Artigo de método

Método para obter padrão de respiração em camundongos senescentes através de plethysmografia barométrica sem restrições

DOI:

10.3791/59393

⸱

28 de abril de 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Le Moyne College, 2Department of Mathematics, Statistics and Computer Science, Le Moyne College

Neste artigo

Resumo

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A pletimografia barométrica desenfreada é usada para quantificar o padrão de respiração em camundongos acordados. Mostramos que 15 segmentos s sob um protocolo padronizado exibem valores semelhantes a uma longa duração de respiração silenciosa. Essa metodologia também permite a quantificação de apnéia e respiração aumentada durante a primeira hora na câmara.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pletimografia barométrica desenfreada (UBP) é um método para quantificar o padrão de respiração em camundongos, onde a frequência respiratória, o volume das marés e a ventilação minuciosa são rotineiramente relatados. Além disso, informações podem ser coletadas sobre a saída neural da respiração, incluindo a existência de apnéias centrais e respirações aumentadas. Uma consideração importante para a UBP é a obtenção de um segmento respiratório com um impacto mínimo de comportamentos ansiosos ou ativos, para elucidar a resposta aos desafios respiratórios. Aqui, apresentamos um protocolo que permite que linhas de base curtas e silenciosas sejam obtidas em camundongos idosos, comparáveis à espera de crises mais longas de respiração tranquila. O uso de segmentos de tempo mais curtos é valioso, pois algumas cepas de ratos podem ser cada vez mais excitantes ou ansiosas, e períodos mais longos de respiração silenciosa podem não ser alcançados dentro de um prazo razoável. Colocamos ratos de 22 meses em uma câmara ubp e comparamos quatro segmentos de respiração tranquila de 15 s entre os minutos 60-120 para um período de respiração mais longo de 10 minutos que levou de 2 a 3 h para adquirir. Também obtivemos contagem de apnéias centrais e respirações aumentadas antes dos segmentos respiratórios silenciosos, após um período de familiarização de 30 min. Mostramos que 10 min de respiração silenciosa é comparável ao uso de uma duração muito menor de 15 s. Além disso, o tempo que leva a esses 15 segmentos de respiração silenciosa pode ser usado para coletar dados sobre apnéias de origem central. Este protocolo permite que os investigadores coletem dados de padrão de respiração em um período de tempo definido e torna viável medidas de linha de base silenciosas para ratos que podem exibir quantidades aumentadas de comportamento excitável. A própria metodologia da UBP fornece uma maneira útil e não invasiva de coletar dados de padrão de respiração e permite que os camundongos sejam testados ao longo de vários pontos de tempo.

Introdução

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UBP é uma técnica comum para a avaliação de padrões respiratórios1,2,3,4. Neste método, os camundongos são colocados em uma câmara fechada onde as diferenças de pressão entre a câmara principal (onde o animal está alojado) e uma câmara de referência são filtradas através de um pneumotacógrafo para obter valores. A configuração resultante da UBP é não invasiva e desenfreada e permite que as medidas respiratórias sejam avaliadas sem a necessidade de anestesia ou cirurgia. Além disso, esta técnica é adequada para estudos que requerem múltiplas medidas no mesmo mouse ao longo do tempo. Variáveis como frequência respiratória, volume de maré e ventilação minuciosa podem ser quantificadas com este método, durante um único ensaio ou em vários ensaios. A UBP de corpo inteiro também fornece medidas de pico de fluxos e duração do ciclo respiratório. Juntos, esses parâmetros quantificam o padrão de respiração. Os traços respiratórios registrados também possibilitam a revisão dos dados e a contagem do número de apnéias centrais exibidas dentro de um determinado período de tempo. Esta contagem pode ser usada juntamente com uma análise do volume das marés e tempos inspiradores para medir outras alterações no padrão de respiração.

Embora existam várias técnicas de pletimografia não invasiva para a avaliação direta dos parâmetros fisiológicos pulmonares, a UBP de corpo inteiro permite uma maneira de testar a função respiratória com o mínimo de estresse indevido ao camundongo. A pletimismografia da cabeça, que utiliza medidas de fluxo midexpiratório de marés e também não invasiva, depende da contenção, como muitos outros tipos de plethysmografia (por exemplo, pletimismografia de câmara dupla). Embora esses métodos tenham sido usados em modelos de roedores para medir a capacidade de resposta das vias aéreas5, o uso de coleiras de pescoço ou pequenos tubos de contenção pode levar os camundongos (vs. outras espécies) mais tempo para se adaptar e retornar sua respiração a níveis de repouso.

A obtenção de um segmento de respiração de ar ideal é uma consideração importante para as comparações de linha de base. O aumento do uso de sistemas de plethysmografia comercialmente disponíveis torna possível a coleta de dados de padrão de respiração em muitos laboratórios. É importante ressaltar que o padrão de respiração é variável durante todo o período de coleta, particularmente para camundongos. Dito isso, é necessário padronizar a análise da linha de base como forma de garantir que o nível de treinamento dos experimentadores não confunda resultados. Existem inúmeras maneiras de coletar um segmento de respiração do ar, servindo como uma área de variação entre projetos experimentais. Um exemplo inclui a média dos 10-30 min finais de dados seguindo um conjunto de tempo previamente definido dentro da câmara1, enquanto outro método envolve esperar até que o mouse esteja visivelmente calmo por 5-10 min6. Este último pode levar de 2 a 3 h para conseguir e, em alguns casos, um julgamento pode precisar ser abandonado se o mouse não estiver calmo por tempo suficiente. Essa preocupação é uma consideração especialmente importante para cepas de camundongos onde os comportamentos observados são mais ansiosos e excitáveis7. Esses ratos podem demorar mais tempo para se adaptar ao ambiente da câmara e permanecer apenas calmos por curtos períodos de tempo. Limitar o tempo dedicado à coleta de linha de base padroniza o tempo de câmara para cada mouse.

É crucial que os experimentadores obtenham uma linha de base adequada que engloba valores de comportamento de repouso no camundongo, mas também ocorre em tempo hábil. Assim, o objetivo deste relatório é fornecer uma descrição dos métodos utilizados para obter valores de linha de base curtos e silenciosos para parâmetros respiratórios em camundongos. Além disso, relatamos que apneias e respirações aumentadas podem ser quantificadas durante a primeira hora na câmara.

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Protocolo

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Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso De Animais Institucionais do Le Moyne College. Todo o uso de animais estava de acordo com as políticas descritas no Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório8.

NOTA: (Crítico) Antes da experimentação, obtenha todas as aprovações e treinamentonecessários necessários para o uso animal. É importante que os experimentadores estejam familiarizados com os comportamentos do rato e os níveis de atividade, incluindo sinais de sono, angústia e/ou artefato de movimento versus cheiro e respiração normais.

1. Câmara de Plethysmografia Barométrica de corpo inteiro

  1. Leia os manuais de usuário apropriados para a câmara de pletimografia barométrica, incluindo conectores, anéis O, etc., e crie um arquivo de protocolo padrão para definir analisadores (por exemplo, metabólicos) e parâmetros específicos para o software.
  2. Certifique-se de que todas as mangueiras e tubos estão conectados à câmara. Conecte um tubo de fluxo de gás (flow-in) e um tubo de vácuo (flow-out) diretamente à câmara de pletimografia barométrica.
    NOTA: O fluxo de entrada deve ser anexado ao fluxo de viésmarcado de abertura .
  3. Coloque os tanques de gás CO2,O2e N2 na batedeira de gás. Certifique-se de que todos os tanques de gás estão em posição aberta antes da experimentação.

2. Calibração da Câmara Depletilógrafo Barométrico

  1. Calibrar um alto e um baixo fluxo de gás selecionando a configuração do amplificador 7700 sob a guia Hardware do software de pletimografia barométrica.
  2. Defina um vácuo (fluxo para fora da câmara) apropriado para o projeto experimental e analisadores de gás (~0,1 L/min).
    NOTA: A taxa de saída deve permanecer a mesma durante as calibrações e experimentos para gravações metabólicas precisas.
  3. Defina um baixo fluxo de ar removendo o tubo de fluxo da câmara e desligando o vácuo.
  4. Registre o fluxo zero digitando um 0 na célula Unidade Baixa para a câmara correspondente. Clique duas vezes na célula Low Cal, altere o tempo para 3 s e aperte Measure.
  5. Reconecte o tubo de fluxo e permita que o gás (20,93% O2, equilibrado N2) flua através da câmara de pletimografia barométrica a partir do misturador de gás.
  6. Converta a entrada de litros/minutos em mililitros/segundo. Clique na célula Unidade Alta para a câmara correspondente e digite o valor em mililitros/segundo. Clique duas vezes em High Cal,altere a hora para 3 s e clique em Medir.
  7. Abra a guia configuração do 7700-Amplifier para calibrar os analisadores metabólicos para o software de pletimografia barométrica.

3. Calibração do analisador metabólico

  1. No programa de misturador de gás, defina o misturador de gás para liberar um fluxo de gás contendo 20,93% O2 e 79,07% N2.
  2. Nos analisadores metabólicos, defina o nível de calibração de O2 para 20,93% e o CO2 para ler 0%. Gire o mostrador de volta para Sample assim que os valores apropriados forem inseridos.
  3. Defina a alta porcentagem de O2. Clique na guia ABCD-4 do software de pletimografia barométrica e, em seguida, digite 20,93 em Unidade Alta da linha C2. Em High Cal,mude o tempo para 3 s e aperte Measure.
  4. Defina a baixa porcentagem de CO2. Digite 0 em Low Cal da linha C3 e, em seguida, altere o tempo para 3 s e clique em Medir em Low Cal.
  5. No programa de misturador de gás, altere o valor de O2 para 10% e o valor de CO2 para 5%. Aguarde vários minutos para que o fluxo de gás se ajuste a esses valores. Nos analisadores metabólicos, gire os botões de ajuste para calibrar CO2 igual a 5%. Certifique-se de girar o mostrador de volta para Amostra uma vez que os valores estejam calibrados.
  6. Defina a alta porcentagem de CO2. Certifique-se de que as leituras do analisador estão estáveis antes de inserir valores apropriados no O2 e CO2 no software de pletimografia barométrica. Clique em Unidade Alta em C3 e digite 5. Mude high cal para 3 s e aperte Measure.
  7. Defina a baixa porcentagem de O2. Clique em Unidade Baixa na opção C2 e digite 10. Clique em Low Cal, entrada 3 s e clique em Medir.
  8. Alterar os valores do gás na mistura de gás de volta para 20,93% O2 e 79,07% N2. Aguarde vários minutos para que a câmara se ajuste a esses valores. Repita as etapas 3.1\u20123.7 se os analisadores metabólicos não lerem automaticamente 20,93% O2 e 0% CO2,para garantir a calibração adequada. Confirme rotineiramente a calibração adequada com tanques de gás certificados.
  9. Verifique novamente os medidores de fluxo conectados à câmara de pletimografia barométrica. Ajuste o fluxo de ar para dentro e para fora da câmara para taxas apropriadas para o experimento (tipicamente, 0,1-0,3 L/min).
  10. Uma vez que todas as configurações tenham sido aplicadas ao software de pletimografia barométrica, clique em OK para começar a gravar.

4. Plethysmografia barométrica desenfreada

  1. Registre o peso do rato e a temperatura inicial do corpo. Aguarde 10 min antes de colocar o mouse na câmara, para coletar os dados de O2 e CO2 de uma câmara vazia. Trabalhe em uma área tranquila familiar aos ratos para que o barulho e os cheiros não interfiram na coleta de dados. Evite possíveis interrupções, incluindo a abertura e o fechamento de portas ou pessoal que entra/sai da sala de coleta de dados.
    NOTA: Este protocolo específico utilizou um rato C57BL/6J masculino de 22 meses.
  2. Durante a primeira hora, documente os comportamentos do mouse e faça anotações detalhadas, incluindo valores específicos do fluxo de entrada/saída da câmara.
  3. Após 60 min de habituação de câmara, observe os segmentos de respiração silenciosa para os 60 min. Liste quaisquer segmentos com duração mínima de 15 s s sem cheirar e preparar. Tome medidas de temperatura corporal a cada 10 min ao usar um dispositivo implantável.
  4. No final do experimento, remova o rato da câmara e coloque-o de volta em sua gaiola. Todos os equipamentos devem ser limpos e completamente limpos. Se as gotículas de água permanecerem, use ar pressurizado para removê-las.

5. Análise do Padrão de Respiração e Metabolismo

  1. Abra o arquivo de revisão da pletimografia barométrica e consulte as notas registradas para o animal de interesse.
  2. Abra o painel metabólico no software e pegue a média dos primeiros 10 min de O2 e CO2,quando a câmara estava vazia. Registre esses valores como o FiO2 e fico2.
  3. Exibir o painel Fluxo do software de pletimografia barométrica. Clique com o botão direito do mouse Analisar atributos e defina parâmetros apropriados. Na guia Meta 1, insira o FiO2 e o FiCO2 a partir da etapa 5.2, bem como o fluxo para a câmara em Meta 2, para calcular VO2 e VCO2.
  4. Para análise padrão de respiração, confirme os tempos para os 15 segundos de respiração silenciosa usando notas sobre o comportamento animal, bem como o rastreamento do painel de fluxo. Digite os horários para os intervalos de 15 s de respiração silenciosa em Diálogo de Analisador de Dados Abertos na guia Data Parser. Clique em Modo de exibição de parser para mostrar apenas os segmentos de interesse específicos de 15 s.
  5. Clique em Salvar dados derivados analisados. Abra o arquivo de dados em uma planilha para obter os dados binados.

6. Análise de Apnéias e Respirações Aumentadas

  1. No arquivo de revisão aberto, saia do modo de exibição do analisador. Vá para a opção Configuração de gráficos em Configuração de Configuração > Configuração P3 e selecione Exibição de página em Tipo. Selecione 5 para o número de painéis. Digite -2 na caixa rotulada low e 2 na caixa rotulada Alta para medidas de fluxo em mililitros/segundo. Aplique as mudanças.
  2. Role até a marca de 30 minutos no painel de traçados de fluxo.
  3. Conte apnéias e respirações aumentadas para os 30-60 min depois que o rato foi colocado na câmara. Quantifique períodos de respiração suspensa com duração maior ou igual a 0,5 s, indicativo de apnéia. As respirações aumentadas são indicadas por um aumento acentuado no traço respiratório acima de 1,25 mL/s seguido de uma diminuição acentuada abaixo de -0,75 mL/s.

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Resultados

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São relatados os resultados da UBP como avaliação do padrão de respiração em camundongos de 16 anos (22 meses de idade) realizados sob gás ar normal (20,93% O2 com N2equilibrado ). A análise incluiu primeiro uma comparação de um segmento de respiração mais longo de 10 minutos (que levou mais de 2h para obter) em comparação com a média de quatro segmentos curtos de 15 s (quantificados em minutos 60-120). Um traçado representativo de respiração silenciosa, onde a respiração é consistente com nenhum co...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O protocolo fornece informações sobre uma linha de base respiratória tranquila em camundongos, bem como a coleta de dados sobre apnéias centrais e respirações aumentadas. Os resultados representativos mostram que uma linha de base silenciosa de 10 minutos tem um padrão de respiração semelhante quando comparada a uma média de quatro ataques de 15 s para uma coorte de camundongos antigos. É importante ressaltar que os 15 ataques não são estatisticamente diferentes, nem esses grupos têm diferenças de variação entre si usand...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer Angela Le, Sarah Ruby e Marisa Mickey por seu trabalho mantendo as colônias de animais. Este trabalho foi financiado por 1R15 HD076379 (L.R.D.), 3R15 HD076379 (L.R.D. para apoiar a CNR), e pela McDevitt Undergraduate Research Fellowship in Natural Sciences (BEE).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Analisador de Dióxido de CarbonoAEI TechnologiesCD-3A 
Sensor de Dióxido de CarbonoAEI Technologies  P-61B
O computadordeve estar em conformidade com os requisitos da Ponemah
Contas de DrieritePermaPure LLCDM-AR
Controle de FluxoAEI TechnologiesR-1vacuum
FlowmeterTSI4100precisa de um por câmara e um para vácuo
Misturador de GásMCQ InstrumentsGB-103
Gas TanquesHaun100% oxigênio, 100% dióxido de carbono, 100% nitrogênio - grau alimentício, ou tanques pré-misturados para desafios normais de ar e gás
ambiente Analisadorde Oxigênio AEI TechnologiesS-3A
Sensor de OxigênioAEI Technologies  Tubulação de poliuretano N-22M
SMCTUS 0604 Y-20
Ponemah SoftwareDSI
Buxco/DSIcâmara de roedores
(sistema LifeChip)Destron-Temerqualquer tipo de termômetro para medir temperaturas corporais precisas é apropriado, mas o uso de chips implantáveis permite uma perturbação mínima para o animal tomar várias medições de temperatura corporal enquanto o animal ainda está na câmara UBP;
TransdutoresValidyneDP45precisam de um por câmara 
Sistema de Pletismografia de Corpo Inteiro Data Science International (DSI)Inclui ACQ-7700, sondas de pressão/temperatura, etc. 
Pequeno Termômetro de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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