Nós oferecemos mangustos prisionais placebo iscas de vacina contra a raiva oral com ácido etílico ou metil iofenóxico como um biomarcador e verificado captação de isca usando uma nova cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS) método.
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Artigo de método
Análise de análogos de ácido Iofenoxico em pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) sera para uso como um marcador biológico de vacinação contra a raiva oral
Neste artigo
Resumo
Resumo
O Mongoose indiano pequeno (auropunctatus de Herpestes) é um reservatório do vírus da raiva (rabv) em Puerto Rico e compreende sobre 70% de casos animais da raiva relatados anualmente. O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado por uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Atualmente não há vida selvagem ORV programa existe em Porto Rico. A pesquisa em vacinas orais da raiva e em vários tipos da isca para mangustos foi conduzida com resultados prometedores. O monitoramento do sucesso da ORV depende da estimativa da captação de iscas por espécies-alvo, o que tipicamente envolve a avaliação de uma alteração nos anticorpos neutralizantes da RABV (RVNA) pós-vacinação. Esta estratégia pode ser difícil de interpretar em áreas com um programa ORV de vida selvagem ativa ou em áreas onde o RABV é enzoótico e níveis de fundo de RVNA estão presentes em espécies de reservatórios. Em tais situações, um biomarcador incorporado com a vacina ou a matriz de isca pode ser útil. Nós oferecemos 16 mangustos em cativeiro placebo ORV iscas contendo ácido etil-iofenoxico (et-IPA) em concentrações de 0,4% e 1% dentro da isca e 0,14% na matriz de isca externa. Nós também oferecemos 12 mangustos cativos ORV iscas contendo ácido metil-iofenoxico (me-IPA) em concentrações de 0, 35%, 0, 7% e 0,14% na matriz de isca externa. Nós coletamos uma amostra do soro antes da oferta da isca e então semanalmente por até oito semanas de oferta do borne. Nós extraímos ácidos iophenoxic dos soros no acetonitrila e quantificamos usando a cromatografia líquida/espectrometria maciça. Foram analisados soros para et-IPA ou me-IPA por cromatografia líquida-espectrometria de massas. Nós encontramos a habilidade adequada da marcação por pelo menos oito e quatro semanas para o et-e o me-IPA, respectivamente. Ambos os derivados IPA poderia ser adequado para avaliação de campo de captação de isca ORV em Mongooses. Devido à longevidade do marcador em soros de Mangusto, o cuidado deve ser tomado para não confundir os resultados usando o mesmo derivado IPA durante avaliações consecutivas.
Introdução
O vírus da raiva (RABV) é um único lyssavirus encalhado do sentido negativo, e circula entre espécies diferentes do reservatório dos animais selvagens dentro das ordens Carnivora e Chiroptera. Várias espécies de mangusto são reservatórios de RABV, e o pequeno mangusto indiano (Herpestes auropunctatus) é o único reservatório em Porto Rico e outras ilhas caribenhas no hemisfério ocidental1,2,3 . O controle da circulação de RABV em reservatórios de vida selvagem é tipicamente realizado através de uma estratégia de vacinação contra a raiva oral (ORV). Nos Estados Unidos ....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais do USDA National Wildlife Research Center o protocolo de pesquisa aprovado QA-2597.
Nota: o seguinte protocolo descreve o procedimento de análise para detectar o ácido metil-iofenoxico no soro de mangusto. Este método é a versão final de um processo iterativo que começou com a análise do ácido etil-iofenoxico no soro do Mongoose. Durante a avaliação inicial do ácido etil-iofenoxico foram feitas modificações menores nos métodos, resultando no protocolo final apresentado abaixo. Os resultados representativos incluem aqueles obtidos durante ambas as i....
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Resultados
Os cromatogramas de íons representativos de uma análise do me-IPA são apresentados na Figura 1. O soro do Mongoose do controle (Figura 1a) ilustra o tempo de retenção de et-IPA (analyte substituto) e a ausência de me-IPA no tempo de retenção indicado. A amostra de controle de qualidade (Figura 1b) ilustra a separação de linha de base do me-IPA do et-IPA, bem como as transições de quantificador e qual.......
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Discussão
O método de LC-MS/MS desenvolvido para os estudos utilizou a seletividade da monitoração múltipla da reação para quantificar com precisão o me-IPA e o et-IPA no soro do Mongoose. A seletividade da detecção de MS/MS também permitiu um protocolo simples de limpeza que dependesse unicamente de acetonitrila para precipitar proteínas do soro antes da análise.
Os ácidos iofenóxicos são solúveis em ACN, mas são praticamente insolúveis em água. Para excluir a água da extração da ACN, foi adicionado cl.......
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Divulgações
Autores AV e SO são funcionários em tempo integral de um fabricante de isca de vacina oral raiva.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo programa de pesquisa intramural do departamento de agricultura dos EUA, serviço de inspeção de saúde animal e vegetal, serviços de vida selvagem, programa nacional de gestão da raiva e IDT Biologika (Dessau-Rosslau, Alemanha).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetonitrila, grau Optima | Fisher | A996 | |
| Balança analítica | Mettler Toledo | XS204 | |
| C18 coluna, 2,1 x 50 mm, 2,5-µ m tamanho de partícula | Waters Corp. | ||
| ESI Source | Agilent | G1958-65138 | |
| Ácido etil-iofenóxico, 97 | Sigma Aldrich | N / A | Lote MKBP5399V |
| ácido fórmico, grau LC / MS | Fisher | A117 | |
| Software LCMS | Agilent | MassHunter Aquisição de dados e análise | |
| Ácido metil-iofenóxico, 97% (p / p) | PR EuroChem Ltd. | N / A | Lote PR0709514717 |
| Balança microanalítica | Mettler Toledo | XP6U | |
| Microcentrífuga | Eppendorf | 5415C | |
| MS / MS | Agilent | G6470A | |
| N-Evap | Organomation | 115 | |
| Iscas orais para vacina anti-rábica | IDT Biologika, Dessau Rossleau, Alemanha | N / A | |
| Ácido propil-iofenóxico, 99 % (m/m) | PR EuroChem Ltd. | N/A | Lote PR100612108RR |
| Pipettor de repetição | Eppendorf | M4 | |
| Tampas de frasco de amostrador automático com tampa de rosca, | Agilent | 5190-7024 | |
| Cloreto de sódio, certificado ACS grau Fisher | S271 | ||
| Pacote de software estatístico | SAS Institute, Cary, Carolina do Norte, EUA N | /A | |
| Ácido trifluoroacético, 99% | Alfa Aesar | L06374 | |
| UPLC | Agilent | 1290 Series | |
| Misturador de Vórtice | Glas-Col | 099A PV6 | |
| Pontas de pipetador de 0,2 mL | Eppendorf | 30089.413 | |
| Pontas de pipetador de 0,5 mL | Eppendorf | 30089.421 | |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL | Fisher | 14-666-325 | |
| 1250-& Micro; Ponteiras de pipeta com capacidade L | GeneMate | P-1233-1250 | |
| Ponteiras pipetadoras de 1 mL | Eppendorf | 30089.43 | |
| Frascos de amostrador automático âmbar com tampa de rosca de 2 mL | Agilent | 5182-0716 | |
| Ponteiras de pipetador de 5 mL | Eppendorf | 30089.456 | |
| Rack de tubo de microcentrífuga de 80 posições | Fisher | 05-541-2 | |
| Frascos âmbar de 8 mL com Tampas revestidas com PTFE | Wheaton | 224754 | |
| 70% (v/v) isopropanol | Fisher | A459 | |
| 100-1000 µ L pipeta de deslocamento de ar | Eppendorf | ES-100 |
Referências
- Nel, L. H., et al. Mongoose rabies in southern Africa: a re-evaluation based on molecular epidemiology. Virus Research. 109 (2), 165-173 (2005).
- Zieger, Z., et al. The phylogeography of rabies in Grenada, W....
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Reimpressões e permissões
