Microscopia de seguimento da único-molécula-uma ferramenta para determinar os Estados diffusive de moléculas cytosolic

Summary

a microscopia da localização da único-molécula 3D é utilizada para sondar as posições espaciais e as trajetórias do movimento de proteínas cDNAs etiquetadas em pilhas bacterianas vivas. O protocolo de análise experimental e de dados descrito neste documento determina os comportamentos diffusivos prevalentes de proteínas citosómicas baseadas em trajetórias unimoléculas agrupadas.

Abstract

A microscopia da localização da único-molécula sonda a posição e os movimentos de moléculas individuais em pilhas vivas com dezenas de definição temporal espacial e milisecond do nanômetro. Estas capacidades fazem a microscopia da localização da único-molécula serida idealmente para estudar funções biológicas do nível molecular em ambientes fisiologicamente relevantes. Aqui, demonstramos um protocolo integrado para aquisição e processamento/análise de dados de rastreamento de molécula única para extrair os diferentes Estados diffusivos que uma proteína de interesse pode expor. Esta informação pode ser usada para quantificar a formação complexa molecular em células vivas. Fornecemos uma descrição detalhada de uma experiência de localização de molécula 3D baseada em câmera, bem como as etapas subseqüentes de processamento de dados que produzem as trajetórias de moléculas individuais. Essas trajetórias são então analisadas por meio de uma estrutura de análise numérica para extrair os Estados difusivos prevalentes das moléculas rotuladas fluorescentamente e a abundância relativa desses Estados. A estrutura de análise é baseada em simulações estocásticas de trajetórias de difusão brownianas intracelulares que são confinadas espacialmente por uma geometria de célula arbitrária. Com base nas trajetórias simuladas, as imagens de molécula única bruta são geradas e analisadas da mesma forma que as imagens experimentais. Dessa forma, as limitações experimentais de precisão e precisão, que são difíceis de calibrar experimentalmente, são explicitamente incorporadas ao fluxo de trabalho de análise. O coeficiente de difusão e as frações populacionais relativas dos Estados diffusivos prevalentes são determinados ajustando-se as distribuições dos valores experimentais utilizando combinações lineares de distribuições simuladas. Nós demonstramos a utilidade de nosso protocolo resolvendo os Estados difusivo de uma proteína que exiba Estados difusivo diferentes em cima de formar complexos do Homo-e do hetero-oligomeric no citosol de um micróbio patogénico bacteriano.

Introduction

Examinar o comportamento difusivo de biomoléculas fornece a introspecção em suas funções biológicas. Técnicas baseadas em microscopia de fluorescência tornaram-se ferramentas valiosas para observar biomoléculas em seu ambiente de células nativas. A recuperação da fluorescência após o photobranqueamento (Frap) e a espectroscopia da correlação da fluorescência (FCS)¹ fornecem comportamentos difusivo Ensemble-calculados. Inversamente, a microscopia da localização da único-molécula permite a observação de moléculas cDNAs etiquetadas individuais com definição espacial e temporal elevada^2,3,4....

Protocol

1. calibração do ponto-propagação-função da dobro-hélice

Nota: as imagens descritas neste e as secções seguintes são adquiridas através de um microscópio de fluorescência invertido personalizado, conforme descrito em rocha et al.²³. O mesmo procedimento é aplicável às implementações diferentes do microscópio projetadas para a localização da único-molécula e a microscopia de seguimento^2,3,4. Todos os softwares para aquisição de imagens e processamento de dados descritos neste artigo estão disponíveis (https://github.com/Gahlman....

Results

as condições experimentais descritas aqui (20.000 frames, comprimento mínimo da trajetória de 4 localizações) e dependendo dos níveis da expressão das proteínas cDNAs etiquetadas da fusão, aproximadamente 200-3000 localizações que rendem 10-150 trajetórias podem ser geradas por célula (Figura 2a, b). Um grande número de trajetórias é necessário para produzir uma distribuição bem amostrada de coeficientes de difusão aparente. O tamanho do FOV .......

Discussion

Um fator crítico para a aplicação bem sucedida do protocolo apresentado é assegurar-se de que os sinais da único-molécula estejam bem separados de se (isto é, precisam de ser esparsos no espaço e no tempo (Mov. 1 suplementar)). Se houver mais de uma molécula fluorescente em uma célula ao mesmo tempo, então a localização pode ser incorretamente atribuída à trajetória de outras moléculas. Isto é referido como o problema de ligação³⁰. As condições experimentais, tais como os níveis d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido 2,6-diaminopimélico	Chem Impex International	5411	Necessário para o crescimento de células Y. enterocolitica usadas.
Lentes 4f	Thorlabs	AC508-080-A	f = 80mm, laser de 2"
514 nm	Coherent	Genesis MX514 MTM	Uso para excitação de fluorescência
agarose	Inivtrogen	16520100	Usado para fazer almofadas de gel para montar amostras bacterianas líquidas no microscópio.
cloreto de amônio	Sigma Aldrich	A9434	M2G ingrediente.
filtro passa-banda	Chroma	ET510/bp	Via de excitação.
Infusão de Coração Cerebral	Sigma Aldrich	53286	Meio de crescimento para Y. enterocolitica.
cloreto de cálcio	Sigma Aldrich	223506	ingrediente M2G.
fonte	de imagem	DMK 23UP031	Câmera para imagens de contraste de fase.
máscara de fase dielétrica	Double Helix, LLC	N/A	Produz sinal DHPSF.
fosfato dissódico	Sigma Aldrich	795410	ingrediente M2G.
ácido etilenodiaminotetracético	Fisher Scientific	S311-100	Quelatos Ca2+. Induz secreção no T3SS.
espelho flip	Newport	8892-K	Permite alternar entre as vias de fluorescência e contraste de fase.
Esferas fluorescentes	Invitrogen	F8792	Comprimentos de onda de exicação e emissão 540/560. Diâmetro de 40 nm.
lamínula de vidro	VWR	16004-302	#1.5, glicose de 22mmx22mm
	Chem Impex International	811	M2G ingrediente.
óleo de imersão	Olympus	Z-81025	Colocado na lente objetiva.
sulfato de ferro (II)	Sigma Aldrich	F0518	M2G ingrediente.
filtro de passagem longa	Semrock	LP02-514RU-25	Caminho de emissão.
sulfato de magnésio	Fisher Scientific	S25414A	ingrediente M2G.
plataforma de microscópio	Mad City Labs	personalizada	para microscópio invertido.
nalidíxico	Sigma Aldrich	N4382	Y. enterocolitica as células utilizadas são resistentes ao ácido nalidíxico.
lente objetiva	Olympus	1-U2B991	60X, 1.4 NA
Limpador de ozônio	Novascan	PSD-UV4	Usado para eliminar a fluorescência de fundo em lamínulas de vidro.
fosfato de potássio	Sigma Aldrich	795488	ingrediente M2G.
LED vermelho	Thorlabs	M625L3	Ilumina a amostra para imagens de contraste de fase. 625nm.
Câmera sCMOS	Câmera Hamamatsu	ORCA-Flash 4.0 V2	para imagens de fluorescência.
filtro passa-curto	Chroma	ET700SP-2P8	Caminho de emissão.
Lente tubular	Thorlabs	AC508-180-A	f=180 mm, 2"
Yersinia enterocolitica dHOPEMTasd	N/A	/A	Cepa AD4442, eYFP-YscQ
placa de quarto de onda de ordem zero	Thorlabs	WPQ05M-514	Via de excitação.