaptado para outros tipos de células.

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Protocolo

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A Universidade de Colorado Anschutz Medical campus ' institucional animal Care e use Committee aprovou as experiências animais descritas neste protocolo.

1. os preparativos

  1. Projete um painel metal-etiquetado do anticorpo. Use o software de design de painel online gratuito12 e inclua 127iododeoxyuridine (IdU), 164DY (DYSPROSIUM) ROTULADO como CCNB1 (cyclin B1), 175Lu (lutetium) phospho (p)-HISTONEH3Ser28 (pHH3) e 150 Nd (neodímio)-proteína pRETINOBLASTOMASer807/811 (PRB)13. Adicione anticorpos adicionais marcados com metal que não se sobrepõem no sinal de canal14.
  2. Prepare uma solução de estoque de IdU. Dissolver o pó de IdU a 10 mg/mL em 0,1 N NaOH a 60 ° c. Solução de ações aliquot IdU em tubos de microcentrífuga e congelar a-20 ° c para armazenamento de longo prazo.
    1. Ajuste o pH da solução de IdU para 7,5 com 12 N HCl imediatamente antes do uso. Teste com uma faixa de pH em uma alíquota de descarte para garantir que a solução esteja em pH 7,5.
      Nota: o tempo prolongado (> 5 min) de IdU a pH 7,5 resultará em precipitação e uma alíquota fresca de IdU é necessária quando isso acontece.
    2. Use equipamento de proteção individual apropriado (por exemplo, luvas, jaleco e óculos de segurança) e trabalhe em um armário de segurança ao manusear soluções NaOH ou HCl.
  3. Prepare uma solução de fixação 2x paraformaldeído (PFA). Combine 5 mL de PBS 10x (pH 7,5) e 1 mL de 16% de PFA com 44 mL de grau molecular puro dH2O (3,2% de concentração final).
    Nota: um estoque de PFA pode ser preparado como previamente publicado15 ou comprar 16% estoques livres de contaminar metais.
    1. Use o equipamento de proteção pessoal apropriado e trabalhe em um armário de segurança ao segurar o pó e as soluções de PFA.
  4. Prepare O bário (BA2 +) 1X PBS livre combinando 5 ml do PBS 10x metal-livre (pH 7,5) com 45 ml da classe molecular pura DH2O.
    Nota: a qualidade da PBS e outros reagentes é muito importante para evitar contaminar metais que podem introduzir ruídos de fundo durante a análise dos dados citométricos de massa.
  5. Prepare uma solução de 100 mM de cisplatina. Dissolver 300,5 mg de cisplatina em pó em 10 mL de DMSO. Conservar em alíquotas a-80 ° c. Prepare uma solução de trabalho de cisplatina de 10 mM para experimentos a serem usados em 1 d.
  6. Prepare soluções de separação da epiderme/derme. Prepare uma solução de stock de 20x Dispase dissolvendo 30 mg em 1 mL de HBSS ou PBS. Filtro esterilizar através de um filtro de 0,22 μm e armazenar em alíquotas a-20 ° c. Prepare uma solução de colagenase tipo IV de 1x em 1 mg/mL em HBSS, esterilize o filtro através de um filtro de 0,22 μm, e armazene alíquotas a-20 ° c.

2. rotulagem da fase S pela incorporação de IdU

  1. Pese os ratos. Use filhotes neonatais P1-P3 ou camundongos adultos de 8-10 semanas de idade e use camundongos machos ou fêmeas de um C57Bl/6, FVB ou 129 fundos. Determine uma dose em 0,1 mg de IdU (pH 7,5)/g de peso corporal. Por exemplo, um rato de 25 g requer 0,25 mL de IdU.
  2. Administrar a dose de IdU por injeção intraperitoneal e aguardar 2 h antes da colheita das células. Use uma seringa tuberculina para injetar filhotes neonatais.
    Nota: uma dose de 2 mg/mL de IdU pode ser utilizada com células de cultura tecidual com uma incubação de 1 h a 37 ° c antes da colheita e rotulagem para citometria de massas.

3. isolamento de células para rotulagem

  1. Descongelar soluções de estoque de Dispase e colagenase. Diluir a solução de stock 20x Dispase para 1x (1,5 mg/mL) em HBSS estéreis ou PBS. Mantenha no gelo até pronto para usar.
  2. Combine 2 volumes de Dispase com 1 volume de colagenase em um volume total que permita que a pele flutue livremente. Por exemplo, a digestão de 5 peles neonatais do rato pode ser flutuada em 8 ml do Dispase 1x com 4 ml do colagenase em um prato de Petri de 100 milímetros.
  3. Siga os métodos aprovados para eutanizar camundongos experimentais (por exemplo, overdose de isoflurano/Toe pinch check ou CO2 inalação/luxação cervical). Limpe a pele adulta da orelha com uma solução do iodo (veja a tabela dos materiais) e enxague com água estéril quando as pilhas isoladas devem ser usadas para a cultura do tecido.
  4. Retire cirurgicamente a orelha na base (Figura 1a). Lave as orelhas em PBS estéril quando células isoladas deve ser usado para a cultura do tecido. Coloc em um prato de Petri seco de 100 milímetros.
  5. Separe cuidadosamente anterior da pele posterior, criando inicialmente um bolso no meio ou borda da área de corte usando fórceps fino e puxando os dois retalhos de pele para além ( Figura 1b-D). Prossiga com as peles anterior e posterior.
    Nota: as instruções detalhadas para dissecar a pele neonatal do rato são fornecidas por Litchi et al.16 além disso, o uso de um escopo de dissecação pode auxiliar na separação da pele anterior da posterior e na identificação da epiderme/lados dérmicos de dissecados pele: o cabelo é visível no lado da epiderme, enquanto a derme terá uma aparência gelatinosa.
  6. Coloque cuidadosamente as peles anterior e posterior da orelha com o lado da derme da pele tocando a solução Dispase/Collagenase ( Figura 1e). Use 1 mL para a pele anterior e posterior de uma única orelha por poço de uma placa de cultura de 12 poços. Incubar a 37 ° c por 1 h. Alternativamente, as peles do flutuador na solução do Dispase 1x em 4 ° c para 16-18 h.3
    Nota: trabalhe em uma capa da cultura do tecido com a técnica estéril quando as pilhas devem ser cultivadas.
  7. Coloque a pele digerida com o lado da epiderme tocando a superfície de um prato de Petri limpo. Aplainar para fora a pele e deslizar delicadamente a derma fora da epiderme trabalhando do centro às bordas em um teste padrão circular.
  8. Descartar a derme ou digeri-lo ainda mais para liberar fibroblastos para a cultura do tecido ou análise16.
    Nota: a derme será mais escura na aparência e tem uma composição gelatinosa e pegajosa. A derme deve facilmente sair. A falha ou a dificuldade em remover a derma sugerem a digestão insuficiente do tecido. Entretanto, a incubação prolongada no amortecedor da digestão reduzirá a viabilidade da pilha. A epiderme permanecerá no prato de Petri e terá uma aparência branqueada.
  9. Retire suavemente a epiderme agarrando as bordas e retire-a da superfície do prato de Petri. Coloc com cuidado a epiderme na solução pre-warmed do destacamento da pilha (veja a tabela dos materiais) por 5 minutos em 37 ° c ou em 20 minutos em RT. Use 500 μL de solução de descolamento celular para 2 epidermes de orelha adulta por poço de uma placa de cultura de 12 poços e use 750 μL de descolamento celular solução para uma única epiderme neonatal por o poço de uma placa da cultura de 6 poços.
  10. Segure a epiderme usando fórceps estéril e esfregue arrastando a epiderme contra a parte inferior do prato para dissociar as células. Adicione 1 mL de DMEM contendo 1% de FBS (0, 1 mL) e passe por uma peneira de célula de 40 μm em um tubo de coleta. Enxague bem com um adicional de 2 mL de DMEM e adicione à suspensão celular.
  11. Centrifugador em 120 x g por 5 min. aspirar o sobrenadante com cuidado.
  12. Reressuscitem a pelota da pilha em 1-2 mL de DMEM que contem 1% FBS. Determine a célula e% contagens de células ao vivo usando o trypan Blue e um dispositivo de contagem automatizada ou hemociômetro. Células da pelota conforme descrito na etapa 3,11.
    Nota: as células podem ser cultivadas em meios de cultura de tecidos apropriados após a etapa 3,12. 17 anos de

4. cisplatina rotulagem para determinar vivo/células mortas

  1. Ressuscitem 1-3 x 106 células por 1 ml de DMEM contendo 25 μm de cisplatina (2,5 μL de estoque/ml). Incubar durante 1 min e saciar com pipetagem com um volume igual de FBS (por exemplo, 1 mL).
  2. Centrifugue a 120 x g por 5 min. sobrenadante decante em uma taça contendo lixívia diluída e tubos invertidos para drenar a solução restante para uma toalha de papel. Bata suavemente para liberar a solução restante na pelota e parede lateral do tubo.
  3. Ressuspender a pelota da pilha em 2 mL de Ba+ 2-PBS livre. Células da pelota conforme descrito em etapa 4,2.
    Nota: recomenda-se fixar as células se não puderem ser manchadas imediatamente.

5. fixação de células etiquetadas com cisplatina (opcional)

  1. Ressuscito 1-3 x 106 cisplatina rotulado células em 1 ml de Ba+ 2-livre de PBS. Células Vortex baixa potência contínua e adicionam gota gota 1 ml (1 volume) do tampão de fixação 2x PFA. Incubar em RT por 10 min em uma plataforma de balanço.
  2. Células da pelota como descrito na etapa 4,2, mas centrifugar a 500 x g por 5 min.
  3. Lave as células com 2 mL de Ba+ 2-livre de PBS e células da pelota, conforme descrito na etapa 5,2. Repita o passo 5,3 uma vez.
  4. Resuspend o pellet em 2 mL de Ba+ 2-livre PBS. Conservar a 4 ° c por < 3 d. Adicionar FBS a 3% (por exemplo, 0,3 mL de FBS/mL de células) do volume total se armazenar mais > 3 d, depois misturar e congelar a-80 ° c.
    Nota: a fixação pode afetar a detecção de certos Epitopes. Os efeitos da fixação no sinal do anticorpo precisam de ser determinados empirically.

6. código de barras de amostras (opcional, mas recomendado)

  1. Células da pelota como descrito em Step 5,2 e, em seguida, ressuscite 1-3 x 106 células em 1 ml de 1x tampão de fixação (ver tabela de materiais). Incubar em RT por 10 min. células da pelota conforme descrito na etapa 5,2.
  2. Lave as células com 1 mL de tampão de permeabilização de código de barras (ver tabela de materiais). Células da pelota conforme descrito em etapa 5,2. Repita o passo 6,2 uma vez.
  3. Adicionar 100 μL de tampão de permeabilização de código de barras a códigos de barras (ver tabela de materiais)18 e misture imediatamente enquanto as células da etapa 6,2 são peletização.
  4. Ressuscitem o pellet celular em 800 μL de tampão de permeabilização de código de barras. Adicione a solução de código de barras às células, misture e incubar em RT por 30 min. células da pelota conforme descrito na etapa 5,2. Lave as células em 2 mL de célula de reserva de coloração (ver tabela de materiais) e pellet novamente.
    Nota: até 20 amostras podem ser rotuladas com várias combinações de metais Palladium18. Outras estratégias de código de barras são descritas em outros lugares15.

7. rotulagem de células para citometria de massas

  1. Ressuscite 1-3 x 106 células em 1 ml de antígeno nuclear coloração solução tampão de trabalho (ver tabela de materiais). Combine amostras em um único tubo para etapas subseqüentes ao usar amostras com código de barras. Incubar em RT por 30 min. pellet conforme descrito na etapa 5,2.
  2. Ressuscite 1-3 x 106 células em 2 ml de antígeno nuclear que mancha o amortecedor da permeabilização (veja tabela dos materiais). Escala conforme necessário. Por exemplo, use 6 mL do buffer para 10 amostras combinadas com uma contagem de células de 9 x 106 células. Pellet conforme descrito na etapa 5,2.
  3. Repita o passo 7,2. Vórtice suavemente o pellet celular no volume residual deixado no tubo.
  4. Adicionar 50 μL de cocktail de anticorpos intracelulares por 1-3 x 106 células. Escala conforme necessário. Por exemplo, use 150 μL do coquetel de anticorpos para 10 amostras combinadas com uma contagem de células de 9 x 106 pilhas. Misture e incubar em RT para 45 min. adicionar 2 mL de pilha de mancha tampão e pellet como descrito na etapa 5,2.
  5. Resuspend 1-3 x 106 células pellet em 2 ml de célula mancha tampão. Células da pelota conforme descrito em etapa 5,2. Repita o passo 7,5 uma vez.
    Nota: outras soluções de tampão podem ser usadas para manchar a membrana extracelular ou os marcadores cytoplasmic e o experimentador podem ter que aperfeiçoar a mancha se há uma necessidade de detectar resumos em posições celulares diferentes. As células também podem ser corrigidas no PFA após a etapa 7,5 ao usar células ao vivo para coloração.
  6. Ressuscitação 1-3 x 106 células em 1 ml de solução de intercalação e armazenar para 1-3 d a 4 ° c.
    1. Armazene pilhas em-80 ° c no DMSO que contem a solução para > 3 d. pilhas da pelota como descrito em etapa 5,2 se as pilhas estão na solução do intercalação. Ressuspender a pelota (1-3 x 106 células) em 1 ml de células tampão de coloração da pilha e pilhas da pelota como descrito em etapa 5,2. Resuspend pellet em 1 mL de 10% DMSO/90% FBS19, transferência para um criovial, coloque em um isopropanol-congelamento recipiente, e armazenar a-80 ° c.
  7. Células da pelota conforme descrito em etapa 5,2. Lave 1-3 x 106 células com 2 ml de tampão de coloração celular, peletização conforme descrito na etapa 5,2. Realize duas lavas adicionais com 2 mL de água, peletização conforme descrito na etapa 5,2.
  8. Diluir a calibração do EQ Perla 1:9 na água (solução do estoque em 3,3 x 105 grânulos/ml).
  9. Resuspend a pelota da pilha em uma concentração de 1 x 106 Cells/ml com solução diluída do grânulo do EQ. Filtre as células através dos tubos de fluxo de 35 μm.
  10. Execute amostras no citômetro maciço e adquira dados. Os dados serão depositados em um formato de arquivo padrão de citometria de fluxo (FCS).

8. processamento e análise de arquivos de dados de citometria de massa

  1. Normalize arquivos FCS. Use um programa gratuito disponível em https://github.com/nolanlab/bead-normalization/releases/latest20
  2. Arquivos de FCS com código de barras deconvolute. Separe a população de código de barras agrupada em arquivos com códigos de barra separados com um programa gratuito disponível em https://github.com/nolanlab/single-cell-debarcoder/releases/latest18
  3. Analise arquivos normalizados de FCS. Use programas comerciais21,22 ou freeware (consulte Web.Stanford.edu/Group/Nolan/Resources.html).

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Resultados

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A tabela 1 mostra os rendimentos e a viabilidade celulares esperados da orelha de camundongo adulto (Figura 1) e da pele neonatal em condições não patológicas. A tabela também mostra dados representativos de animais de um fundo misto C57/126. Espera-se que a pele de outras cepas resultaria em rendimentos de células semelhantes e viabilidades. O rendimento aproximado é dependente da área superficial da pele e indica que a pele neonatal seria u...

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Discussão

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O protocolo esboçado neste papel pode ser terminado em aproximadamente 8 h. O resultado final é uma suspensão de células enriquecidas em KCs que podem ser analisadas para a expressão protéica de forma dependente do ciclo celular. Vários estudos anteriores têm delineado métodos para isolar KCS da pele humana e do rato16,25. Esses estudos também incluem protocolos para o isolamento de KCs para citometria de fluxo26. Entretanto, um protocolo ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

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O apoio para este trabalho veio do departamento de Dermatologia, o centro de Gates para medicina regenerativa da Universidade do Colorado e da Universidade do Colorado (UC) pele Disease Center morfologia e núcleos de fenotipagem (NIAMS p30 AR057212). Os autores reconhecem o recurso compartilhado da citometria de fluxo do centro do cancro UC e a concessão da sustentação (NCI p30 CA046934) para a operação do citômetro maciço e são gratos para Karen Helm e Christine Childs no núcleo para seu conselho perito no fluxo e na massa cytometric do Técnicas.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de 12 poçosCell Treat229512
Intercalator solutionFluidigm201192A125 µ M - Ir intercalator solução
ParaformaldeídoMicroscopia Eletrônica Sciences30525-89-416%  Tubos de fluxo de
tampa de filtroFisher/Corning35223535 µ m tamanho do poro 
Peneira de célulaFisher2236354740 μ m tamanho do poro 
Solução de desprendimento celularCELLnTECCnT-ACCUTASE-100Solução de Iodo Accutase
ThermoFisher/Purdue67618-151-17Betadine 7.5%-iodo esfoliante cirúrgico
Tampão de permeabilização de código de barras Fluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd Kit de Código de Barras
BarrasFluidigm201060Cell-ID 20-Plex Pd Kit de Código
de Barras Tiras de pHEMD9590colorpHast
DMEMHycloneSH30022.01Dulbecco' s Modificado Eagle Media
Fine fórcepsDumont & amp Fils0109-5-PODumostar #5
Pinça de precisão curvaDumont & Fils0109-7-PODumostar #7
Contas de CalibraçãoFluidigm201078EQ Quatro Elementos de Calibração
HBSSGibco14175-095Hank's Solução Salina Balanceada
ÁguaFisherSH30538.03Hyclone Biologia Molecular grau água
Iododesoxiuridina  Frascos SigmaI7125IdU
CryoThermoFisher366656PKtampão
de coloração de célulasFluidigm201068Maxpar Cell Staining buffer
Fix & Tampão permanenteFluidigm201067Maxpar Fix & Tampão permanente
Tampão Fix IFluidigm201065Tampão Maxpar Fix I
Solução salina tamponada com fosfatoRocklandMB-008PBS sem metal 10x
ThermoFisher5100-0001Mr.Frosty
Hidróxido de sódioFisherBP359-500NaOH
Placa de PetriKord-Valmark2900Fornecido por Genesee 32-107 
15 mL cônicoOlympus / Genesee28-101
50 mL cônicoOlympus / Genesee28-106
placa de 6 poçosCell Treat229506
CisplatinaSigma479306
Dispase IISigma / Roche4942078001
DMSOSigmaD2650
FBSAtlanta BiologicalsS11150
Ácido clorídricoFisherA144-212
Coloração de Antígeno Nuclear  tampão de permeabilizaçãoFluidigm201063
Tampão de coloração de antígeno nuclearFluidigm201063
Trypan blueSeringa deT8154
BD309626
Colagenase tipo IVBiociência WorthingtonCLSS-4
PFA Códigos de de rosca interna Recipiente de congelamento de isopropanol 6 tuberculina Sigma

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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